Riassunto esame Analisi dei farmaci biotecnologici, prof. Regazzoni

PROBLEMI:

Creare un analizzatore in grado di effettuare una scansione

• selezionare ioni a diverso m/z cambiando una variabile strumentale in



modo facile e veloce analisi qualitativa, identificazione degli analiti



sulla base del loro peso molecolare

Disporre di un rivelatore in grado di rispondere in maniera proporzionale

• al numero di ioni selezionati dall’analizzatore

misurare la concentrazione degli analiti analisi quantitativa

 

Creare un sistema di introduzione campione ( sorgente, interfaccia )

• gli analiti in fase gassosa e trasformarli in ioni l’apparato di

Portare 

Thompson funziona sottovuoto e a basse concentrazioni di ioni (fase

gassosa)

Sorgente: ionizzazione elettronica (EI)

Caratteristiche:

Il campione è un gas o viene vaporizzato per desorbimento termico

 (vuoto e calore)

Una volta allo stato gassoso, l’analita attraversa un fascio di elettroni (e )

-

 generati dal filamento di tungsteno L’analita subisce eiezione (o

cattura) di elettroni (e ) e

-

spesso frammenta in specie

ioniche (radical-cationi/anioni)

e neutre

Vantaggi e svantaggi:

Ionizzazione universale non richiede presenza di struttura chimica

 

particolare es. cromofori/fluorofori perché le molecole rispondano

Ionizzazione "hard" la frammentazione, può rendere difficile

 

l’identificazione del peso molecolare delle molecole

Adatto per composti piccoli (< 800 Da), volatili o gassosi e termicamente

 stabili

Principale sistema fino agli anni ’80 (ancora oggi per GC-MS)



Analizzatore: settore magnetico

Caratteristiche:

Come i fotomoltiplicatori da spettroscopia il fascio di ioni può essere

 trasformato in un segnale elettrico per emissione di elettroni da un

catodo posto in un tubo sottovuoto

Gli elettroni vengono accelerati all’anodo applicando una differenza di

 potenziale e il segnale può essere moltiplicato attraverso dinodi

Vantaggi e svantaggi:

È possibile effettuare una calibrazione: aumentando il potenziale di

 accelerazione degli elettroni si può ottenere lo stesso segnale per una

soluzione standard anche se il catodo si usura (affaticamento) risposta

strumentale quantitativa

Lo spettro di massa

(ionizzazione elettronica, spettro di massa

dell’acido benzoico)

PROBLEMI:

1. La frammentazione indotta dalla sorgente consente di avere

informazioni strutturali solo se il campione è puro

molecole labili come aminoacidi non mostrano ioni molecolari e le



macromolecole non ionizzano impossibile identificare molecole labili,



impossibile identificare composti in miscela, impossibile analizzare

biopolimeri (proteine, DNA)

2. L’ analizzatore necessita di un magnete potente

strumento ingombrante e costoso pericolo di esposizione prolungata

 

dell’operatore a campi magnetici intensi

Vantaggi e svantaggi:

La matrice può essere opportunamente modificata

 aggiunta di acidi come ad esempio l’acido trifluoroacetico favorisce la



protonazione di gruppi basici degli aminoacidi (lisina, arginina e gruppi N

terminali) la risposta può essere modulata per aumentare la sensibilità



Vaporizzazione (per desorbimento) e ionizzazione "soft"

 molecole labili come aminoacidi non frammentano Adatto ad es. per

 

peptidi, piccole proteine, altri biopolimeri (fino a circa 5000)

Il campione deve essere depositato

 analisi "pulsata": deposito, bombardo e acquisisco inadatto ad un

 

accoppiamento con strumenti separativi operanti in continuo

(cromatografi)

MALDI

Caratteristiche:

Il campione, come nelle sorgenti FAB, viene depositato su una superficie

 con una matrice che però è solida

Partendo da una soluzione si può miscelare il campione con una

 soluzione contenente la matrice, depositare una goccia di soluzione

analita + matrice e evaporare il solvente

Il campione depositato con la matrice viene colpito da un raggio laser

 Gli analiti e la matrice desorbono (sublimazione) dalla superficie e la

 matrice trasferisce (o cattura) protoni agli (o dagli) analiti in fase

gassosa (ionizzazione) Vantaggi e svantaggi:

Vaporizzazione (per

 desorbimento) e

ionizzazione "soft"

molecole labili come



aminoacidi non frammentano Adatto anche per proteine ad alto peso



molecolare

La matrice può essere opportunamente modificata

 si usano composti solubili, che assorbono la lunghezza d’onda del laser



(solitamente 337 nm) e che possono trasferire protoni in fase gassosa

(es. acido sinapinico, acido 2,5-diidrossibenzoico) la risposta può



essere modulata per

aumentare la sensibilità

(fmol-pmol)

Nessuna/bassa

 interferenza da sali

inorganici/tamponi

volatili e non

Il campione deve essere

 depositato

analisi "pulsata":



deposito, bombardo e

acquisisco inadatto



ad un accoppiamento

con strumenti separativi

operanti in continuo

(cromatografi)

Il campione deve essere

 depositato

il laser permette la



ionizzazione di aree con

una elevata precisione

2.94 µm adatto per



tecniche di imaging

(IMS) di tessuti

ESI

Caratteristiche:

Il campione in soluzione acquosa (o in altro solvente dove si creano

 soluzioni elettrolitiche in grado di condurre elettricità) viene fatto flussare

all’interno di un capillare metallico a cui è applicata una differenza di

potenziale rispetto all’analizzatore

La soluzione all’uscita del capillare è nebulizzata utilizzando gas inerte

 che può essere a temperatura ambiente o riscaldato

L’aerosol è diretto verso l’ingresso dell’analizzatore e risucchiato dal

 vuoto

Caratteristiche:

Durante il passaggio nel capillare il voltaggio favorisce la protonazione o

 deprotonazione di molecole con gruppi acidi o basici (anche deboli)

In presenza di sali le molecole possono cationizzare (associarsi a cationi

 invece che a protoni)

Si creano goccioline in cui la carica netta non è più neutra ma prevalgono

 cariche positive (capillare carico positivamente) o negative (capillare

carico negativamente)

Stabilità di una gocciolina carica,

Forza di repulsione elettrostatica = tensione superficiale

Relazione tra numero Massimo di cariche (z) e raggio della goccia (r)

 2 2 2 3

ϵ×

=64

z × e × π × γ × r

Vantaggi e svantaggi:

Nessuna ionizzazione necessaria

 le molecole che rispondono sono già ioni in soluzione, si favorisce



solo la migrazione di ioni di carica opposta ad elettrodi opposti, come per

le celle elettrochimiche

"ionizzazione" e vaporizzazione (nebulizzazione) "soft"

 molecole labili come aminoacidi non frammentano Adatto anche per

 

proteine ad alto peso molecolare

Il solvente può essere opportunamente modificato

 si usano soluzioni acquose contenenti agenti modificatori di pH,



solubilità, tensione superficiale scelti opportunamente la risposta può



essere modulata per aumentare la sensibilità e la risposta di analiti

specifici

ad esempio l’aggiunta di 30-50% di solventi organici miscibili in acqua

(es, CH CN, CH OH) abbassa la tensione superficiale e favorisce

3 3

l’evaporazione del solvente

ad esempio l’aggiunta di acidi organici volatili che possono trasferire

protoni favorisce invece l’analisi a ioni positivi

Il campione (liquido) è introdotto in flusso pulsato o continuo

 la sorgente per flussi nell’ordine dei nL/min non necessita di gas e si



chiama nanospray, NSI) adatto ad un accoppiamento con qualsiasi



strumento separativo operante in continuo (cromatografia liquida,

elettroforesi capillare)

Bassa tolleranza a sali inorganici di acidi e basi forti perché:

 a. tendono a saturare la capacità del capillare di "separare" anioni o

cationi deboli di analiti (i sali inorganici sono elettroliti forti)

b. tendono a precipitare in seguito ad evporazione del solvente

c. sopprimono il segnale delle specie cariche di analita "rivestendolo"

(ion suppression)

con ioni di carica opposta

La sorgente ESI produce spesso ioni multicarica (z >1) e consente l’analisi di

molecole a massa elevata anche con analizzatori a intervallo di scansione (m/z)

limitato.

Le proteine possono essere studiate in condizioni denaturanti (spettri con molti

ioni a z >>1) ottima sensibilità ma perdita di informazioni su strutture



supramolecolari

Oppure in condizioni non denaturanti (pochi ioni con z >1) ritenzione di



informazioni su strutture supramolecolari (es. strutture polimeriche).

Es: la mioglobina esiste in diverse forme, come complesso con il gruppo eme

M o come proteina non complessata M . La denaturazione è responsabile

holo apo

della perdita del gruppo eme. La denaturazione della mioglobina M (h) può

holo

essere monitorata in spettrometria di massa con sorgente ESI. Aggiungendo un

denaturante (acido) si nota la comparsa di segnali della forma M e lo

apo

spostamento degli stati di carica verso z maggiori (anche per h), dovuto alla

denaturazione (la proteina si apre ed espone più gruppi ionizzabili). A

denaturazione completa (5 minuti) la forma M (h) non è più identificabile ma

holo

resta solo la forma M apo.

Le proteine possono essere, in opportune condizioni, depositate dopo il

processo di elettrospray (elettrospray deposition, ESD).

Dopo il processo ESD le proteine, se risospese in soluzione, ritengono la loro

attività come dimostrato ad esempio da Morozov e colleghi nel 1999 utilizzando

la fosfatasi alcalina e, recentemente, da Fornari e colleghi usando la

fibronectina (2015).

Il procedimento ESI è (in opportune condizioni strumentali) altamente

conservativo

Spettrometria di massa pt.2

PROBLEMI:

1. La frammentazione indotta dalla sorgente consente di avere

informazioni strutturali solo se il campione è puro

molecole labili come aminoacidi non mostrano ioni molecolari e le



macromolecole non ionizzano impossibile identificare molecole labili,



impossibile identificare composti in miscela, impossibile analizzare

biopolimeri (proteine, DNA)

2. L’ analizzatore necessita di un magnete potente

strumento ingombrante e costoso pericolo di esposizione prolungata

 

dell’operatore a campi magnetici intensi