Riassunto esame Biologia dello Sviluppo, prof. Moreno, libro consigliato Biologia dello Sviluppo di Scott

Biologia dello sviluppo

Dal libro “Biologia dello sviluppo” di Scott F. Gilbert

Introduzione allo sviluppo degli animali

Durante lo sviluppo di un organismo, la prima tappa è rappresentata dalla differenziazione, in cui da una singola cellula si creano una miriade di altre cellule diversamente differenziate. L’organizzazione in tessuti ed organi delle varie cellule è detta morfogenesi (creazione di forma e struttura) e accrescimento (aumento delle dimensioni).

Nelle sue linee generali, lo sviluppo di un organismo segue due tappe: la fecondazione e l’embriogenesi. La prima tappa dell’embriogenesi è la segmentazione, un processo molto rapido in cui lo zigote si divide in varie cellule più piccole dette blastomeri, dando origine prima alla morula e poi alla blastula, a forma di sfera. La seconda tappa è rappresentata da una serie di riarrangiamenti cellulari, in cui i blastomeri migrano in varie posizioni: questo processo è detto gastrulazione, durante la quale si formano blastocele e blastoporo, e al termine della quale l’embrione risulta formato da tre strati di cellule detti foglietti germinativi.

Lo strato più esterno è l’ectoderma, che origina l’epidermide e il tessuto nervoso; quindi il mesoderma, che origina cuore, rene, gonadi, tessuto connettivo, cellule del sangue e i muscoli; infine l’endoderma, da cui si origina il rivestimento interno del tubo digerente e gli organi ad esso correlati, e il rivestimento esterno del sistema respiratorio.

Quindi si passa all’organogenesi, in cui le cellule interagiscono fra loro e danno origine ai vari organi del corpo (nei Vertebrati, l’organogenesi comincia con la formazione del tubo neurale da parte dell’ectoderma mediodorsale). Alcuni organi possono essere formati da cellule di differenti foglietti.

Contemporaneamente a tutti questi processi, si formano le cellule germinali (di origine extraembrionale), che vengono mantenute separate da quelle somatiche per poter assolvere meglio alla loro funzione. La gametogenesi comincia fin dalla fecondazione, ma si completa solo quando l’individuo è sessualmente maturo.

Geni e sviluppo

Introduzione e tecniche

Come è possibile la differenziazione

Uno dei maggiori problemi che la biologia si trovava a dover risolvere dopo la seconda guerra mondiale, era quello che scaturiva dalla domanda “Com’è possibile la differenziazione delle cellule?”. Lo studioso Monod pensò che probabilmente la differenziazione aveva un meccanismo che funzionava nello stesso modo in cui accadeva per E.coli, che sintetizza enzimi specifici quando si trova a contatto con specifici elementi, mentre senza questo contatto gli enzimi non sono sintetizzati. Così alcuni batteri riescono a cambiare la composizione o la disposizione del proprio citoplasma in determinate condizioni.

Si pensò di studiare il modello batterico e di estendere i risultati alle altre forme di esseri viventi, per il principio di uniformità della natura. Lo studio portò ad un importante risultato: secondo il modello dell’operone, si considera che una piccola proteina induttrice possa sbloccare la proteina repressione che blocca l’espressione di un certo gene: questa espressione specifica porta alla differenziazione.

L’idea di un’espressione genica differenziale, selezionata da proteine, si estese rapidamente. Vennero allora pronunciati tre importanti principi:

• I DNA di tutte le cellule differenziate sono identici
• I geni “non usati” in certe cellule differenziate non sono distrutti, ma mantengono la loro proprietà di essere espressi
• È espressa solo una piccola percentuale del genoma in ogni cellula

Il terzo punto fu dimostrato per la prima volta su larve di ditteri: alla schiusa, una larva ha due popolazioni cellulari differenti, di cui molte contengono cromosomi politenici, cioè cromosomi che iniziano la replicazione del DNA senza la mitosi, e quindi contengono varie eliche di DNA parallele. Queste cellule crescono moltissimo, muoiono e sono rimpiazzate da normali cellule non politeniche. Beermann dimostrò che le bande cromosomiche presenti sui vari cromosomi politenici erano identiche fra di loro, eccezion fatta per la presenza di particolari rigonfiamenti, detti puff, che erano disposti in posizioni differenti. Beermann riuscì a dimostrare che i puff erano punti di attiva sintesi di mRNA, e che la differente posizione dei puff portava alla sintesi di proteine diverse, per cui la cellula poteva differenziarsi in modo diverso. Non tutti i geni del cromosoma, quindi, diventano attivi.

Studio e clonazione dei singoli geni

Tutto questo permetteva senza dubbio di studiare alcuni geni, ma ancora le tecniche non erano abbastanza perfezionate da permettere uno studio approfondito. Soprattutto, per poter studiare al meglio i geni, era necessario averne in grandi quantità, cosa che spesso non era possibile. Per questo, venne studiata una tecnica che permetteva di clonare geni e di averne dunque un gran numero a disposizione.

La maggior parte delle tecniche di analisi dei geni eucarioti si basa sull’ibridazione degli acidi nucleici. Questa tecnica consiste nella rinaturazione di sequenze di DNA a singolo filamento, permettendo così di formare degli ibridi a doppio filamento, e quindi funzionali. Le sequenze di DNA che vengono rinaturate sono le sequenze che codificano i geni che servono per quel particolare studio. Noi non conosciamo la disposizione precisa dei vari geni, e per ottenerne uno isolato dagli altri dobbiamo passare attraverso tecniche molto complesse. Denaturare significa dissociare in due singoli filamenti l’elica di DNA.

Il procedimento per clonare i geni, secondo una tecnica ormai però superata (questa tecnica infatti prevede tempi troppo lunghi, costi troppo elevati e necessità di spazi troppo ampi per tutte le colture batteriche), avviene in questo modo: il DNA (o l’RNA) vengono frammentati selettivamente ad opera di speciali enzimi batterici detti endonucleasi di restrizione. Questi enzimi possono eseguire dei tagli trasversali, esponendo delle sequenze nucleotidiche a singolo filamento all’esterno della doppia elica (i frammenti così spezzati vengono detti frammenti di restrizione), in modo che questa si leghi solo con una catena complementare tagliata con lo stesso enzima di restrizione, che può avere anche un’origine differente dalla sequenza alla quale si accoppia: si crea un ibrido. Naturalmente all’interno del batterio stesso l’endonucleasi non scinde il DNA, perché questo è metilato e quindi protetto.

A questo punto inizia la fase di amplificazione attraverso dei vettori di clonazione, di solito molecole circolari di DNA, ossia DNA batterici. Questi DNA sono spezzati in un punto: grazie ad una divisione soltanto è possibile incorporare il frammento di DNA prescelto (che deve combaciare con le sequenze dell’altro DNA) nel DNA batterico, e quindi chiudere la catena. Grazie al solo sforzo del batterio, si avranno moltissime copie del DNA eucariotico all’interno di un plasmide batterico: si parla di DNA ricombinante. Il batterio stesso è in grado di sintetizzare le proteine derivanti dal DNA eucariotico, e quindi queste proteine vengono rese disponibili a noi in elevata quantità. Il gioco è fatto.

Prendiamo l’esempio della clonazione del VII fattore di coagulazione dell’uomo: innanzitutto il DNA umano viene estratto dai nuclei delle cellule e digerito da endonucleasi di restrizione. Mischiando tutti questi segmenti a plasmidi ottengo migliaia di plasmidi ricombinanti. Dopo aver inserito i plasmidi in altrettanti batteri, e dopo che questi si sono moltiplicati, bisogna diluirli in varie vasche di coltura, in modo che in ogni vasca sia presente un solo batterio. Usando un anticorpo fosforescente posso evidenziare la linea batterica che contiene il fattore VII e far moltiplicare solo quella coltura. Questa tecnica usa dunque le librerie genomiche, cioè utilizza tutti i possibili frammenti di geni per trovare quello utile.

Una tecnica molto più rapida utilizza invece le librerie di mRNA, usa cioè solo frammenti di mRNA, riducendo le possibili combinazioni e quindi le possibili prove (es: uso l’mRNA di pancreas per ottenere l’insulina, al posto di cercare il gene per l’insulina in tutto il DNA).

La tecnica delle librerie di mRNA utilizza i cDNA, cioè DNA complementari che contengono le informazioni necessarie per tradurre una certa proteina, ma differenti dal normale DNA perché privi di introni. Per produrre i cDNA, si mettono in una provetta l’mRNA, un primer di DNA, precursori radioattivi di DNA e l’enzima virale trascrittasi inversa, in grado di sintetizzare cDNA a partire dall’mRNA.

Il primer si appaia alla coda di poli A dell’mRNA (non presente negli altri RNA, per questo si tratta di una tecnica usata solo per gli mRNA) ed inizia la trascrizione (la trascrittasi inversa ha bisogno di un primer per iniziare la sintesi). Si forma un filamento ibrido cDNA/mRNA, che viene separato in due filamenti innalzando il pH della soluzione.

Grazie ad una DNA polimerasi e ad una nucleasi è possibile creare anche il filamento complementare del cDNA, in modo che la doppia elica possa essere inserita in un plasmide. La DNA ligasi inserisce alle estremità della doppia elica dei segmenti chiamati linker, che contengono siti specifici per un enzima di restrizione. Il taglio diagonale permette l’inserimento del nuovo frammento in un plasmide.

Dopo che il cDNA è stato moltiplicato, lo stesso enzima di restrizione taglia le estremità del frammento, permettendo di riisolare il cDNA a doppia elica clonato. In questo modo si è creata una libreria di cloni di DNA. Posso ad esempio ottenere una libreria di tutti i geni presenti nel fegato di un embrione di topo di pochi giorni: basta avere gli mRNA giusti ed ottengo la lista dei geni che sono attivi nella sintesi delle proteine epatiche in quel certo periodo. Inoltre i geni clonati in questo modo mancano degli introni, e quindi se sono immessi in una cellula batterica vengono direttamente tradotti dai batteri nelle proteine. Non è nemmeno necessario passare per la fase di ricerca dal gene in tutte le vasche.

PCR e sequenziamento del DNA

Attraverso la tecnica PCR (reazione a catena della polimerasi) è possibile ottenere milioni di copie di DNA specifici in un arco di tempo brevissimo e senza utilizzare organismi viventi come mezzo moltiplicativo (lo si fa in provetta). Gli mRNA presenti in un certo gruppo di cellule vengono trasformati dalla trascrittasi inversa in cDNA, reso a doppio filamento da una DNA polimerasi e dalla S1 nucleasi.

Il doppio filamento di DNA da amplificare viene denaturato ad alta temperatura, quindi vengono aggiunti alla provetta due primer sintetici di RNA: ognuno si ibrida su un differente filamento di DNA, quello ad esso complementare. La DNA polimerasi sintetizza la catena complementare a partire dal primer. Il primer non si appaia al DNA sulla sua estremità ed i filamenti risultanti saranno più corti, quindi il DNA da amplificare posto nella provetta deve essere un po’ più lungo del necessario. Un successivo evento di denaturazione rende di nuovo disponibili i filamenti originali (su cui ricomincia il processo di amplificazione), mentre quelli nuovi più corti finiscono il trattamento.

Il processo infatti termina quando si è creata una doppia elica della lunghezza esatta. Due cicli successivi di attacco del primer, azione della DNA polimerasi e denaturazione (l’ultimo ciclo però non fa la denaturazione finale), portano ad ottenere un clone a doppio filamento di DNA prescelto. È una tecnica estremamente utile se si vogliono studiare piccolissime quantità di acido nucleico (RNA “rari”). Ad esempio gli embrioni di topo prima dell’impianto presentano piccolissime quantità di mRNA e, secondo il vecchio metodo, per ottenere una quantità sufficientemente elevata di mRNA era necessario lisare molti embrioni di topo. La PCR permette di usare un numero molto esiguo di embrioni.

I maggiori problemi che si incontrano nell’eseguire questo tipo di tecnica sono due: la difficoltà nel conoscere le giuste sequenze di innesco e la dispendiosità nell’aggiungere ogni volta una nuova DNA polimerasi. Conoscere le sequenze del DNA è l’unico modo per conoscere precisamente le sequenze degli inneschi. Il procedimento più semplice per poter sequenziare il DNA viene detto sequenziamento didesossi, ideato da Sanger alla fine degli anni ’70. Il processo di sequenziamento venne utilizzato inizialmente per ottenere numerose copie di DNA senza dover passare attraverso il sistema dispendioso dei plasmidi.

Un metodo alternativo per ottenere queste copie era infatti passare attraverso l’utilizzo di una DNA polimerasi, enzima che però necessita di un innesco per poter iniziare la trascrizione. Il sequenziamento serve appunto per ottenere le sequenze nucleotidiche a partire dalle quali sarà possibile creare gli inneschi giusti. Innanzitutto è necessario costruire degli oligonucleotidi primer a sequenza nota. Il tipo di primer costruito dipende dalla sequenza di DNA posta a monte del frammento da analizzare. Questo infatti è in parte noto ed in parte sconosciuto. Il primer si associa alla parte nota in modo che la sua estremità 3’ termini proprio in corrispondenza dell’inizio della sequenza ignota.

In una provetta si inseriscono il DNA denaturato, il primer radioattivo, i normali precursori del DNA (dATP, dGTP, …) ed uno fra quattro differenti didesossinucleosidi trifostati: didesossi-A (ddATP), didesossi-G (ddGTP), didesossi-T, didesossi-C. I normali nucleotidi sono dei deossinucleotidi, cioè mancano di un ossigeno in posizione 2’, ma hanno un –OH in posizione 3’: grazie alla presenza di questo atomo di ossigeno, è possibile attaccare nuove catene all’estremità 3’. I didesossinucleotidi invece mancano anche di quell’ossigeno e quindi, dopo aver legato i nucleotidi all’estremità 5’ non permettono alla catena di allungarsi dalla parte 3’.

Quando la DNA polimerasi comincia a sintetizzare i vari nucleotidi a partire dal primer, può accadere che (nell’esempio in cui serva un’adenina) nella provetta che contiene ddATP venga attaccato questo al posto del dATP: la catena non può più allungarsi. In questo modo si creano nelle varie provette pezzetti di DNA che terminano ognuno in un punto differente della catena. Attraverso un’analisi elettroforetica di ogni provetta, si viene ad evidenziare la diversa lunghezza dei segmenti e la loro velocità di sedimentazione: mettendo i dati in ordine si ottiene una sequenza delle basi nucleotidiche.

Ottenuta la sequenza di DNA è possibile costruire appositi inneschi per delle DNA polimerasi che sintetizzeranno cloni di pezzi di DNA. Costruire inneschi non è dispendioso, ma lo è dover ogni volta fornire nuove DNA polimerasi (infatti, durante la denaturazione ad alte temperature, si perde la DNA polimerasi): il problema fu risolto grazie ad uno studio sui batteri termofili (Thermus aquaticus), in cui la DNA polimerasi risultava resistente alle alte temperature.

Tecniche di localizzazione dell’RNA

Ibridazione in situ

L’ibridazione in situ serve a determinare in quale sito sia attivo un determinato gene. Come funziona? Dopo che è stato individuato il particolare frammento di DNA interessante, questo viene prodotto in grande quantità con le tecniche appena descritte, ed il gene che contiene viene trattato con enzimi di restrizione ed isolato. Quindi viene denaturato e reso radioattivo: quando viene introdotto nelle cellule, il cDNA radioattivo si legherà soltanto là dove è presente un mRNA complementare.

Quindi in un organismo in fase di gastrulazione, sarà possibile seguire (grazie alla radioattività) gli spostamenti delle cellule che hanno accumulato un certo tipo di mRNA e quindi certe proteine.

Northern blot

Prima di parlare del Northern blot, è necessario parlare di DNA blotting o Southern blotting, dal nome dell’inventore di questa tecnica (esperimenti di adsorbimento di DNA su carta da filtro). Il senso di questi esperimenti era quello di verificare se i geni presenti in un certo organismo fossero presenti anche in un altro, in forma se non proprio identica, almeno molto simile. Vengono isolati, ad esempio da un coleottero, frammenti di DNA trattati con enzimi di restrizione e posti su gel, dove si separano per elettroforesi e sono denaturati. Attraverso un sistema di carte da filtro, il DNA si fissa sulla carta. I frammenti, se trattati con cDNA radioattivo preso da un altro organismo, in questo caso da Drosophyla, possono mostrare forte affinità con i cDNA di un’altra specie, cioè ibridarsi con essi (grazie ad un ambiente che limita la rigorosità dell’ibridazione, altrimenti impossibile).

Questo ha dimostrato che vari geni sono simili per le differenti specie di individui, e quindi si sono potuti realizzare esperimenti e studi sulla genetica di invertebrati che hanno portato vantaggi per i vertebrati. Mentre i Southern blot trasferiscono frammenti di DNA dal gel sulla carta, i Northern (detti così solo per un gioco di parole) trasferiscono gli RNA. Dopo aver trasferito su carta alcuni mRNA prelevati in un particolare momento cellulare, la carta è incubata in una soluzione che contiene frammenti radioattivi di DNA di un particolare gene. Se questo gene è presente nello stesso momento dello sviluppo in cui è stato fatto il prelievo di mRNA, avviene l’ibridazione. Prelievi fatti nello stesso punto della cellula in stadi differenti mostrano grazie a questa tecnica l’ordine di attivazione dei geni nella cellula. Questo utilizzo in particolare è detto Northern blot dello sviluppo.