Riassunto esame Embriologia, prof. Musarò, libro consigliato Embriologia Umana, De Felici

Riassunti di embriologia

Origine del termine

Il termine "cellule staminali" appare per la prima volta nella letteratura scientifica nel 1868 nelle opere di un biologo tedesco, Ernst Haeckel. Egli utilizzò il termine in due sensi:

• Organismo unicellulare antenato da cui presupponeva che gli organismi pluricellulari si fossero evoluti
• Cellula uovo fecondata che dà origine a tutte le cellule dell'organismo

Molti altri iniziarono poi a usare il termine per riferirsi a singole cellule capostipiti di una discendenza cellulare.

Definizione di cellula staminale

Cellula indifferenziata che possieda principalmente due proprietà:

• Self renewal: capacità di dividersi per mitosi numerose volte mantenendo lo stato indifferenziato
• Capacità di differenziare in tipi cellulari specializzati

Potremmo suddividere le cellule staminali in tre famiglie, proprie di tre diversi periodi della vita:

• Cellule staminali dell'embrione
• Cellule staminali del feto
• Cellule staminali dell'adulto

(A queste bisognerebbe aggiungere le staminali artificiali, che sono state generate in coltura dagli scienziati, e le cellule staminali tumorali).

Funzioni delle cellule staminali

Aumento/mantenimento del numero delle cellule di una popolazione: mediante il self renewal possono aumentare/mantenere il numero di cellule di una popolazione e/o dare origine a cellule figlie parzialmente differenziate (cellule staminali progenitrici) che possono continuare a dividersi per self renewal fino perdere o ridurre la capacità di dividersi:

• Cellule embrionali hanno un self renewal di alcuni cicli, al termine dei quali differenziano.
• Cellule artificiali hanno un self renewal illimitato nel tempo.
• Le cellule staminali adulte hanno una capacità self renewal che dura per tutta la vita, ma si dividono raramente. Un significativo aumento del numero delle cellule di una popolazione avviene soprattutto a seguito della proliferazione delle cellule staminali progenitrici che dopo un numero definito di divisioni self renewal entrano in una specifica via differenziativa o danno origine a cellule che mantengono un transiente stato di proliferazione (cellule di passaggio amplificanti).

Formazione di tipi cellulari differenziati:

• Determina la suddivisione delle cellule staminali in uni-bipotenti (es: epidermide), multipotenti e pluripotenti (es: foglietti embrionali e creste neurali), totipotenti (ovocito fecondato e blastomeri).

Questa funzione dipende dalla plasticità del genoma della cellula che può essere modulato dalla nicchia (ambiente) in cui si trova. La plasticità consiste in una particolare conformazione della cromatina che consente ai geni che controllano il differenziamento di rimanere accessibili alla trascrizione.

L'evoluzione dei meccanismi di rigenerazione tessutale: dall'idra all'uomo

La rigenerazione cellulare è uno dei processi omeostatici più diffusi tra i metazoi, ma l'efficienza di questo processo non è uguale in tutte le specie. Alcuni organismi semplici (es. idra e planaria) riescono a rigenerare la parte mancante dopo un'amputazione. Durante l'evoluzione, però, le specie superiori (uomo) hanno perso questa capacità (o l'hanno limitata ad alcuni tessuti).

In cosa i processi di rigenerazione tissutale di un anfibio differiscono da quelli di un organismo superiore?

Nelle specie animali in grado di rigenerare organi, la rigenerazione dei tessuti avviene a seguito della formazione di una struttura, il blastema:

• Danno a livello degli arti o della coda
• Sottile strato di cellule epidermiche avanza verso il bordo del taglio, formando una struttura epidermica
• Sotto la struttura epidermica si trova una massa di cellule dedifferenziate, capaci di proliferare (insieme di tessuti = blastema)

Si è osservato che negli urodeli la rigenerazione sembra coinvolgere una parziale o totale perdita dello stato differenziato e la ripresa del ciclo cellulare nei tessuti interessati dalla ferita. Uno dei fattori che contribuisce al sdifferenziamento è la trombina; il rientro nel ciclo cellulare è invece mediato dalla fosforilazione della proteina del retinoblastoma (Rb). La normale funzione di Rb è di bloccare la divisione cellulare (inibendo l'azione di E2F, coinvolto nella duplicazione del DNA) = promuove il ciclo quando è fosforilata; lo blocca quando è defosforilata.

Negli organismi superiori la rigenerazione tissutale segue un meccanismo completamente diverso (il più simile è solo la riparazione di una frattura di un osso da parte del callo osseo).

La divisione simmetrica e asimmetrica

Esistono due modalità di divisione mitotica:

• Mitosi simmetrica: una cellula staminale dà origine a due cellule figlie che rimangono entrambe staminali o sono entrambe indotte a differenziare (molto comuni nelle tumorali e le ESC)
• Mitosi asimmetrica: consente a una cellula staminale di dare origine a due cellule figlie, di cui una rimane staminale e l'altra si differenzierà (comune in quasi tutte le staminali adulte).

Meccanismi molecolari della divisione asimmetrica

Coinvolgimento di specifiche vie di segnalazione, mediate dai fattori di crescita Notch, WNT, SHH; quando deregolate, queste segnalazioni possono contribuire allo sviluppo e alla crescita di tumori. Fondamentalmente, due sembrano essere i tipi di meccanismi che governano la divisione asimmetrica:

• Intrinseco: ripartizione asimmetrica di alcuni componenti cellulari. Comprendono l'assemblaggio regolato di fattori della polarità cellulare e la segregazione regolata dei determinanti il destino cellulare.
• Estrinseco: posizione che assumono le cellule figlie rispetto a stimoli esterni; il piano di divisione della cellula staminale madre può posizionare una cellula figlia (che resta staminale) all'interno della nicchia e l'altra (che differenzierà) fuori.

Questo tipo di divisione si realizza in quattro passaggi:

• Alcuni fattori possono essere delocalizzati nella cellula madre
• La cellula madre diventa polarizzata (riorganizzazione del citoscheletro)
• Fattori determinanti del destino cellulare sono segregati verso specifiche regioni della cellula madre
• Fuso mitotico allineato in modo che il clivaggio ripartisce in modo diseguale i vari fattori tra le figlie

Uno dei determinanti differenziativi importanti è la proteina Numb (che antagonizza Notch, coinvolto nella proliferazione e mantenimento delle cellule staminali), che spinge a differenziare. La segregazione del fattore di trascrizione TLX è invece determinante per regolare il self renewal e la proliferazione delle cellule staminali neurali nel cervello adulto. Ha un ruolo importante anche p53 (proteina onco-soppressore) –> cellule staminali in cui è stato eliminato il gene che codifica per p53 hanno un comportamento simile a quello osservato nelle cellule staminali coinvolte in alcuni tipi di tumori.

Cellule staminali embrionali

Se le cellule dell'ICM di una blastocisti vengono isolate e disgregate in piccoli gruppi, e questi vengono poi seminati su un monostrato di fibroblasti precedentemente preparato in coltura, dopo circa 5-7 giorni cominciano ad apparire piccoli cloni di cellule ES. Questi vengono poi disgregati enzimaticamente e coltivati di nuovo su monostrati di fibroblasti. Si è dimostrato che per mantenere una cellula staminale embrionale nel suo stato indifferenziato è necessario che esprima fattori trascrizionali come OCT4 e Nanog e che sia costantemente presente nel mezzo di coltura la citolichina LIF (nel topo) o il fattore di crescita FGF (nell'uomo).

Si ritiene che i meccanismi molecolari che determinano la formazione e il mantenimento delle ESC in coltura siano:

• Capacità di molecole come LIF e FGF di mantenere elevata l'espressione di geni "della staminalità" (come Oct4 e Nanog) che orchestrano l'espressione di altri geni in grado di mantenere la pluripotenza
• Attivazione di segnali di proliferazione e di inibizione dell'apoptosi

Una delle sfide più importanti della biologia delle ESC è la caratterizzazione di segnali induttivi che le spingano a differenziare non in modo casuale, ma verso una specifica linea cellulare.

Problemi della sperimentazione:

• Etico –> necessità di usare embrioni umani per ottenere le cellule dell'ICM da una blastocisti
• ESC iniettate in un individuo adulto possono generare tumori
• I tessuti derivati dalle ESC verrebbero rigettati a seguito di una reazione immunitaria dell'ospite

Cellule staminali adulte

Oggi sappiamo che ogni tessuto adulto dell'organismo (incluso il tessuto nervoso) possiede un compartimento di cellule staminali in grado di attivarsi, più o meno efficientemente, in seguito a diversi stimoli induttivi. Sono state descritte due regioni particolarmente attive nel cervello adulto: ippocampo e regione sub-ventricolare dei ventricoli laterali (vengono continuamente generati nuovi neuroni).

Le caratteristiche distintive delle cellule staminali adulte sono:

• Divisione asimmetrica
• Capacità clonogenica
• Basso grado proliferativo

Molte delle cellule staminali adulte che mostrano capacità differenziative limitate finché si trovano nella loro nicchia, in particolari condizioni manifestano una sorprendente capacità di differenziarsi in tipi cellulari diversi (trans-differenziamento).

Cellule staminali pluripotenti indotte (iPS)

Nel 2006 un gruppo di ricercatori giapponesi diretto da Yamanaka, introducendo in fibroblasti prelevati da topi adulti (mediante vettori virali) quattro geni espressi a livello elevato nelle SC (Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4) riuscì a ottenere in coltura colonie di cellule molto simili alle colonie di ESC ottenute dalle blastocisti –> furono chiamate iPS. Successivamente si dimostrò che le iPS iniettate in una blastocisti erano capaci di differenziare in qualsiasi tipo di cellule (comprese le cellule germinali).Queste cellule, oltre a eliminare il problema etico della sperimentazione, eliminerebbero il rischio di rigetto (in quanto formate a partire da cellule somatiche dell'individuo stesso).

Problemi:

• Presenza dell'imprinting genomico
• Geneticamente instabili, possono generare tumori

Successi e prospettive per l'utilizzo delle cellule staminali nella pratica clinica

La medicina rigenerativa è una delle nuove frontiere della medicina –> utilizzare cellule staminali per riparare o ricostruire tessuti danneggiati. Idea già concretizzata alla fine degli anni '50 con il trapianto di midollo osseo + anni '90 con la generazione in laboratorio di una cornea partendo da cellule staminali epiteliali isolate dalla regione limbale dell'occhio del paziente stesso.

Spermatogenesi + apparato genitale maschile

Il sistema riproduttivo maschile è composto da:

• Testicoli: organi pari contenuti nello scroto. Sono ghiandole endocrine dove avviene la produzione e la secrezione di androgeni (testosterone e diidrotestosterone)
• Sistema di vie genitali: producono liquido seminale. Sono condottini efferenti, epididimo, dotto deferente, dotto eiaculatore, gran parte dell'uretra.
• Organo copulatore (pene)

Anatomia

La gonade è un organo ghiandolare ovoidale, completamente avvolto dalla tonaca albuginea (tessuto connettivo fibroso), che si ispessisce posteriormente formando il mediastino del testicolo, da cui si propagano verso l'interno dei sepimenti connettivali che suddividono l'organo in circa 250 regioni (lobuli). Ogni lobulo contiene da uno a quattro tubuli a fondo cieco (tubuli seminiferi), immersi in uno stroma connettivale.

Fra le anse dei tubuli si trova un connettivo lasso interstiziale (contenente vasi sanguigni, linfatici, cellule intersiziali endocrine del Leydig). Le estremità dei tubuli comunicano con la rete testis (canalicoli localizzati nel mediastino del testicolo), in continuità con i condottini efferenti, che conducono gli spermatozoi all'epididimo.

L'epididimo (interposto tra rete testis e dotto deferente) è divisibile in tre parti:

• Testa: parte più voluminosa, il rapporto con i condottini efferenti
• Corpo: parte intermedia
• Coda: si ripiega in alto e continua con il dotto deferente

Il dotto deferente parte dall'epididimo, si dilata (ampolla) e sbocca nel dotto eiaculatore che termina nell'uretra prostatica.

Sviluppo prepuberale nel testicolo

I cordoni testicolari primitivi sono costituiti da tre tipi di cellule:

• Cellule germinali: prospermatogoni
• Cellule di sostegno: precursori delle cellule del Sertoli e delle cellule mioidi
• Cellule interstiziali: precursori delle cellule del Leydig

La spermatogenesi inizia solo alla pubertà, quando le cellule del Sertoli cessano di dividersi, diventano cellule polarizzate allungate (con formazione di giunzioni occludenti tra le membrane), e iniziano a produrre un secreto fluido, che porta alla trasformazione dei cordoni seminiferi (privi di lume) in tubuli seminiferi.

Per quanto riguarda le cellule del Leydig, si sviluppano in tre fasi:

1. 14-18 settimana fetale = cellule sintetizzano testosterone e Insl-3 (per discesa dei testicoli)
2. 1-3 mese dopo nascita = picco postnatale di LH/testosterone
3. Pubertà = cellule di Leydig adulte

Epitelio seminifero

Complesso epitelio stratificato che forma i tubuli seminiferi nell'adulto, costituito da varie generazioni di cellule germinali e da cellule del Sertoli.

Le cellule del Sertoli costituiscono gli elementi somatici dell'epitelio seminifero. Si presentano di forma colonnare vagamente triangolare, con la base in contatto con la membrana basale e la porzione apicale protesa verso il lume del tubulo. Ruolo cruciale nel processo della spermatogenesi.

Funzioni:

• Sostegno strutturale e nutritivo alle cellule germinali
• Fagocitosi di cellule germinali in degenerazione e di corpi residuali degli spermatidi
• Regolazione del rilascio degli spermatozoi (durante la spermiazione)
• Secrezione di molecole che mediano l'azione dell'FSH
• Protezione di cellule germinali autoantigeniche dal sistema immunitario (il privilegio imm. del testicolo)

In prossimità della regione basale, le membrane laterali di cellule del Sertoli adiacenti sono connesse da giunzioni occludenti che si estendono lungo tutto il perimetro –> barriera emato-testicolare.

La barriera suddivide il testicolo in due compartimenti (basale e adluminale), segregando le cellule germinali:

• Compartimento basale = spermatogoni, spermatociti primari in preleptotene
• Compartimento adluminale = spermatociti in meiosi, spermatidi, spermatozoi

Il primo è accessibile al fluido interstiziale che origina dai vasi sanguigni. Il secondo è pervaso dal fluido tubulare che è secreto dalle cellule del Sertoli.

Spermatogenesi

Processo durante il quale gli spermatogoni si differenziano in cellule altamente specializzate (spermatozoi). Nell'uomo l'intervallo di tempo tra la divisione mitotica dello spermatogonio Ap e la spermiazione finale dello spermatozoo ha una durata media di circa 74 giorni.

La spermatogenesi può schematicamente essere divisa in tre fasi: fase mitotica, fase meiotica, spermiogenesi.

Fase mitotica

Circa 20 giorni. Avvengono proliferazione e differenziamento degli spermatogoni. Spermatogoni = popolazione di cellule che, dividendosi per mitosi, dà luogo a due popolazioni = cellule staminali spermatogoniali + cellule germinali.

Gli spermatogoni staminali si dividono in:

• Spermatogoni Ad (A dark): colorazione della cromatina omogenea e intensa, ad eccezione di una piccola area rotondeggiante più chiara. Basso indice mitotico
• Spermatogoni Ap (A pale): cromatina finemente dispersa e colorazione uniforme e pallida. Alto indice mitotico (ad ogni ciclo dell'epitelio seminifero).

Spermatogoni B = originano dagli Ap (che per mitosi si dividono in Ap e B) –> formano spermatociti primari in preleptotene (che dopo la duplicazione del DNA entrano nella prima divisione meiotica). Gli spermatogoni Ap destinati al differenziamento non completano la citodieresi e sono in comunicazione mediante ponti citoplasmatici intercellulari (le cellule germinali acquisiscono la loro individualità solo alla spermiazione –> si distaccano dall'epitelio seminifero rimanendo libere nel lume del tubulo).

Fase meiotica

Ha inizio a partire dagli spermatociti primari in preleptotene (interfase) –> replicano il DNA, si condensano i cromosomi (leptotene), si appaiano gli omologhi (zigotene), crossingover (pachitene), si separano gli omologhi (diplotene). Dalla meiosi I si formano quattro spermatidi rotondi. La meiosi II è come una mitosi (senza duplicazione).

1 spermatogonio Ap = 16 spermatidi (24 giorni)

Spermiogenesi

Processo di maturazione –> trasformazione di una cellula rotonda in una cellula altamente polarizzata. Dura circa 30 giorni. Passaggi fondamentali:

• Formazione dell'acrosoma
• Modificazioni del nucleo e della forma della cellula
• Formazione del flagello
• Eliminazione del citoplasma in eccesso e nuova organizzazione degli organelli cellulari
• Condensazione della cromatina
• Spermiazione = rilascio degli spermatozoi da parte delle cellule del Sertoli nel lume del tubulo seminifero

Schematicamente divisibile in quattro fasi:

• Fase del Golgi: inizia la formazione dell'acrosoma; una serie di granuli (granuli proacrosomici) che originano dal complesso di Golgi confluiscono formando un'unica vescicola acrosomica.
• Fase del cappuccio: la vescicola acrosomica cresce e riveste due terzi anteriori della superficie nucleare (cappuccio acrosomico).