Riassunto esame Biochimica di proteine e sistemi, Prof. F. Polticelli, libro consigliato Introduzione alla struttura delle proteine, Zanichelli

Lezione 1-2: BioD

Delocalizzazione elettronica e interazioni nelle proteine

Riguardo al gruppo fenile legato alla Phe, in questi sistemi di doppi legami coniugati c'è una delocalizzazione elettronica. Nel caso della Phe, gli elettroni pi greco sono delocalizzati al di sopra e al disotto del piano, questo genera una struttura che, sulla parte piatta della Phe, ha una parziale carica negativa. Quindi, ritornando al discorso della volta scorsa, cioè di come le proprietà degli aa siano molto più articolate rispetto alle proprietà standard studiate nei corsi di base, per esempio è possibile che una Phe faccia delle interazioni elettrostatiche con un residuo carico positivamente.

Andando ad analizzare la struttura delle proteine, in molti casi si vede un’interazione di una Lys (il gruppo aminico) che punta verso l’anello della Phe, cioè verso gli elettroni pi greco; questa è un’interazione che si chiama "cation-pi interaction", cioè interazione tra un catione e un elettrone pi greco, ed è un ulteriore tipo di interazione elettrostatica che possiamo ritrovare nelle proteine e che può stabilizzarne la struttura o la conformazione di certi aa.

Questo è vero non solo per la Phe, ma anche per il Trp, che ha una doppia valenza polare. Pur essendo un residuo classicamente considerato idrofobico, ha un NH che può formare legami idrogeno e in più ha il gruppo del benzene e anche qui gli elettroni sono delocalizzati e c’è quindi questo effetto di parziale carica negativa al di sotto e al di sopra del piano.

Proprietà della Tyr e confronto con la Ser

Un’altra cosa da ripassare della chimica organica riguarda la Tyr, che è un aa che ha proprietà molto varie. L’anello del fenile è idrofobico, però ha l’OH che è polare. Se vi ricordate dalla chimica organica i sostituenti del benzene, avete visto che a seconda del tipo di sostituente sull’anello, la carica del sostituente può essere delocalizzata sull’anello, stabilizzando la forma carica della molecola.

La stessa cosa succede nella Tyr: per fare un paragone, l’OH della Ser ha un pK di circa 15, lo stesso gruppo ossidrilico sulla Tyr ha un pK di circa 10-10.5. Questo significa che la forma carica negativamente, quindi la deprotonazione dell’ossidrile, è favorita proprio per effetto del fatto che quella carica negativa, che si genera quando l’aa perde il protone, può essere delocalizzata sull’anello. Quindi ci sono più forme di risonanza e in chimica organica ci è stato insegnato che quando una molecola ha più forme di risonanza, quella è la situazione più stabile.

Effetti dell'ambiente sulle proprietà degli aa

La volta scorsa dicevo che le proprietà degli aa, come normalmente vengono illustrate, sono le proprietà degli aa in forma isolata in acqua a 25°C; quando invece troviamo gli stessi aa nelle proteine, l’ambiente circostante in molti casi dipende da quali altri aa sono presenti nelle vicinanze dell’aa che stiamo considerando.

Quindi, ad esempio, se io vicino a quella Tyr ho un sito di legame con un metallo, consideriamo ad esempio il rame, la carica polare influenzerà il pK della Tyr e tenderà, nel caso specifico, a farla deprotonare più facilmente, perché il campo elettrico positivo generato dal rame, in qualche modo respinge il protone presente sull’OH della Tyr e quindi ne facilita la deprotonazione. Quindi posso avere una Tyr deprotonata e quindi carica negativamente, anche a pH=7. Lo vedremo in dettaglio nei vari sistemi, situazioni in cui le proprietà di un aa sono modificate dall'intorno molecolare e questo è funzionale al processo che deve essere portato avanti.

Comunque questo è un concetto generale da tener presente. Le proprietà degli aa cambiano rispetto all’ambiente circostante, soprattutto per effetto di fenomeni di solvatazione e per effetto di interazioni carica-carica. Normalmente le proprietà standard negli aa si ritrovano solo in catene laterali presenti sulla superficie della proteina e quindi quando sono molto esposti al solvente.

Legame peptidico e struttura delle proteine

Due aa si possono unire tramite un legame peptidico. Questa è una reazione essenzialmente di condensazione, dove il gruppo NH₂ di un aa NH₃⁺ in condizioni di pH neutro e il gruppo carbossilico di un aa reagiscono tra loro con perdita di H₂O e si forma una struttura che è di fondamentale importanza per le proprietà delle catene polipeptidiche. Questo perché si forma una struttura in cui gli elettroni sono parzialmente delocalizzati; questo fa sì che questo legame tra il carbonio carbonilico e l’azoto non sia più un legame singolo, ma abbia un parziale carattere di doppio legame e quindi non è più possibile la libera rotazione, e questo è il motivo per cui il legame peptidico è planare.

Quindi se non c’è più libera rotazione attorno al legame, quando considero due legami peptidici consecutivi, posso avere cambiamenti conformazionali solamente per rotazione del legame carbonio alfa e l’azoto che è angolo solido phi (un angolo tra 4 atomi) e l’angolo psi.

Un angolo piano è un angolo che si forma tra 3 atomi, per esempio se ho un carbonio tetraedrico, come il metile della Ala, gli angoli piani formati dagli idrogeni col carbonio sono di 109° perché il carbonio ha ibridazione sp³ e più o meno quell’angolo vale 109°. Invece, un angolo solido è un angolo formato da 4 atomi che definiscono 2 piani, cioè se io prendo i 4 atomi e prendo atomo 1, atomo 2 e atomo 3 questi formano un piano, se poi prendo gli atomi 2, 3 e 4 formano un altro piano; se io ho rotazione intorno a questo legame l’angolo solido è l’angolo formato tra i 2 piani.

Quindi gli angoli phi e psi sono gli angoli solidi definiti dai 4 atomi che vedete illustrati. Se io conosco tutti i valori degli angoli phi e psi per una catena polipeptidica conosco la struttura tridimensionale di quella proteina, per lo meno per quanto riguarda la catena principale, perché anche le catene laterali hanno gradi di libertà conformazionali dovuti alla presenza di legami simili dove c’è rotazione.

Conseguenze del legame peptidico e dipoli nelle strutture secondarie

Oltre al fatto che il legame peptidico genera una struttura planare, posso pensare alla catena polipeptidica che si avvolge come una sequenza di piani ruotati l’uno rispetto all’altro. Ma la conseguenza più importante della formazione del legame peptidico è che in questo modo si generano due legami polarizzati, carbonio-ossigeno e azoto-idrogeno in cui c’è una separazione di carica e quindi avrò un ossigeno carbonilico parzialmente carico negativamente e un idrogeno legato all’azoto parzialmente carico positivamente. Allora questa struttura ha una separazione di carica, cioè è quello che si chiama un dipolo.

Un dipolo può avere scarsa influenza sull’ambiente circostante perché si tratta di un delta di carica non enorme, ma il problema è che poi nella formazione delle strutture secondarie, e in particolare nella formazione delle alfa eliche, questi dipoli sono orientati tutti nella stessa direzione e quindi in qualche modo si sommano dando luogo ad un dipolo globale delle alfa eliche che invece ha rilevanze funzionali in alcuni casi.

L’alfa elica è una struttura essa stessa caratterizzata da un dipolo diverso da zero e quindi per esempio il dipolo dell’alfa elica può essere utilizzato per stabilizzare il legame di metalli, nella parte parzialmente carica negativamente o la presenza di aa acidi, quindi carichi negativamente, dalla parte positiva.

(domanda: come si divide la carica? Risposta: dipende sempre da chi è più elettronegativo, l’ossigeno ha un’elettronegatività maggiore del carbonio e quindi attrae a sé parzialmente gli elettroni del carbonio, quindi sull’O c’è una parziale carica – e sull’H legato all’N una parziale carica +).

Importanza della solvatazione e delle strutture secondarie

L’altra conseguenza di questa polarità del legame peptidico è che se non conoscessi nulla della struttura delle proteine e penso a questo polimero lineare, ramificato per effetto della presenza delle catene laterali, che in qualche modo tende a ripiegarsi, però nel ripiegarsi i gruppi polari della catena principale diventano inaccessibili al solvente. Questo è un concetto importante, cioè il concetto di come l’energia di solvatazione sia fondamentale per tutta una serie di fenomeni.

Prendiamo ad esempio un carbonile, abbiamo detto che l’ossigeno del carbonile ha parziale carica - , se io lo porto in un mezzo idrofobico, cioè non è più a contatto con l’H₂O, quella è una situazione sfavorevole perché una carica tende a interagire favorevolmente con le molecole d’H₂O, perché con i loro idrogeni parzialmente carichi +, interagiscono con l’O carbonilico e danno luogo ad un sistema con minore energia. La proteina deve però necessariamente ripiegarsi e questa necessità è assolta solo se i gruppi polari che porto dentro la struttura della proteina interagiscono tra loro e si compensano a vicenda, quindi posso avere una struttura tridimensionale stabile solo se i gruppi polari formano legami idrogeno tra di loro. Le strutture secondarie sono le strutture che permettono di “neutralizzare” i gruppi polari della catena principale.

Quindi la formazione di strutture secondarie è una necessità energetica dovuta al fatto che quando ho dei gruppi polari non esposti al solvente questo genera una situazione di alta energia, se invece sono compensati dall’interazione carica-carica l’energia si abbassa e la struttura diventa stabile.

Catene laterali e ingombro sterico

Consideriamo ora anche le catene laterali, e il fatto che queste catene laterali sono più o meno ingombranti. È vero che intorno agli angoli phi e psi c’è libera rotazione perché quelli sono legami singoli, ma bisogna anche tener conto dell’ingombro sterico generato dalla catena principale stessa e dalle catene laterali; questo significa che non è che in una struttura proteica gli angoli phi e psi possono assumere qualsiasi valore da 0 a 360°, alcuni valori saranno inibiti per effetto di ingombro sterico e questo effetto sarà tanto maggiore quanto più è ingombrante la catena laterale.

Questo ha un’altra conseguenza, cioè il fatto che siccome per formare certe strutture secondarie gli angoli phi e psi devono assumere valori ben definiti, gli aa per cui gli angoli phi e psi possono assumere quei valori si ritroveranno più facilmente in quelle strutture secondarie, mentre i valori di phi e psi non sono accessibili ad altri aa, i quali non si ritroveranno in quella particolare struttura secondaria. Questa è la base stereochimica del perché alcuni aa hanno una propensione maggiore a formare alfa eliche e altri a formare foglietti beta o inversioni di catena (tratti di catena che collegano due foglietti beta).

Ad esempio, indipendentemente dalla catena laterale che è presente sull’aa, i due valori phi=0 psi=0 non sono possibili per nessun aa perché questo genera un ingombro sterico tra il carbonile di un aa e l’NH di due aa a valle, porterebbe quindi ad urtare un ossigeno con un idrogeno.

Osservazioni sulle strutture proteiche e angoli phi/psi

Da questo deriva l’osservazione ormai antica del fatto che se io vado ad analizzare la struttura di una proteina e misuro tutti gli angoli phi e psi assunti da tutti gli aa che la compongono, mi ritrovo con dei valori preferenziali. Quando il numero di strutture disponibili era ancora molto piccolo, Ramachandran è andato ad analizzare, a calcolare, i valori degli angoli phi e psi per tutti gli aa che componevano un certo set di strutture tridimensionali, e ha constatato che essenzialmente quando consideriamo una struttura di tipo beta, i valori degli angoli phi e psi si concentravano in una regione del grafico, se invece nel caso di una struttura di tipo alfa si concentravano in un’altra regione.

Mentre il discorso che facevo per la Gly è diverso, perché la Gly avendo una catena laterale molto poco ingombrante, cioè un atomo di idrogeno, ha un intervallo di valori degli angoli phi e psi molto più ampio. La Gly è quindi un aa molto flessibile, cioè a livello della Gly la catena ha molta più libertà, infatti si ritrovano spesso in diverse famiglie proteiche residui di Gly strettamente conservati perché magari quella regione deve andare incontro ad un cambiamento conformazionale ed è quindi necessario che la catena sia flessibile.

Se per esempio, questa regione che si deve muovere provoca l’apertura e chiusura di un canale, è ovvio che quella Gly deve essere assolutamente conservata, perché il canale funziona solo se c’è un residuo di Gly. La mutazione della Gly è letale per l’organismo che la porta. Questo è un altro concetto che rivedremo più volte, cioè l’analisi comparativa di più membri della stessa famiglia proteica ci aiuta a capire quali sono le regioni fondamentali per il funzionamento.

Possiamo avere proteine che hanno la stessa struttura globale e magari hanno un’identità di sequenza aminoacidica solo tra il 15-20%, cioè se io conoscessi solo la sequenza delle proteine, non la struttura, non capirei mai che quelle due sequenze aminoacidiche daranno luogo alla stessa struttura proteica. In realtà però, se io so che le proteine hanno la stessa struttura e ho tanti membri di quella famiglia proteica, osserverò che molte regioni presentano un gran numero di sostituzioni aminoacidiche, ma ci saranno delle regioni dove un certo aa è conservato lungo tutta la scala evolutiva; questo mi fa pensare che quell’aa sia fondamentale per il funzionamento.

Esempio del canale del potassio

Uno degli esempi che vedremo è quello del canale del potassio, dove, dai batteri fino agli eucarioti superiori, ci sono una serie di residui che sono strettamente conservati perché la sostituzione di uno di quegli aa determina un malfunzionamento della proteina corrispondente, quindi spesso l’organismo che porta la mutazione non è vitale.

Strutture secondarie e stabilità delle proteine

Se andiamo a vedere più in dettaglio le strutture secondarie, vediamo che nella struttura elicoidale si ripete la catena polipeptidica ritorna nella stessa posizione ogni 3-4 residui e, cosa più importante, l’alfa elica si forma attraverso la formazione di un gran numero di legami idrogeno tra i carbonili e gli NH della cat principale. La caratteristica di questi legami H è il fatto che sono orientati più o meno tutti nella stessa direzione, cioè lungo l’asse dell’alfa elica, questo fa sì che ci siano una serie di dipoli dove l’O ha parziale carica - e l’H dell’NH parziale carica +, e quindi l’alfa elica stessa ha un carattere dipolare con un’estremità carica + e una carica -.

L’altra caratteristica dell’alfa elica è che queste interazioni, cioè questi legami H, si formano tra aa che sono vicini lungo la sequenza aminoacidica, cioè si forma un legame H ogni 4 residui. Allora questo significa che l’alfa elica è una struttura stabile perché è come se fosse una molla, per tirarla devo rompere un gran numero di legami H. Però siccome un legame H ha energia stimata di 2-3 kcal per mole, se io ho, ad esempio, 10 legami H, devo spendere un’energia di circa 20-30 kcal per mole per denaturare quell’alfa elica, quindi è una struttura che è stabile a livello locale, nel senso che le interazioni si instaurano tra residui vicini.

Se ho per esempio una struttura formata, come vedremo, da alfa eliche unite da brevi loop, quella è una struttura che avrà una certa dinamicità, perché le porzioni stabili sono quelle vicine tra di loro nella sequenza aminoacidica, mentre invece tra alfa elica e alfa elica posso avere più facilmente un movimento, quindi è come se avessi una serie di molle collegate da giunzioni. Questo fa sì che le strutture ad alfa elica siano intrinsecamente più dinamiche delle strutturure formate da segmenti beta, perché invece nei segmenti beta i legami H si formano tra residui distanti lungo la sequenza aminoacidica. Quindi se io voglio modificare la struttura devo denaturare la proteina, perché devo completamente aprirla visto che i residui che interagiscono sono lontani tra loro.

Per l’alfa elica, andando a vedere come si distribuiscono gli orbitali molecolari, è stato calcolato che sull’O ho una carica di circa -0,4 e sull’H dell’NH ho una carica di circa +0,2, questa separazione di carica forma il dipolo. Esistono dei metodi di calcolo che permettono di calcolare il campo elettrico generato da una molecola e se applico questo metodo all’alfa elica ottengo che le linee di campo generate da tutti i legami H si estendono nel solvente, significa che i dipoli delle eliche possono interagire con una carica che sia posta a qualche armstrong di distanza. Quindi il campo elettrico generato da un’alfa elica è in grado di determinare interazioni con ioni carichi + o con residui carichi – e stabilizzare o il legame di uno ione o l’E globale di una proteina attraverso interazioni elettrostatiche.

Struttura beta e modalità di formazione

L’altra grande categoria di struttura secondaria è la struttura di tipo beta. Questa può formarsi in due modi diversi: innanzitutto, abbiamo detto che gli aa che interagiscono in una struttura beta non sono contigui lungo la sequenza, ma sono distanti. Allora quando si forma una struttura beta, si può formare per accostamento di due porzioni di catena che procedono in modo antiparallelo, viceversa se l’andamento della catena è lo stesso e tutte e due le catene vanno da N terminale a C terminale, l’andamento è parallelo.

Una cosa che vorrei farvi notare è che l’angolazione dei legami H non è perfettamente perpendicolare all’andamento della cat polipeptidica, i legami H hanno un...