Riassunto esame Analisi dei farmaci biotecnologici, prof. Regazzoni

Analisi dei farmaci biotecnologici

Analisi: studio e dello sviluppo dei metodi mediante i quali si possono

individuare le specie chimiche presenti in un campione di materia e

determinarne le quantità

Analisi qualitativa: identificazione e caratterizzazione del farmaco

relativamente sia alla struttura chimica sia allo stato fisico

Analisi quantitativa: determinazione della quantità di una o più sostanze

note (analiti) di un campione

Matrice: ambiente in cui è disperso l’analita

L’insulina è il primo farmaco ottenuto attraverso l’ingegneria genetica.

La maggior parte dei biofarmaci utilizzati ad oggi nella pratica clinica sono

proteine terapeutiche come anticorpi monoclonali, citochine, ormoni, proteine

di fusione. Molti di questi agiscono come modulatori della risposta

infiammatoria e/o immunitaria. La struttura

molecolare dipende

dal processo, cioè il

processo produttivo

determina l’unicità

del prodotto.

I farmaci prodotti in

laboratorio

solitamente hanno

un peso molecolare

inferiore ai 600

Dalton. I farmaci

biotecnologici, per la variabilità intrinseca e per la complessità delle tecniche di

produzione, sono particolarmente difficili da caratterizzare e produrre. E la

difficoltà cresce proporzionalmente alla complessità della molecola originatrice.

Dopo la traduzione una proteina viene (solitamente) ulteriormente

modificata dalla cellula:

− Taglio/ rimozione peptide segnale

− Glicosilazione

− Solfatazione, amidazione, ecc.

Necessario un corredo enzimatico specifico



− Assente nelle cellule procariotiche

− Specifico per ciascuna linea cellulare eucariotica

− Non (necessariamente) sotto il controllo del gene interessato

− Dipendente da linea cellulare di produzione e condizioni di coltura

Anche la glicosilazione è un fenomeno complesso: esistono varie forme di

 glicosilazione

− Pattern glucidico micro-eterogeneità glicomica.



Capacità posseduta da una sostanza di indurre una risposta immunitaria. In

generale, con questo termine si indica la proprietà di una molecola di stimolare

il sistema immunitario senza il supporto di un’altra molecola adiuvante.

Anticorpi monoclonali coniugati: ADC

Come creare tali costrutti? Ci sono 3 strategie

1. Utilizzare punti di ancoraggio alcuni amminoacidi che espongono

caratteristiche chimiche peculiari (es. cisteina presenta un tiolo).

2. Coniugazione sitospecifica su amminoacidi non naturali

Controllo se tutto il farmaco si è legato al drug.

Quantità di farmaco non coniugato importante per la sicurezza e per la stabilità

del prodotto. Dopo la coniugazione non ci deve essere farmaco libero e il linker

non deve rilasciare il farmaco nel tempo ma solo al sito bersaglio in seguito a

somministrazione.

Controllo anche dov’è distribuito il citotossico, il DOP influenza l’omogeneità del

prodotto, una distribuzione eterogenea potrebbe portare problemi legati alla

diversa farmacocinetica e tossicologia dei diversi coniugati. Li cisteine hanno

una distribuzione più prevedibile rispetto alle lisine concentrate a livello delle

catene pesanti e leggere dove formano ponti disolfuro

Controllo reazioni di coniugazione (reazioni di precipitazione dopo iniezione) si

ha una determinazione del peso molecolare che è importante per stabilire

l’identità del prodotto e l’assenza di aggregati ad alto peso molecolare (la

presenza di sostituzioni annulla le cariche e favorisce l’aggregazione).

Controllo anche delle tecniche separative per stabilire il punto isoelettrico del

prodotto. Modifiche che influenzano la carica complessiva (coniugazione con il

farmaco, deamidazione, glicazione) possono influenzare il binding, la stabilità e

l’attività. Sono tracciate mediante cromatografia e scambio ionico o

l’isoelettrofocusing capillare o su membrana.

Controllo anche il DAR ovvero il numero medio di molecole di farmaco

coniugate all’anticorpo. Fondamentale per la sicurezza e l’efficacia della

preparazione in quanto determina il “payload” distribuito al bersaglio.

Faccio anche un sequenziamento e mappatura delle modifiche post

traduzionali. È importante per stabilire mediante caratteristiche strutturali

importanti (ponti disolfuro, siti di coniugazione e glicazione, modifiche post

traduzionali, ecc…), l’identità dell’anticorpo e la riproducibilità del processo di

produzione.

Cromatografia

Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che hanno lo scopo di

separare una miscela nei suoi componenti, per permetterne il

riconoscimento (analisi qualitativa) e il dosaggio (analisi quantitativa).

Queste tecniche sono basate sulla differente ripartizione o diffusione o

interazione (in base al tipo di cromatografia si sfruttano differenti principi

chimico fisici) di molecole con diverse proprietà chimico-fisiche (dette analiti)

fra due fasi, una chiamata fase stazionaria e l’altra chiamata fase mobile o

eluente, che fluisce in continuo attraverso (o a contatto con) la fase fissa.

Possono essere usate per fini separativi (purificazione, frazionamento) o

• per fini analitici. Le analisi sono (quasi) sempre distruttive in quanto gli

analiti vengono solitamente (ma non sempre) distrutti dal detector.

Le tecniche cromatografiche operano esclusivamente su campioni in

• soluzione o in fase vapore: i materiali oggetto di analisi vanno quindi

disciolti in un opportuno solvente. Non è possibile l’analisi senza prelievo

in situ.

di campione né tanto meno l’analisi

Con i moderni strumenti il consumo di campione è minimo. Sono

• sufficienti da 1 ml a 1 µl di soluzione, corrispondenti a meno di 1 mg di

campione solido.

Basi del procedimento cromatografico

La fase mobile (o eluente in forma di gas, liquido o fluido supercritico)

• viene fatta eluire in continuo attraverso (o a contatto con) la fase

stazionaria, che si trova all’interno di una colonna oppure è supportata

su una superficie piana ed è immiscibile nell’eluente

Il campione è introdotto nella fase mobile e da essa trasportato

• attraverso (o a contatto con) la fase stazionaria

i componenti più affini alla fase stazionaria passeranno più tempo in

• questa fase, quindi si sposteranno più lentamente attraverso il sistema

(maggior ritenzione)

i componenti più affini alla fase mobile si sposteranno invece più

• velocemente (minor ritenzione)

Origini della tecnica

Inventata dal botanico russo Mikhail Semenovich Tswett agli inizi del

 XX secolo come tecnica per la separazione di pigmenti fogliari

Egli intendeva separare i pigmenti presenti nella clorofilla; fece un

 estratto di foglie verdi in etere di petrolio, lo depositò in testa ad una

eluì,

colonna di vetro impaccata con carbonato di calcio ed (cioè versò

in continuo) con solfuro di carbonio: i vari pigmenti si separano in

bande colorate, in particolare clorofilla A e B, carotene e xantofilla

Tswett chiamò questa tecnica cromatografia dal greco “scrittura del colore”

Classificazione delle tecniche cromatografiche

Criterio 1: in base allo stato fisico della fase mobile

Cromatografia Liquida (LC): eluente allo stato liquido

 Campione introdotto in forma di soluzione diluita

• La più diffusa, applicata in tutti i campi compreso l’analisi di

• proteine, peptidi e prodotti biotecnologici

Gascromatografia (GC): eluente allo stato gassoso

 Campione introdotto in forma di gas o soluzione diluita che

• viene vaporizzata prima di entrare nel flusso dell’eluente

Molto diffusa per analisi di molecole volatili, scarse

• applicazioni per l’analisi di prodotti termolabili tra cui

proteine, peptidi e prodotti biotecnologici

Cromatografia fluida supercritica (SFC): eluente allo stato

 fluido supercritico

Tecnica emergente per l’analisi di piccole molecole, scarse

• applicazioni per l’analisi di proteine, peptidi e prodotti

biotecnologici

Criterio 2: in base al principio su cui si basa la separazione

Adsorbimento

 Differente capacità degli analiti di instaurare interazioni

• deboli (dipolo-dipolo, legami idrogeno, interazione

idrofobiche) con la fase stazionaria (solida)

Ripartizione

 Differente diffusione degli analiti tra fase mobile e stazionaria

• (liquida)

Scambio ionico

 Differente capacità degli analiti di instaurare interazioni

• ioniche deboli (legame ionico) con la fase stazionaria (liquida)

Affinità

 Interazioni deboli specifiche (tipo farmaco-recettore) della

• fase stazionaria (liquida) con analiti o classi di analiti

specifiche

Esclusione

 Nessuna interazione degli analiti con la fase stazionaria ma

• diversa "accessibilità" alla fase stazionaria dovuta ad

ingombro sterico

Adsorbimento La fase stazionaria è un solido

in granuli e la fase mobile può

essere un gas o un liquido. La

fase stazionaria è in genere un

composto inorganico o un

polimero organico. Sulla

superficie dei granuli si trovano

dei siti attivi che possono

stabilire legami deboli

(interazioni dipolo-dipolo,

legami idrogeno, interazioni

idrofobiche) con gli analiti.

Sulla superficie dell’allumina

sono presenti dei dipoli (cariche

positive e negative) possiamo

avere dei legami di

cordinazione con gruppi amminici, interazioni dipolo-dipolo con

Gruppi carbossilici o interazioni idrogeno con ossido di alluminio.

Ripartizione

La fase stazionaria è un liquido (supportato da un solido granulare inerte). La

fase mobile può essere un gas o un liquido e comunque deve essere

immiscibile con la fase liquida. Durante l’eluizione gli analiti si ripartiscono

(diffusione) nelle due fasi sulla base delle caratteristiche fisico-chimiche (logP,

pKa).

A seconda della natura della fase stazionaria e mobile la cromatografia di

ripartizione si definisce:

In fase normale se la fase stazionaria è più polare della fase mobile

• In fase inversa se la fase stazionaria è meno polare della fase mobile

•

La cromatografia in fase inversa è più comune visti i bassi costi e la bassa

tossicità legata all’impiego di solventi polari (acqua, alcoli, acetonitrile sono i

solventi più comuni)

La ripartizione degli analiti dipende anche dalle loro costanti di dissociazione

acida (sarebbe più corretto parlare di distribuzione tra le fasi). Esempio di

cromatografia in fase inversa con fase mobile acquosa di un analita acido HA:

Scambio ionico

La fase stazionaria è costituita da macromolecole con gruppi ionici, cationici

o anionici (es. R-NH3+, R-SO3-) in grado di trattenere analiti carichi (con

carica di segno opposto) che possono essere poi eluiti per spiazzamento

(scambio) con ioni della stessa carica presenti nella fase mobile. La

ritenzione dipende dalla forza delle interazioni ioniche che si instaurano tra gli

analiti e la fase stazionaria.

La cromatografia a scambio ionico è impiegata per la separazione di sostanze

ioniche o ionizzabili.

Affinità

Si utilizzano interazioni deboli simili a

reazioni di tipo biochimico reversibili e

molto specifiche (es. antigene-

anticorpo, farmaco-recettore), in

modo che le molecole da separare

interagiscano selettivamente con la

fase stazionaria e si ottenga così

l’eluizione selettiva di alcuni

componenti della miscela.

La cromatografia di affinità è

impiegata nella separazione di

molecole di interesse prevalentemente biochimico.

Esclusione

Tecnica per la separazione di molecole in base alle

dimensioni (raggio idrodinamico).

La fase stazionaria è un solido poroso o, più

comunemente, un gel con pori di dimensioni

variabili. Analiti con raggio idrodinamico inferiore al

diametro dei pori penetrano nei pori stessi,

seguendo un percorso più lungo rispetto a

molecole troppo grandi che vengono "escluse" (da

qui il nome cromatografia di esclusione) dai pori e

perciò escono dalla colonna in tempi inferiori

(tragitto più breve).

cromatografia di esclusione

Si parla di

dimensionale (size exclusion chromatography,

SEC) Gel permeazione per la separazione di

 sostanze insolubili in acqua

Gel filtrazione per la separazione di sostanze solubili in acqua



Questa tecnica ha la capacità di separare molecole che hanno una differenza di

peso molecolare nell’ordine dei 10 Kda.

La separazione non si basa su interazioni della fase stazionaria con gli analiti

che deve, anzi, essere evitata modificando la fase mobile (es. pH, forza ionica)

per impedire interazioni ioniche o apolari.

I principi che si sfruttano per i prodotti biotecnologici sono:

1. Adsorbimento per prodotti apolari insolubili in acqua, nessun esempio in

ambito biotecnologico

2. Ripartizione per prodotti polari non ionici come peptidi con amminoacidi

neutri o alicosilati

3. Scambio ionico per prodotti polari ionici come proteine o peptidi con

amminoacidi basici o acidi.

4. Esclusione per prodotti con alto peso molecolare come le proteine

5. Affinità per prodotti cui si può disegnare un supporto avente interazioni

deboli specifiche come gli anticorpi

La fase stazionaria

Il supporto più comune alla fase stazionaria è costituito da particelle

sferiche microporose di silice.

La silice non può essere usata con fasi mobili basiche (pH>8-10) o

eccessivamente acide (pH<1-2) in quanto si scioglie.

I materiali polimerici recentemente introdotti come supporto (es. polistrirene

o grafite) sono più stabili a condizioni estreme di pH e temperatura)

Le particelle di gel di silice possono costituire la fase stazionaria per la

cromatografia a fase normale, esclusione molecolare e di adsorbimento

oppure essere il supporto per le fasi legate (fase inversa, scambio ionico,

affinità)

La fase normale su gel di silice

Silanoli liberi: mediamente acidi, a pH 2-3 sono completamente protonati

• a pH>3 si dissociano a gruppi Si-O e possono interagire con composti

-

basici

Silanoli geminiali e viciniali: non acidi possono interagire con composti

• idrofili (ripartizione in fase normale)

silanoli derivatizzati: consentono di cambiare le modalità di interazione

• (scambio ionico, ripartizione, ecc…) o la selettività verso particolari

analiti (es. scambio ionico acido/basico).

Alcune derivatizazioni consentono di realizzare fase stazionarie che

sfruttano diversi principi con interazioni miste o mixed mode (ripartizione

in fase inversa + scambio ionico)

Fase stazionaria con meccanismo misto Cromatografia ad

interazione idrofilica

(HILIC) Eccellente

• ritenzione di

molecole

idrofile ed

eluizione con

solventi da fase

inversa (meno

costosi e

tossici)

Recente utilizzo

• per la

separazione di

biopolimeri

Materiali ad accesso ristretto (restricted access materials, RAM)

Si basano su 2 principi esclusione molecolare+ interazione (es.

• affinità, scambio ionico, ripartizione)

Le macromolecole non interagiscono con la fase stazionaria e sono

• escluse (non ritenute)

Le piccole molecole accedono a dei pori funzionalizzati per

• trattenere classi specifiche di analiti (in base a ripartizione o

scambio ionico ecc..) che possono essere eluite in seguito

modificando la fase mobile per rompere le interazioni.

Criterio 3: in base alla forma del letto cromatografico

Cromatografia su colonna (impaccata, monolitica o capillare)

 la fase stazionaria è contenuta all’interno di un tubo cilindrico

• (colonna), che può essere riempito con materiale sferoidale di

fase stazionaria (colonna impaccata), essere rivestito

(colonna capillare) oppure contenere un unico blocco di

materiale poroso (colonna monolitica)

Manuale o strumentale, usata per fini sia analitici, sia

• preparative

Cromatografia planare (su carta, su strato sottile)

 la fase stazionaria è distribuita su una superficie piana, che

• può essere un supporto cartaceo (cromatografia su carta, PC)

o una lastrina in vetro o altri materiali (cromatografia su

strato sottile, TLC)

Manuale, usata per analisi semplici e veloci

•

Cromatografia planare

Le fasi stazionarie più usate sono

-> il gel di silice e l’allumina per la

cromatografia di adsorbimento (thin layer

chromatography, TLC)

-> la cellulosa per la ripartizione liquido-

liquido (paper chromatography, in questo

caso la fase stazionaria è l’acqua adsorbita sulle

particelle di cellulosa)

Il risultato è visualizzabile sotto forma di macchie colorate, ognuna dovuta ad

un componente della miscela. Il riconoscimento delle sostanze può avvenire

per confronto con miscele standard; in questo caso il parametro che

caratterizza i soluti separati è il cosiddetto Rf o fattore di ritenzione. Per ogni

analita il valore di Rf si ottiene misurando la distanza percorsa dal centro della

macchia e confrontandola con la distanza percorsa dal fronte dell’eluente:

Rf = d / d

analita eluente

Il valore di Rf degli analiti è quindi sempre compreso tra

0 e 1.

I valori ottimali sono compresi tra 0.4 e 0.8

Nel caso le macchie non siano colorate, è possibile ricorrere a due metodi per

visualizzare il risultato della separazione:

1. utilizzare una lampada UV per irraggiare la lastrina, se le sostanze

separate non assorbono la luce visibile ma assorbono nell’ultravioletto (l

< 400 nm); può essere necessario addizionare alla fase stazionaria o alla

fase mobile un indicatore di fluorescenza che permette di localizzare le