Riassunto esame Biochimica di proteine e sistemi, Prof. F. Polticelli, libro consigliato Introduzione alla struttura delle proteine, Zanichelli

CANALI DEL POTASSIO REGOLATI

DAL VOLTAGGIO:

Per darvi un’idea di quanto sono

efficienti questi sistemi, nel grafico è

stata messa la risposta ad una

differenzia di potenziale del canale

del K regolato dal voltaggio e di un

Transistor (componente elttronico

creato per risondere a variazini di

potenziale). Vedete che il canale del

K per passare dalla conformazione totalmente chiusa (0 conduttanza) a quella aperta basta una

differenza di potenziale di 25mV contro i 150mV del transistor.

Visto a grandi linee, in questo caso il meccanismo di apertura e chiusura è determinato dal fatto che ho

dei domini aggiuntivi che contengono un gran numero di cariche positive e che quindi se all’interno

della cellula io ho una densità di carica positiva più alta tendono ad essere respinti, e siccome questi

domini aggiuntivi sono collegati alle eliche interne, quando vengono respinti spezzano le eliche interne

provacano l’apertura del canale. In pratica le porzione aggiuntiva è un sensore di carica positiva che si

sposta in funzione dell’aumento della carica positiva all’intenro della cellula.

Le strutture che vede in verde sono le frazioni di anticorpo che sono

state utilizzate per cristallizzare la proteina perché ricordiamoci

che queste sono proteine di membrana e la parte esterna delle

proteine di membrana è altamente idrofobica perché a contatto con

le code dei fosfolipidi e quindi queste proteine tendono ad

attaccarsi le une alle altre in maniera non ordinata; invece per poter

avere una mappa di densità elettronica devo avere un cristallo, cioè

le proteine devono essere orientate in maniera ordinata.

Uno degli escamotage che si utilizzano per cristallizzare le proteine

di membrana è rivestirle di proteine polari > quindi in questo caso

il frammento di anticorpo è diretto proprio verso il sensore di

voltaggio . In questo caso c’è stata un po’ di fortuna perché

l’anticorpo si lega sul sensore del voltaggio ma nello stesso tempo scherma le porzioni idrofobiche della

struttura del canale e quindi si riesce ad ottenere i cristalli di questa struttura proteica.

Tra i domini aggiuntivi c’è quello che viene chiamato REMO che ha tutti residui carichi positivamente di

arginina e questo rappresenta il sendore del voltaggio(repulsione verso le cariche positive nella cellula

dovute al potenziale). Perché residui di arginina? Perché sono quelli che hanno Pk più alto e quindi

tendono più difficilemente a deprotonarsi, cioè mantengono la loro carica anche in condizioni

“estreme”, come sono quelle in cui questi residui di arginina devono doventare parzialmente

inaccessibili al solvente, perché se questo remo si sposta verso l’alto è parzialmente immerso nella

membrana, quindi io ho questi residui carichi che devono andare a finire dentro la membrana, quindi

più hanno un Pk alto e più è facile che funzionino bene come sensori, perché non perdono la loro carica.

La cosa più dibattuta ad oggi su questi canali, è che è stato visto che utilizzando gli anticorpi di cui

parlavamo prima si può studiare il canale in un sistema sintetico in vescicole invece che in cellule e in

vescicole io posso modulare la conc di ioni all’interno in modo tale da far aprire e chiudere il canale.

Quello che è stato osservato è che se veniva aumentata la conc. di ioni positivi all’interno delle vescicole,

il canale si apriva e se poi si aggiungeva l’anticorpo dall’esterno il canale restava aperto anche se la

conc. di ioni carichi positivamente all’interno scendeva. Questo è spigabile solamente con uno schema di

questo tipo in cui l’anticorpo riconosce il remo/sensore del voltaggio perché il remo è addirittura

arrivato fuori dalla membrana.

Un altro modo invece per vedere qual è la posizione del remo quando il canale è chiuso, è di utilizzare

quelli che vengono chiamati “righelli molecolari”, cioè posso utilizzare delle molecole lineari che legano

per esempio i residui di cisteina. Per fare questo hanno mutato i residui uno ad uno di questo remo in

cisteina e poi un po’ come hanno fatto con l’anticorpo, hanno aggiunto dall’esterno biotina che si lega

covalentemente ai residui di cisteina. La biotina ha una certa lunghezza, non può arrivare più giù di

tanto se io dall’altra parte la lego con la streptaividina( non si può portare dietro anche la

streptoavidina). Allora se prendo il remo ed uno ad uno muto tutti i residui di cisteina posso vedere in

quali casi la biotina riesce a legarsi e in quali casi non riesce a legarsi, quindi riesco in qualche modo a

misurare la distanza di ciascuno di quei residui dalla superficie esterna della membrana. In questo

modo è stata ipotizzata una posizione del remo di questo tipo quando il canale è chiuso, con i residui di

arginina che sono parzialmente esposti al solvente intracellulari.

Quindi si è potuto verificare che quando il canale è chiuso il remo è orientato verso la parte

intracellulare con i residui di arginina quasi a contatto con l’acqua e quando invece il canale è aperto

questo remo deve necessariamente muoversi di circa 20 Å all’interno della membrana e addirittura la

punta del remo diventa accessibile ad un anticorpo aggiunto dall’esterno.

LEZIONE 8 : IL CANALE DELL’ACQUA

Proteine che mediano il trasporto passivo di molecole d’acqua attraverso la membrana.

L’esistenza di proteine che fossero in grado di trasportare molecole d’acqua attraverso la membrana è

stata ipotizzata fin dagli anni ’50. Molecole d’acqua possono anche passare la membrana ma molto

lentamente perché è un processo altamente sfavorito da un punto di vista energetico, se la differenza di

concentrazione di molecole d’acqua è molto alta a cavallo della membrana questo rappresenta una

spinta al trasporto di molecole d’acqua ma c’è sempre da superare una barriera energetica molto alta

che è quella della “solubilizzazione” delle molecole di acqua all’interno della regione idrofobica del

doppio strato fosfolipidico.

La scoperta di queste proteine è stata abbastanza casuale > studiando proteine di membrana dei globuli

rossi per tipizzare i gruppi sanguigni è stato visto che c’era una proteina abbastanza abbondante sulla

membrana degli eritrociti e come vedremo tra poco, utilizzando l’RNA messaggero per questa proteina

in un sistema costituito dagli oociti di Xenopus, è stato possibile osservare che effettivamente l’over

espressione di questa proteina all’interno degli oociti di Xenopus determinava un trasporto di acqua

estremamente più rapido rispetto alle cellule in cui questi RNA non erano stati iniettati.

Questa proteina di trasporto dell’acqua è stata denominata ACQUAPORINA ed esistono omologhi

batterici che oltre a traportare acqua trasportano anche glicerolo.

La cosa interessante di queste proteine è che devono lasciar passare molecole d’acqua ma in maniera

selettiva, cioè non devono permettere il passaggio di ioni (potenziale di membrana), e in particolare

non permettono il passaggio dello ione più simile alla molecola d’acqua come ingombro sterico che è lo

ione H O (se lasciassero passare i protoni il gradiente protonico verrebbe dissipato). Quindi anche in

+

3

questo caso la selettività del canale non può essere dovuto ad un filtro meccanico ma deve essere

dovuto a dei fenomeni chimico-fisici che avvengono all’interno del canale che permettono appunto il

passaggio di molecole d’acqua e non di ioni.

L’altra cosa molto interessante è che la velocità di permeazione è altissima, si parla di milioni di

molecole d’acqua al secondo, quindi un sistema altamente selettivo ma allo stesso tempo altamente

efficiente.

Gli oociti di Xenopus sono un modello per l’espressione di proteine di membrana perché sono talmente

grandi che è possibile manipolarli facilmente, hanno tutta la macchina necessaria per produrre proteine

quando viene iniettato un mRNA di interesse all’interno della cellula e soprattutto se si tratta di

proteine eucariotiche tendono ad esprimerle in maniera efficiente e a posizionarle correttamente sulla

membrana. In particolare Xenopus è un modello di elezione per lo studio di canali ionici perché si

possono fare per esempio anche esperimenti di elettrofisiologia in maniera abbastanza semplice.

Nell’esperimento con gli oociti il controllo era costituito da oociti in cui non era stato iniettato l’mRNA

per l’acquaporina e che erano messi in un mezzo iposmotico, quindi un mezzo con una concentrazione

salina più bassa. Nel giro di pochi minuti le cellule in cui non era stato iniettato l’mRNA per

l’acquaporina si mantengono inalterate perché il trasporto d’acqua da un mezzo iposmotico a un mezzo

intracellulare è molto lento, quindi nell’ordine di grandezza di qualche minuto non c’è nessun effetto

sugli oociti di controllo. Al contrario quando gli oociti vengono iniettati con l’mRNA dell’acquaporina

fino ad un minuti e mezzo il volume e la forma della cellula si mantengono abbastanza inalterati, ma da i

2 minuti in poi la cellula cambia completamente forma per effetto dell’acqua che sta entrando

all’interno della cellula fino a che ovviamente se la cellula viene mantenuta in un mezzo iposmotico si

gonfierà al punto da scoppiare.

La struttura del canale dell’acqua AQP1 ha una struttura semplice, è un tetramero costituito da 4

subunità transmembrana e ciascuna delle subunità ha un canale attraverso cui permeano le molecole di

acqua.

Il monomero è formato da 6 alfa eliche transmembrana di cui 2 eliche hanno una struttura molto

particolare , ossia sono due semi-eliche allineate cioè che condividono lo stesso asse. Di solito quando

c’è un’interruzione della regolarità delle strutture secondarie delle proteine è perché quell’interruzione

è funzionale alla funzione che deve essere portata avanti dalla proteina.

Nelle slides vedete la rappresentazione con la densità elettronica in cui la rete non è altro che lo spazio

all’interno del quale la densità degli elettroni è più alta di una certa soglia, e quindi è lo spazio dove

sono localizzati gli atomi.

La prima struttura di un’ acquaporina è stata ottenuta attraverso microscopia elettronica

che può determinare la densità elettronica di un campione ma ha una risoluzione

tipicamente molto minore per quanto riguarda la precisione della diffrazione dei raggi X.

Di solito