Riassunto esame Microbiologia Generale, prof Corsetti, libro consigliato Biologia microorganismi, Brock (Seconda parte)

Nutrizione e coltura dei microorganismi

Metabolismo cellulare

Prima che possa replicarsi, una cellula deve coordinare molte reazioni chimiche differenti e organizzare diverse molecole in strutture specifiche. Nel complesso, l’insieme di queste reazioni è denominato metabolismo. Le reazioni metaboliche possono essere cataboliche (liberazione di energia) o anaboliche (richiesta di energia). Il catabolismo demolisce le molecole liberando energia durante il processo, mentre l’anabolismo usa l’energia per costruire molecole più grandi a partire da molecole più piccole.

Classificazione degli organismi

Gli organismi possono dividersi sia in base a come ricavano energia, sia in base a come ricavano carbonio. Il carbonio è il costituente principale delle cellule. In funzione di energia, gli organismi si dividono in:

• Fototrofi: assomigliano alle piante e utilizzano come fonte di energia la luce.
• Chemiotrofi: utilizzano come fonte di energia sostanze chimiche organiche o inorganiche.

In funzione di carbonio, si dividono in:

• Autotrofi: utilizzano come fonte di carbonio (CO₂ = inorganico).
• Eterotrofi: utilizzano come fonte di carbonio composti organici.

Classificazione dei microorganismi

Classificazione dei microorganismi in funzione delle fonti di carbonio e di energia:

• Fotoautotrof: Fonte di energia (luce), fonte di carbonio (CO₂). Esempio: Alghe verdi-blu e batteri fotosintetici.
• Fotoeterotrof: Fonte di energia (luce), fonte di carbonio (composti organici). Esempio: Batteri rossi non sulfurei, fotosintetici.
• Chemioautotrof: Fonte di energia (composti inorganici), fonte di carbonio (CO₂). Esempio: Solfo-ferro-, ammonio-batteri; numerosi tipi di batteri metano-produttori.
• Chemioeterotrof: Fonte di energia (composti organici), fonte di carbonio (composti organici). Esempio: Protozoi, funghi, tutti i batteri di interesse medico. I chemioeterotrofi usano di solito gli stessi composti per ottenere sia carbonio che energia.

Macronutrienti e micronutrienti

La nutrizione è quella parte di fisiologia dei microorganismi che si occupa dei nutrienti richiesti per la crescita. Organismi diversi hanno bisogno di nutrienti diversi e in diverse quantità. I macronutrienti sono richiesti in grande quantità, mentre altri, chiamati micronutrienti, sono richiesti in quantità molto inferiori, anche solo in tracce. Tutti i nutrienti sono composti costituiti a partire da elementi chimici.

Composizione elementare della cellula microbica

• Carbonio: 50% (peso secco)
• Ossigeno: 20%
• Azoto: 14%
• Idrogeno: 8%
• Fosforo: 3%
• Zolfo: 1%
• Potassio: 1%
• Sodio: 1%
• Calcio: 0,5%
• Magnesio: 0,5%
• Cloro: 0,5%
• Ferro: 0,2%

Macronutrienti principali e secondari

I terreni di coltura sono realizzati in maniera tale da fornire il materiale necessario alla cellula (insieme dei nutrienti che tengono conto degli elementi e delle proporzioni di cui la cellula è costituita). Ogni litro di terreno di coltura deve contenere i macronutrienti in concentrazione di g/l.

• Carbonio: costituente dei materiali organici della cellula (50%).
• Ossigeno: costituente dell’acqua cellulare e di materiale organico della cellula, accettore di elettroni nella respirazione aerobia. Senza ossigeno la cellula non può respirare. È un accettore esterno terminale di elettroni.
• Azoto: costituente di proteine, acidi nucleici e coenzimi. La maggior parte dell’azoto disponibile in natura è nella forma inorganica di ammoniaca (NH₃), nitrato (NO₃^-). L’N può essere utilizzato solo dai procarioti azoto-fissatori.
• Idrogeno: costituente dell’acqua cellulare e del materiale organico della cellula.
• Fosforo: costituente di acidi nucleici, fosfolipidi, coenzimi, ATP.
• Zolfo: costituenti di proteine (amminoacidi cisteina e metionina) e coenzimi (CoA o cocarbossilasi).

I macronutrienti secondari sono contenuti in piccole quantità. Nei terreni di coltura vengono forniti nell’ordine di mg/l. La cellula utilizza i componenti per molte reazioni enzimatiche per produrre energia. I macronutrienti secondari sono dei cofattori per gli enzimi.

• Potassio: uno dei principali cationi inorganici della cellula, cofattore per alcuni enzimi.
• Sodio: regolazione pressione osmotica, sistemi di trasporto.
• Calcio: importante catione cellulare, cofattore per alcuni enzimi (es. proteasi).
• Magnesio: importante catione cellulare, cofattore inorganico per molte reazioni enzimatiche: funzioni nel legare gli enzimi ai substrati e costituente delle clorofille. Stabilizza i ribosomi, le membrane e gli acidi nucleici.
• Ferro: componente chiave dei citocromi (che servono per formare la forza proton-motrice) e delle proteine ferro-zolfo e (proteine eme e non eme) coinvolte nelle reazioni di trasporto di elettroni, esso svolge un ruolo importante nella respirazione cellulare. In condizioni anossiche, il ferro si trova sotto forma di ione ferroso (Fe²⁺) solubile. In condizioni ossiche il ferro si trova sotto forma di ione ferrico (Fe³⁺) come costituente di minerali insolubili. Esistono alcuni microorganismi che hanno elevato strutture per catturare il ferro: siderofori che svolgono la funzione di legare Fe³⁺ dall’ambiente e trasportarlo nella cellula rendendolo solubile. Dunque le cellule rilasciano delle molecole che catturano il Fe³⁺ e lo trasportano nel citoplasma dove vi è un ambiente riducente (poco O₂), il Fe³⁺ viene ridotto a Fe²⁺ che può essere usato dalla cellula.

I micronutrienti

I micronutrienti sono dei minerali importanti per la costruzione di vitamine. Devono essere presenti nell’ordine di μg/l. Spesso non si trovano nelle ricette del terreno perché vengono inseriti semplicemente aggiungendo acqua.

• Cobalto: costituente della vitamina B12 e dei coenzimi da essa derivati.
• Copper, zinc, nickel, manganese, molybdenum, vanadium, selenium: costituenti inorganici di particolari enzimi.

Fattori di crescita

Sono composti organici richiesti in piccole quantità (micronutrienti) e comprendono:

• Vitamine (B1, B6, B12)
• Basi azotate (purine e pirimidine)
• Amminoacidi (essenziali e stimolanti)

Molte di queste sostanze sono essenziali per microorganismi auxotrofi. Gli auxotrofi hanno perso la capacità di sintetizzare nutrienti essenziali rispetto al ceppo originale.

I terreni di coltura

Insieme di sostanze nutritive che permettono la crescita in vitro di una o più specie microbiche. I terreni di coltura sono una base nutrizionale per coltivare e numerare i microorganismi. Sono soluzioni di nutrienti usati per far crescere i batteri in laboratorio. In genere sono delle sospensioni. La maggior parte dei microorganismi non sono coltivabili (più del 90%) ma sappiamo che esistono perché si possono estrarre dei frammenti di DNA dagli ambienti in cui si trovano.

I microorganismi che crescono sulla superficie o all’interno di un terreno colturale sono denominati colture (nei terreni liquidi formano brodocolture). La coltivazione dei batteri è possibile soltanto se si utilizzano terreni colturali adeguati. La scelta del terreno dipende dai fabbisogni nutritivi della specie da coltivare e dagli obiettivi (isolamento, arricchimento, identificazione).

Le colonie batteriche

I batteri, seminati in un terreno solido agarizzato e incubati in termostato, si riproducono formando ammassi rotondeggianti eventualmente pigmentati detti colonie. Ogni colonia origina da una singola cellula batterica e diventano visibili dopo almeno 18-24 h di incubazione quando si raggiunge una concentrazione di almeno 10⁶ cellule. Le caratteristiche delle colonie (dimensione, colore, forma, consistenza, odore) sono un parametro fondamentale per l’identificazione e la classificazione dei batteri. In funzione del tipo di microorganismo abbiamo diverse forme e dimensioni. L’osservazione delle colonie diventa un valore tassonomico.

Ingredienti dei terreni colturali

• Fonti di azoto: proteine, peptidi, amminoacidi, N inorganico.
• Sostanze energetiche (fonti di carbonio): glucidi.
• Metalli e minerali essenziali: Ca, Mg, Fe, P, S, metalli in tracce ecc.

Un terreno di coltura non è fatto solo di nutrienti, ci sono sicuramente sempre:

• Tamponi utilizzati per mantenere più facilmente l’omeostasi del pH citoplasmatico (fosfati, acetati, ecc.).
• Agenti selettivi (agenti antimicrobici come l’acitidione che non permette la crescita dei lieviti ma solo dei batteri), antibiotici.
• Indicatori di variazione di pH: si osservano i viraggi di colore nella provetta, se cambia colore vuol dire che il microorganismo utilizza il nutriente (rosso fenolo, porpora di bromo cresolo).
• Gelifcanti: Agar che rende il terreno solidificabile. NB: l’Agar non è mai un nutriente, serve per rendere solido un terreno di coltura liquido. In laboratorio in genere si usa l’agar tecnico (il meno puro).

Proprietà dell’Agar

• Agente solidificante.
• Inerte ed atossico per i batteri.
• A concentrazioni 1,5-2 % la superficie è sufficientemente umida per la crescita microbica ma abbastanza asciutta per mantenere le colonie separate.
• La sua struttura gel ostacola il movimento dei batteri ma consente la diffusione delle sostanze nutritive.

Quando il terreno di coltura necessita di sostanze termolabili, solidifica a 38º e fonde a 84º-90º. Il terreno diventa fuso e può essere trasferito in piastre Petri, l’alternativa è la piastra per inclusione (prima si mette il terreno con i microorganismi e poi si versa quello agarizzato). NB: Parlare di terreni solidi vuol dire parlare di terreni che venivano utilizzati dai primi microbiologi (Patata). Tra i terreni solidificabili e i semisolidi, la differenza sta nelle quantità di agar aggiunto. Un terreno con troppo agar modifica l’activity water.

Preparazione dei terreni colturali

• Preparazione della miscela (ricostituzione dei terreni disidratati).
• Aggiustamento del pH.
• Sterilizzazione in autoclave (121º a 1 atm per 15-20 min.).
• Eventuale aggiunta di ingredienti termolabili.

Classificazione di terreni colturali

Da un punto di vista fisico:

• Liquidi (es. brodi),
• Solidi (o solidificabili, es. terreni agarizzati con 1-2% agar),
• Semi-solidi (es. terreni agarizzati con 0,3-0,5% agar).

In base alla composizione chimica:

• Empirici,
• Sintetici (o chimicamente definiti),
• Complessi (o semisintetici o indefiniti).

In base alla funzione:

• Isolamento,
• Mantenimento,
• Arricchimento,
• Selettivi,
• Differenziali.

Terreni empirici

Sono generalmente costituiti da miscele nutritive naturali, la cui composizione non è né costante né riproducibile. Possono essere sufficientemente ricchi e completi da consentire la crescita di molte specie microbiche. Sono stati i primi terreni colturali utilizzati. Esempio: brodo nutritivo, estratto di carne, estratto di lievito. Viene detto empirico perché gli elementi non possono essere quantificati.

Terreni sintetici

Sono costituiti da miscele di sostanze chimicamente note, la cui composizione è costante e riproducibile. Si conoscono precisamente gli elementi che lo compongono. Il sintetico non si utilizza per isolare per capire le caratteristiche nutritive. Possono avere una composizione semplice oppure numerosi ingredienti a seconda delle esigenze nutritive dei microorganismi che devono essere coltivati. Sono usati soprattutto per la coltivazione di autotrofi e nella ricerca ma non nella routine (vi sono condizioni sperimentali definite e riproducibili). Esempi: BG-11 per cianobatteri, Cary-Blair Medium (terreno di trasporto per anaerobi e Gram -).

Terreni complessi

La maggior parte dei terreni utilizzati sono i terreni complessi (dei quali non si conosce l’esatta quantità degli elementi). Sono costituiti da terreni sintetici, addizionati con ingredienti la cui composizione chimica non è esattamente conosciuta e costante. Esempio: brodo triptone soia (TSB), Agar MacConkey. Possono essere liquidi, agarizzati o in particolari casi solidificati con agenti diversi dall’agar (es. silicati).

Si classificano anche in base alla funzione:

• Arricchimento (Arricchisce una popolazione rispetto ad un’altra).
• Isolamento e mantenimento (per conservare i microorganismi), spesso il microorganismo ha diverse esigenze per crescere rispetto a quando viene isolato.
• Selettivi (va a svantaggio di alcune popolazioni differenziali e sfrutta le caratteristiche biochimiche dei microorganismi), la colonia acquisisce delle colorazioni particolari in funzione delle reazioni chimiche di una particolare popolazione, quindi dall’aspetto della colonia è possibile risalire alla specie.

Brodo nutritivo

I fattori di sviluppo sono sostanze organiche come amminoacidi. La maggior parte degli ingredienti non sono dosati (es. vitamine e amminoacidi). Contiene:

• 3g/l di estratto di carne che porta vitamine, sali, proteine e carboidrati.
• Peptone (idrolizzato di carne, caseina, gelatina) è fondamentale ed è una fonte di azoto organico.
• Sale.
• pH 7.

Plate Count Agar Standard

• Estratto di lievito (si ottiene facendo bollire il lievito in un panetto).
• Destrosio.
• Agar.
• Digerito pancreatico di caseina.

È il terreno più usato.

Ingredienti dei terreni complessi

In un terreno complesso gli ingredienti fondamentali sono:

• Peptoni: idrolizzati proteici ottenuti mediante digestione proteolitica parziale da carne, caseina, soia, gelatina o da altra fonte proteica (fonte di vitamina del gruppo B). Sono in quantità nota.
• Estratto di carne: estratto acquoso di carne bovina magra, ricco di amminoacidi, peptidi, nucleotidi, vitamine, minerali.
• Estratto di lievito: estratto acquoso di lievito di birra, contenente fonti di carbonio e di azoto e ricco di vitamine del gruppo B.

La maggior parte dei batteri eterotrofi e dei miceti è coltivata su terreni complessi. Tali terreni si usano anche quando le esigenze nutritive sono sconosciute, oppure per batteri esigenti che possono anche richiedere terreni fortificati con sangue o siero (terreni di arricchimento).

Terreni di arricchimento

Favoriscono la crescita di alcune specie microbiche e quindi “arricchiscono” la coltura con poche specie di microorganismi. Esempio: sono in genere terreni liquidi (es. brodo, selenite) usato per isolare Salmonella e Shigella da campioni di feci che normalmente contengono cariche elevate di numerose specie microbiche.

Esempi di terreni arricchiti per batteri esigenti:

• Agar sangue (BAP): composto da una base nutritiva (TSA) +5% sangue ovino (o equino, umano, di coniglio), molto usato in batteriologia clinica per la coltivazione di differenti microorganismi.
• Agar cioccolato (CHOOC): ottenuto modificando il terreno BAP cioè riscaldando globuli rossi di ovino (liberando nutrienti) oppure aggiungendo particolari nutrienti, utilizzato per coltivare batteri esigenti come Neisseria gonorrhoeae.

Sono detti anche elettivi perché pur non contenendo inibitori, la loro composizione favorisce la crescita di determinati gruppi microbici (M17 è un terreno elettivo per gli streptococchi lattici). Quindi permettono una crescita migliore per la popolazione che sfrutta di più l’ingrediente aggiunto.

Terreni di isolamento e mantenimento

I terreni di isolamento vengono utilizzati per isolare i microorganismi da campioni (es. prodotti alimentari, superfici e materiale patologico). Per isolare i microorganismi è necessario creare dei terreni appositi che rispettano il più possibile l’habitat normale dell’organismo. Una volta che il microorganismo è stato ottenuto non è necessario coltivarlo ancora in quel terreno.

Esempio di terreni di isolamento: agar verde brillante (BGA) usato per l’isolamento di Salmonella da campioni alimentari (è un terreno di isolamento ma anche selettivo). Il terreno di mantenimento è usato per conservare in laboratorio le colture pure.

Esempi di terreni di mantenimento: brodo triptone soia (TSB), Agar triptone soia (TSA). Alcuni distinguono i terreni di isolamento da quelli di mantenimento, perché normalmente le esigenze di un microorganismo sono maggiori al momento dell’isolamento piuttosto che nel mantenimento quando si è già adattato al terreno colturale.

Terreni selettivi

I terreni selettivi favoriscono la crescita di particolari specie microbiche e inibiscono la crescita di altri microorganismi mediante sostante antimicrobiche presenti nella composizione (es. sali biliari o coloranti). Servono per la crescita di microorganismi a svantaggio di altri. A differenza dei terreni elettivi, contengono antimicrobici.

Esempi: sono in genere terreni solidi:

• Sali biliari o fucsina basica o cristalvioletto inibiscono i Gram + (Agar cristalvioletto per Gram -; agar MacConkey per Escherichia coli).
• Mannitol salt agar (MSA): l’alta % di NaCl consente la crescita soltanto agli stafilococchi (alotolleranti).
• Terreno di Sabourdand: l’alta% di zuccheri ed il pH acido (5,6) inibiscono la crescita dei batteri e consentono quella dei lieviti e muffe.
• Agar PPLO: contiene acetato di tallio e penicillina ed impedisce la crescita di quasi tutti i batteri tranne i micoplasmi privi di parete.
• Agar lisina: contiene una base minerale, glucosio e fattori di crescita e lisina. Non permette lo sviluppo di lieviti del genere Saccaromyces che sono incapaci di assimilare la lisina come unica fonte di azoto. È utile per l’isolamento e la rilevazione di lieviti non-Saccaromyces dai mosti d’uva.