riassunti genetica molecolare

Meccanismi di riparazione del DNA nei eucarioti

Negli eucarioti, il meccanismo è analogo, tuttavia le DNA translesione sono numerose: β, θ, η, ζ, ι, κ, λ, μ, ν. Sono tutte mutagene tranne la η, in quanto, se c'è un dimero di timina, inserisce due adenine. Anche in questo caso, si ha la DNA polimerasi canonica ε/δ bloccata alla lesione insieme al complesso PCNA (β-clamp), il quale tramite ubiquitinazione sostituisce la DNA pol canonica con una di translesione. Quest'ultima inserisce nucleotidi casualmente, poi, viene sostituita da un'altra DNA pol translesione, che allungherà il filamento, così quando verrà sostituita dalla DNA pol ε/δ, essa non toglierà i nucleotidi inseriti in modo sbagliato, avendo attività di proof-reading.

Un altro meccanismo è il processo di ricombinazione, dove si ha il recupero della forca bloccata. Può essere strand exchange, BIR, switch di templato e la...

Reversione delle forche.

DISEGNO

Nello strand exchange, si ha la forca bloccata alla lesione, invece, il filamento non danneggiato prosegue con la replicazione. Per continuare la replicazione anche sul filamento danneggiato, interviene una DNA primasi, che fa un secondo primer, saltando la lesione e permettendo la continuazione della replicazione. Tuttavia, si è generato un gap che deve essere riempito: viene riempito tramite la ricombinazione omologa. Si formano così le giunzioni di Holliday, che vengono, poi, tagliate dalle resolvasi, ripristinando così la forca replicativa. Questo meccanismo è error free.

DISEGNO

Un altro meccanismo è il BIR, break induced repair. In questo caso, si ha un nick sulla forca replicativa, che è pericoloso perché genera dei pezzi di DNA replicati che vengono staccati e si ha il collasso della forca replicativa. Per ristabilire la forca, il segmento parzialmente riparato si infila in un filamento double strand.

completamente replicato. Si formano le giunzioni di Holliday, poi, vengono tagliate dalle resolvasi, ripristinando così la corretta forca replicativa. Anche questo meccanismo non è mutageno. DISEGNO Un altro processo per ristabilire la forca bloccata alla lesione è il template switching, in cui in seguito alla lesione, i filamenti di neosintesi perdono l'annealing con il filamento stampo e si annealinano tra di loro. Superata la lesione, i filamenti di neosintesi ri-annealinano al loro filamento stampo d'origine, ristabilendo così la forca replicativa. DISEGNO L'ultimo meccanismo coinvolto è quello della forca regressa, si ha sempre una lesione al DNA, l'elica di neosintesi che ha come filamento stampo quello lesionato forma una forca regressa, perdendo l'annealing con l'elica stampo. L'elica di neosintesi è usata come stampo per superare la lesione. Si formano degli intermedi a legami a idrogeno che vengono

tagliati dalle elicasi che stabiliscono la corretta forca replicativa. Nell'uomo c'è la famiglia di elicasi RecQ, di cui fanno parte WRN, BLM e RecQ4, mutazioni nelle elicasi causano delle patologie. Il lievito possiede solo Sgs1.

Meccanismo per bypassare blocco della forca replicativa dopo la lesione

La molecola di DNA è una molecola piuttosto stabile, tuttavia, è soggetta a delle lesioni che possono essere provocate da agenti endogeni, quali, ad esempio, la DNA polimerasi, e da agenti esogeni, come i raggi UV. Una volta danneggiata, la molecola di DNA può essere riparata tramite specifici meccanismi. La cellula, oltre di meccanismi di riparazione, dispone di meccanismi che non riparano la lesione, ma permettono alla cellula di sopravvivere, in modo da avere più tempo per riparare la lesione. Questi sono definiti meccanismi di tolleranza alla lesione, di cui fanno parte quei processi che prevedono il recupero della forca bloccata.

DISEGNO

Nello strand exchange, si ha la forca bloccata alla lesione, invece, il filamento non danneggiato prosegue con la replicazione. Per continuare la replicazione anche sul filamento danneggiato, interviene una DNA primasi, che fa un secondo primer, saltando la lesione e permettendo la continuazione della replicazione. Tuttavia, si è generato un gap che deve essere riempito: viene riempito tramite la ricombinazione omologa. Si formano così le giunzioni di Holliday, che vengono, poi, tagliate dalle resolvasi, ripristinando così la forca replicativa. Questo meccanismo è error free.

DISEGNO

Un altro meccanismo è il BIR, break induced repair. In questo caso, si ha un nick sulla forca replicativa, che è pericoloso perché genera dei pezzi di DNA replicati che vengono staccati e si ha il collasso della forca replicativa. Per ristabilire la forca, il segmento parzialmente replicato si infila in un filamento double strand completamente replicato. Si formano

Le giunzioni di Holliday, poi, vengono tagliate dalle resolvasi, ripristinando così la corretta forca replicativa. Anche questo meccanismo non è mutageno.

Un altro processo per ristabilire la forca bloccata alla lesione è il template switching, in cui in seguito alla lesione, i filamenti di neosintesi perdono l'annealing con il filamento stampo e si annealinano tra di loro. Superata la lesione, i filamenti di neosintesi ri-annealinano al loro filamento stampo d'origine, ristabilendo così la forca replicativa.

L'ultimo meccanismo coinvolto è quello della forca regressa, si ha sempre una lesione al DNA, l'elica di neosintesi che ha come filamento stampo quello lesionato forma una forca regressa, perdendo l'annealing con l'elica stampo. L'elica di neosintesi è usata come stampo per superare la lesione. Si formano degli intermedi a legami a idrogeno che vengono tagliati dalle elicasi.

cheristabiliscono la corretta forca replicativa. Nell'uomo c'è la famiglia di elicasi RecQ, di cui fanno parte WRN, BLM e RecQ4, mutazioni nelle elicasi causano delle patologie. Il lievito possiede solo Sgs1.5. RecQ elicasiIl nome deriva da RecQ di E.coli. Il lievito S. cerevisiae possiede solo Sgs1. In S. pombe è presente Rgh1. Nell'uomo c'è la famiglia di elicasi RecQ, di cui fanno parte WRN, BLM RecQ4, RecQ1 e RecQ5. Sono coinvolte nella reversione delle forche, uno dei meccanismi di Recombinational repair, che è uno dei sistemi di tolleranza alla lesione del DNA. Non ripara la lesione al DNA, ma permette alla cellula di superare il blocco della replicazione e sopravvivere. Mutazioni sull'elicasi comportano diverse patologie. Un malfunzionamento, in particolare di RecQ4, causa la sindrome di Rothmund-Thomson, che è una malattia autosomica recessiva il cui fenotipo è bassa statura, alopecia ed elevata insorgenza di tumori.Mutazioni,

Invece, sulla proteina BLM causano la sindrome di Bloom, che è autosomica recessiva e che determina immunodeficienza, difetti di crescita, elevata incidenza di tumori e infertilità. In questi pazienti, a causa di una lesione sul DNA, per ripristinare la corretta forca si ha la formazione di una forca regressa. L'elica di neosintesi ha come filamento stampo quello lesionato e forma una forca regressa, perdendo l'annealing con l'elica stampo. L'elica di neosintesi così è usata come stampo per superare la lesione. Si formano degli intermedi a legami a idrogeno che vengono tagliati dalle elicasi che ristabiliscono la corretta forca replicativa. A causa di un malfunzionamento di BLM, la forca non completa la replicazione del DNA, in quanto si formano gli intermedi e non vengono tagliati dall'elicasi: c'è un accumulo di intermedi crociati di DNA che risultano essere tossici. In questi pazienti, inoltre, sono state osservate

telomeri a causa della mancanza o della disfunzione della proteina WRN. Ciò porta a un accorciamento progressivo dei telomeri e a un invecchiamento cellulare accelerato. Le mutazioni nel gene WRN possono essere di diversi tipi, tra cui mutazioni missenso, splicing, frameshift e nonsenso. Le mutazioni missenso causano la sostituzione di un singolo amminoacido nella proteina WRN, compromettendone la sua funzione. Le mutazioni di splicing influenzano il processo di maturazione dell'mRNA, portando alla produzione di una proteina WRN difettosa. Le mutazioni frameshift causano l'inserimento o la delezione di nucleotidi nel gene WRN, alterando la sequenza di amminoacidi nella proteina WRN. Le mutazioni nonsenso portano alla produzione di una proteina WRN incompleta e non funzionante. Nonostante le mutazioni nel gene WRN, la sindrome di Werner non è letale e i pazienti sopravvivono fino a un'età relativamente giovane. Tuttavia, l'inattivazione parziale o totale della proteina WRN causa l'invecchiamento precoce e l'insorgenza di patologie come l'osteoporosi, la cataratta e i capelli grigi. La morte dei pazienti avviene solitamente prima dei 50 anni a causa di cancro o malattie cardiovascolari. La proteina WRN è essenziale per il mantenimento della lunghezza dei telomeri e per la prevenzione della formazione dei G-quadruplex. Nei pazienti Werner, la telomerasi è presente ma non riesce ad allungare i telomeri a causa della mancanza o della disfunzione della proteina WRN. Ciò porta a un accorciamento progressivo dei telomeri e a un invecchiamento cellulare accelerato.

Telomeri a causa della presenza dei G-quadruplex. I G-quadruplex sono dei legami planari intra e intermolecolari tra guanine (i telomeri sono ricchi di G) e questi complessi rendono i telomeri inaccessibili alla telomerasi. Nei pazienti Werner non sono state trovate mutazioni missenso, al contrario dei pazienti Bloom. Questo perché la proteina WRN ha due domini, uno elicasico e uno nucleasico, affinché si abbia la patologia con una mutazione missenso, si doveva avere una mutazione su entrambi i domini e ciò risulta essere un evento molto raro.

Meccanismo di scelta tra HR ed NHEJ 5. Un danno particolare è la rottura della doppia elica, che può essere sia un danno primario che un danno secondario. Quando si è in questa situazione intervengono diversi meccanismi, uno di questi è NHEJ. Se le estremità del DNA sono piatte o protruding, ma di pochi nucleotidi, allora, agisce NHEJ. Interviene la DNA ligasi 4 che catalizza il ricongiungimento.

delle estremità, dimero Ku, composto da Ku70 e Ku80, e il complesso MRX (MRN) che fa da ponte intermolecolare, tiene vicine le due estremità di DNA (end tethering). Il dimero Ku carica la DNA ligasi 4 sul DNA. In lievito, il complesso MRX è formato dalle seguenti subunità: Xrs2 è deputata a portare le altre subunità nel nucleo, Mre11 ha attività sia endonucleasi che esonucleasi, con polarità 3'->5', infine, c'è Rad50 che è un'ATPasi, quindi, è in grado di idrolizzare l'ATP, e ha due domini Walker A e B, costituiti da α elica, che si ripiegano, formando la struttura coil-coil antiparallelo, all'apice di questa struttura c'è zn-hook ossia due cisteine che legano un atomo di zinco (cisteina-xx-cisteina). Il complesso MRX, in realtà, è esamerico, quindi, ci sono due unità per ogni elemento e soltanto in questa forma è funzionante. Rad50,

infatti, può idrolizzare l'ATP soltanto se è sotto forma di dimero. Nell'uomo, il complesso si chiama MRN ed è formato da MRE11, RAD50 e NBS1. Per mantenere vicino le estremità rotte