Riassunto Genomica umana

Genomica

1) INTRODUZIONE

Geni → unità fondamentali studiate in biologia, sono segmenti di DNA che producono prodotti funzionali, normalmente delle proteine. Di tali segmenti (e quindi dell'intero genoma, seppur stabile) esistono delle varianti (=mutazioni), che possono andare ad alterare il fenotipo. Solo con Mendel si riuscì a dare un'interpretazione dell'ereditarietà genetica: le caratteristiche genetiche vengono ereditate dai genitori come unità discrete (immutabili).

Per l'analisi genetica si possono utilizzare due approcci: reverse genetics (gene → mutanti del gene → ne studio la funzione osservando le alterazioni fenotipiche) e forward genetics (fenotipo alterato → isolo tali mutanti → identifico il gene e anche la funzione). L'analisi genetica viene effettuata su organismi modello (ciclo digene responsabile), studiandone sull'uomo la situazione diventa più complessa (levita breve, grandi progenie, ecc.).

molecolarebiologia molecolare (DNA → RNA → proteine), vengono sviluppate nuove tecniche per amplificare (PCR e DNAsequencing → tecnica meno costosa e più rapida delricombinante), ibridare e sequenziare il DNA (next generationmetodo di Sanger, Moore’s law per spiegare graficamente il rapporto tra aumento della capacità di immagazzinare datigenomi si è notato che c’èinformatici e riduzione del costo di sequenziamento di un genoma). Confrontando i diversialmeno l’1% di varianti, e quindi differenze, tra un individuo e l’altro. Tra queste varianti, buona parte sono varianticomuni che non hanno un effetto sul fenotipo finali (varianti casuali). Ci sono però anche delle varianti, più rare nellapopolazione (per via della selezione negativa), che possono determinare l’insorgenza di patologie anche gravi. Tuttecome “HapMap”, “gnomAD” e “Aqueste varianti si è cercato di

identificarle e caratterizzarle in diversi progetti genomici". Nel nostro genoma, dei 3 miliardi di nt, ci sono soltanto 20 mila geni codificanti per prodotti funzionali. Queste porzioni geniche sono ovviamente molto conservate a livello evolutivo, così come le sequenze regolatorie non codificanti (regioni dei promotori, enhancer, silencer). Per identificare quali siano le varianti più comuni associate a malattie e quali quelle casuali si realizzano degli studi genome wide per associazione (GWAS) → vengono effettuati screening a tappeto di tutto il genoma di un gruppo di casi e di uno di controlli e si vanno ad identificare così quali siano le varianti più comuni nei soggetti affetti da una malattia piuttosto che nei controlli sani. La genomica è importante anche nell'ambito sanitario, si parla di medicina genomica → per diagnostica (faccio una diagnosi sulla base delle conoscenze genetiche piuttosto che sulla base della

La medicina ha diverse applicazioni nella genomica, come ad esempio nello studio dei genomi delle cellule tumorali per comprendere le funzioni del cancro. Inoltre, la medicina genomica permette di personalizzare le cure, prevedendo se saranno efficaci o meno. La diagnosi di malattie genetiche rare e lo screening prenatale non invasivo sono altri ambiti in cui la medicina genomica trova applicazione.

Per amplificare il DNA, si possono utilizzare diversi metodi. Uno di questi è il DNA ricombinante, che prevede l'utilizzo di un plasmide a sequenza nota, come quello di E. coli. Si isola una porzione di DNA da amplificare, che viene tagliata con lo stesso enzima di restrizione utilizzato nel plasmide. I frammenti ottenuti vengono inseriti nel plasmide batterico e saldati con la DNA ligasi. Il plasmide viene poi reinserito nel batterio, che si replica, permettendo così l'amplificazione del DNA.

I plasmidi sono molecole di DNA circolari presenti in batteri e altri organismi. Sono utilizzati come vettori per clonare e amplificare il DNA.

circolari che si replicano autonomamente rispetto al cromosoma batterico. Hannoun'origine di replicazione, vi posso inserire un marcatore di selezione (per esempio la resistenza agli antibiotici→ in questo modo, mettendo la popolazione batterica in un terreno con antibiotico, sopravviveranno soltanto ibatteri ricombinanti portatori del marcatore). A differenza dei plasmidi (possono contenere segmenti nontroppo lunghi, 5-10 kbp), i vettori di clonaggio poteva contenere sequenze di diversa lunghezza: vettore BAC(200-300 kbp) e vettore YAC (qualche Mbp). Si vanno poi a costituire delle library genomiche con tutti questisegmenti che vengono replicati.• → a differenza del DNA ricombinante,PCR questa amplificazione avviene in vitro. Devo conoscere lasequenza che vado a replicare perché per effettuare l'amplificazione ho bisogno di primers complementari alle1Biologia della Salute, unibo FMsequenze fiancheggianti la sequenza target. Per far avvenire la

reazione di PCR ho bisogno di nt, della Taqpolimerasi termoresistente. Ogni ciclo di PCR consiste nella denaturazione del dsDNA ad alte temperature,consiste poi in un riabbassamento della temperatura al fine di permettere l'annealing tra ssDNA e primerspresenti in soluzione, segue infine un aumento (di nuovo) della temperatura in modo che la taq polimerasipossa svolgere il suo lavoro, incorporando i nt presenti in soluzione. Ad ogni ciclo di PCR i filamenti presentiin soluzione vengono raddoppiati, questo è un meccanismo veloce ma non quantitativo (va a plateau, si arrivasempre allo stesso massimo a causa dell'usura della Taq polimerasi, del fatto che i primers e i nt finiscano).

• → è una PCR che ci permette in tempo reale di monitorare l'andamento della reazione;PCR real time cipermette di effettuare una stima quantitativa della quantità di DNA che era presente all'inizio (perchéovviamente anche in questo caso si va a

plateau); in presenza di sonde fluorescenti posso anche visualizzare il prodotto genico. Il grafico della real time PCR vede una prima fase di latenza e una seconda fase esponenziale che tende ad un plateau. Identificando il ciclo-soglia, ovvero il primo ciclo in cui la crescita comincia ad essere esponenziale (che sarà tanto più precoce quanto più DNA avevo in partenza nel campione), posso fare una stima della quantità di DNA di partenza che avevo. SYBR Green → sonda che diventa fluorescente quando viene incorporata da un dsDNA (anche se incorporata in un dsDNA errato lei da fluorescenza comunque quindi si rischia di avere un segnale errato); si comincia a vedere il segnale, che andrà intensificandosi con il proseguimento dell'amplificazione, dopo 30-40 cicli. Metodo TAQMAN → le sonde sono marcate con un fluoroforo che se libero da un segnale fluorescente e con un Quencher che, finché associato al fluoroforo, fa sì che questo non dia

alcuna emissione di segnale. La sonda è complementare al DNA che stiamo amplificando, quando dal primer la polimerasi comincia a replicare il DNA, mano a mano che avanza la sonda viene staccata, liberando il fluoroforo dall'inibizione del quencher → si ha la produzione di un segnale fluorescente molto specifico.

TECNICHE DI IBRIDAZIONE (usate solo per evidenziare sequenze di nostro interesse). A seconda di quanto imponiamo stringenti le condizioni di ibridazione (temperatura, concentrazione salina) possiamo regolare il livello di match: condizioni di elevata stringenza (alte T, basse [saline]) → l'ibridazione avviene con match perfetti, elevata complementarietà delle sequenze che si appaiano). Tre tecniche:

• Southern Blot
• FISH → questa tecnica di ibridazione si utilizza direttamente "in situ" anche su interi cromosomi: denaturo il DNA in modo da staccare le proteine e renderlo accessibile e con queste sonde fluorescenti possono

• Microarray → ho dei chip con una griglia e all’interno di ciascun “buco” c’è una sequenza nota (per esempio corrispondenti anche a tutti i 20 mila geni umani, il microarray è infatti usato per effettuare più ibridazioni contemporaneamente), aggiungo la mia sonda di interesse marcata con fluoroforo e vado a vedere dove è andata ad ibridarsi.
• TECNICHE DI SEQUENZIAMENTO:
• Metodo di Sanger → Utilizzo dei nt normali e dei dideossinucleotidi al 3’ (necessario che mancano del -OH per allungare la catena in formazione → funzionano dunque da terminatori). Il sequenziamento si basa sul fatto che la polimerasi quando allunga la sequenza di DNA stampo (che è stato denaturato a ssDNA) potrà incorporare un nt normale oppure un terminatore che blocca la sintesi. I terminatori sono marcati con una sonda fluorescente, ciascuno di colore.

• sequencing → Massively-parallel frammento il DNA, attacco degli adattatori, tramite PCR li amplifico, attacco i frammenti su una superficie ed effetto il sequenziamento in parallelo di tutti i frammenti ottenuti.

In entrambi i metodi il tutto comincia con la frammentazione del DNA e la creazione di una library. A questi frammenti di 50-300 nt aggiungo degli adattatori che si andranno a legare ad entrambe le estremità.