riassunti genetica molecolare

Ber e NER + patologie

La molecola di DNA è una molecola piuttosto stabile, tuttavia, è soggetta a delle lesioni che possono essere provocate da agenti endogeni, quali, ad esempio, la DNA polimerasi, e da agenti esogeni, come i raggi UV. Una volta danneggiata, la molecola di DNA può essere riparata tramite specifici meccanismi. Uno di questi è Base Excision Repair (BER), che è un meccanismo di riparazione che riconosce le basi alterate o la presenza di uracile. Si ha su uno dei due filamenti una base alterata, che viene riconosciuta dalla glicosilasi, che taglia il legame base-zucchero, lasciando un sito apurinico o apirimidinico (sito AP). A questo punto, interviene un'endonucleasi che taglia in direzione 5’→3’, in corrispondenza del sito AP, lasciando la terminazione 5' P. Poi, agisce un’esonucleasi, la desossiribosiofosfodiesterasi, che rimuove il desossiribosiofosfato. Infine, intervengono la DNA polimerasi e una DNA ligasi, in modo da inserire i nucleotidi mancanti e ripristinare il filamento corretto.

Questo meccanismo ha dei limiti: ci devono essere tante glicosilasi in grado di riconoscere le diverse basi alterate e la lesione deve essere solo su uno dei due filamenti, poiché, altrimenti, la DNA polimerasi non può introdurre i nucleotidi corretti.

Un secondo meccanismo che può intervenire è il Nucleotide Excision Repair (NER), che non riconosce il mismatch, ma danni piuttosto rilevanti, come il dimero di pirimidina. Questo meccanismo è presente sia nei procarioti che negli eucarioti e ha lo scopo di eliminare il pezzo di filamento in cui è presente la lesione, non solo il nucleotide errato come nel BER. In generale, intervengono, innanzitutto, due endonucleasi, con polarità opposta, che tagliano il filamento che porta la lesione. Agisce, poi, un’elicasi che rimuove il filamento a single-strand che si è generato. Infine, intervengono la DNA polimerasi e la DNA ligasi che riempiono il gap che si è generato, inserendo e legando i nucleotidi corretti.

In E. coli, ci sono tre proteine coinvolte: UvrA, UvrB e UvrC. UvrA è un dimero che insieme a UvrB riconosce la lesione e si lega al DNA lesionato. Questo complesso ha una debole attività elicasica, la quale potrebbe essere coinvolta nel meccanismo di riconoscimento della lesione: il complesso apre un po’ la doppia elica e valuta la capacità di riappaiamento. Dopo il legame sul DNA, il dimero si dissocia e UvrC si lega a UvrB: sono delle endonucleasi che tagliano il DNA, UvrC taglia 7 nucleotidi a monte, mentre UvrB taglia 4 nucleotidi a valle. Poi interviene l’elicasi II, per rimuovere il filamento a single strand. Infine, la DNA Polimerasi I e la DNA ligasi ricompongono il filamento.

Questo meccanismo è presente anche in S. cerevisiae: Rad14 riconosce la lesione, Rad2 e il complesso Rad1-Rad10 sono le endonucleasi.

Nell’uomo, invece, XPA e XPC riconoscono la lesione, XPB e XPD, che fanno parte del complesso TFIIH, sono le elicasi, XPG e XPF sono, invece, le endonucleasi, le quali tagliano dove c’è il passaggio da singolo a doppio filamento. La DNA polimerasi δ o ε, con PCNA e RFC (che aumentano la processività della DNA polimerasi), interviene per riparare correttamente il filamento.

Si è visto che il NER funziona sia nelle zone trascritte che non, tuttavia, la sua capacità riparativa è aumentata in quelle trascritte: questo processo è denominato TCR, Trascrizione accoppiata alla riparazione. In E. coli, c’è il complesso TRCF si lega all’RNA polimerasi, che la fa staccare e richiama il NER. Nell’uomo, invece, ci sono CSA e CSB che richiamano il NER nelle zone trascritte. Mutazioni di questi fattori causano la sindrome di Cockayne. I pazienti affetti da questa patologia hanno il NER funzionante, ma hanno dei difetti trascrizionali e replicativi: si ha la lesione, se l’RNA polimerasi si stacca, si diminuisce l’efficienza con cui il gene viene trascritto. Il NER, quindi, funziona, ma si ha un difetto trascrizionale, per questo il fenotipo è un difetto di crescita. Si è, inoltre, ipotizzato che i due fattori abbiano un altro ruolo: quello di mantenere il complesso replicativo attaccato al trascritto, in modo che, una volta riparata la lesione, la trascrizione continui.

Un’altra patologia è la Tricotiodistrofia, qui ci sono delle mutazioni nelle elicasi (complesso TFIIH = XPD e XPB). Il fenotipo caratteristico di questi pazienti è la fragilità dei capelli. Anche in questo caso si ha il NER funzionante, ma si ha un difetto nella trascrizione. Questi pazienti, inoltre, possono anche avere la xeroderma pigmentoso, la quale è un’altra patologia, in cui, però, qui non si ha il NER funzionante. La Xeroderma pigmentoso è una patologia autosomica recessiva, caratterizzata da elevata sensibilità delle cellule alla luce solare e un’elevata incidenza di tumori della pelle.

Per identificare i geni che causano questa patologia, si sono, innanzitutto, osservate le cellule di pazienti affetti da XP e di persone sane. Queste cellule sono state irradiate, in modo da determinare un danno, che doveva essere riparato dal NER. Si è introdotto un radioisotopo, il quale è incorporato nelle cellule in fase S ed emette radioattività, così impressiona una lastra radiografica. Nei pazienti XP le cellule sono tutte in fase S, in quanto il NER non funziona, al contrario, nelle cellule sane, si hanno dei nuclei in fase S, ma la maggior parte sono in fase di sintesi riparativa, in quanto il NER è funzionante. Allora, si è deciso di determinare quali geni fossero responsabili del NER non funzionante. Si sono prese le cellule di 10 pazienti XP: si avevano così 10 linee cellulari. Prima di fare il clonaggio, si è voluto capire se in tutti pazienti ci fosse lo stesso gene mutato. Allora, si è fatto un test di complementazione: si fondono le linee cellulari 2 a 2 e si valuta se c’è o meno la capacità di fare sintesi replicativa: se le cellule erano in grado di farla, significa che c’è stata complementazione del difetto, quindi, i geni erano diversi. Alla fine, si sono individuati tre gruppi di complementazione, così si sono clonati solo 3 geni.

MMR e HNPCC

La molecola di DNA è una molecola piuttosto stabile, tuttavia, è soggetta a delle lesioni che possono essere provocate da agenti endogeni, quali, ad esempio, la DNA polimerasi, e da agenti esogeni, come i raggi UV. Una volta danneggiata, la molecola di DNA può essere riparata tramite specifici meccanismi. Uno di questi è il MisMatch Repair (MMR). In questa situazione, è importante che il meccanismo di riparazione riconosca correttamente il filamento da riparare, altrimenti si può determinare la comparsa di una mutazione, in quanto non si ripara la lesione: se sul filamento stampo c’è una G, si dovrebbe inserire una C, se, invece, si aggiunge una T si crea un mismatch, quindi, si corregge il filamento che presenta la T, non la G, altrimenti si avrebbe una mutazione GC → GT → AT.

Questo meccanismo è stato studiato in E. coli: per discriminare il filamento su cui agire, si sfrutta una sequenza GATC, la quale presenta l’adenina metilata. Sono coinvolte tre proteine: MutS, MutL e MutH. MutS riconosce il mismatch, MutL ha un ruolo strutturale, invece, MutH è l’endonucleasi. Dopo che MutS riconosce la lesione, intervengono anche MutL e MutH che fanno assumere una conformazione al DNA tale per cui il mismatch si avvicini alla sequenza con l’adenina metilata. A questo punto, MutH fa un nick in corrispondenza della metilazione, ma sul filamento che non presenta l’adenina metilata. Interviene un’esonucleasi, ExoI (3’→5’) o ExoVII (5’→3’), in base che la lesione sia a monte o a valle. La degradazione da parte dell’esonucleasi provoca un gap, per cui, alla fine, intervengono la DNA polimerasi e la DNA ligasi per ricomporre il filamento.

Nell’uomo ci sono degli ortologhi: MLH (MutL) e MSH (MutS). Tuttavia, manca MutH, che era fondamentale, e per il riconoscimento del corretto filamento non c’è una metilazione. Si ipotizza che per discriminare i filamenti si usino i frammenti di Okazaki, che marcano così l’elica di neosintesi, oppure si introduce un uracile, affinché intervenga il BER per riparare, creando dei nick in cui si inseriscono le nucleasi. Mutazioni di MSH2 e MLH1 determinano HNPCC, tumore al colon ereditario. Possono verificarsi diverse mutazioni, come quelle missenso, splicing o nonsenso e la malattia insorge con la mutazione di un solo amminoacido. Ha una penetranza dell’80%, insorge intorno ai 40 anni e si ha una frequenza di 1 su 100. Inoltre, questi pazienti sono caratterizzati da una particolare instabilità di sequenze ripetute, ossia dei microsatelliti. I microsatelliti sono delle ripetizioni di di- o trinucleotidiche, normalmente, variano da individuo a individuo, ma in uno stesso individuo sono costanti, in questi pazienti no, motivo per cui non possono essere tipizzati.

Meccanismo di tolleranza alla lesione

La molecola di DNA è una molecola piuttosto stabile, tuttavia, è soggetta a delle lesioni che possono essere provocate da agenti endogeni, quali, ad esempio, la DNA polimerasi, e da agenti esogeni, come i raggi UV. Una volta danneggiata, la molecola di DNA può essere riparata mediante specifici meccanismi. La cellula, oltre ai meccanismi di riparazione, dispone di meccanismi che non riparano la lesione, ma permettono alla cellula di sopravvivere, in modo da avere più tempo per riparare la lesione. Questi sono definiti meccanismi di tolleranza alla lesione.

Uno di questi è il TLS, Translesion DNA synthesis. È un processo error prone e mutageno attivo, in quanto si avvale di DNA polimerasi non canoniche che possono introdurre nucleotidi errati. In questo modo, si preferisce l’inserzione di una mutazione piuttosto che la morte della cellula, questo anche perché nell’uomo è molto poco probabile che la mutazione finisca in una regione codificante.

Questo processo è presente sia nei procarioti che negli eucarioti. In particolare in E. coli succede così: si ha la lesione al DNA, quando arriva la forca replicativa si ha una replicazione disaccoppiata, in quanto sul filamento che non presenta la lesione la replicazione prosegue, invece, sul filamento danneggiato si arresta. Abbiamo qui bloccata alla lesione la DNA polimerasi III, quella canonica, insieme al complesso β-clamp, che serve ad aumentare la processività della polimerasi e la fa rimanere attaccata al DNA. Poiché con il disaccoppiamento della replicazione, si è formato un filamento a single strand, ad esso si lega RecA, che si attiva e induce un taglio proteolitico di LexA, che è un repressore trascrizionale dei geni SOS, di cui fa parte RecA stesso. L’inattivazione di LexA attiva gli altri geni SOS: umuC e umuD: umuD si attiva e forma un eterodimero (umuD-umuD’) o un omodimero (UmuD’-UmuD’), che è quello attivo, al quale, poi, si lega umuC. Queste sono le subunità della DNA polimerasi non canonica. In E. coli, le DNA polimerasi non canoniche sono la DNA pol IV o V. Una delle due si sostituisce alla DNA pol III, in modo da continuare la replicazione, inserendo dei nucleotidi, anche sbagliati, non avendo l’attiva proof-reading. Poi, questa DNA pol viene nuovamente sostituita con la DNA pol III, ossia quella canonica.

Negli eucarioti, il meccanismo è analogo, tuttavia le DNA translesione sono numerose: β, θ, η, ζ, ι, κ, λ, μ, ν. Sono tutte mutagene tranne la η, in quanto, se c’è un dimero di timina, inserisce due adenine. Anche in questo caso, si ha la DNA polimerasi canonica ε/δ bloccata alla lesione insieme al complesso PCNA (=β-clamp), il quale tramite ubiquitinazione sostituisce la DNA pol canonica con una di translesione. Quest’ultima inserisce nucleotidi casualmente, poi, viene sostituita da un’altra DNA pol translesione, che allungherà il filamento, così quando verrà sostituita dalla DNA pol ε/δ, essa non toglierà i nucleotidi inseriti in modo sbagliato, avendo attività di proof-reading.

Un altro meccanismo è il processo di ricombinazione, dove si ha il recupero della forca bloccata. Può essere strand exchange, BIR, switch di templato e la reversione delle forche.

Nello strand exchange, si ha la forca bloccata alla lesione, invece, il filamento non danneggiato prosegue con la replicazione. Per continuare la replicazione anche sul filamento danneggiato, interviene una DNA primasi, che fa un secondo primer, saltando la lesione e permettendo la continuazione della replicazione. Tuttavia, si è generato un gap che deve essere riempito: viene riempito tramite la ricombinazione omologa. Si formano così le giunzioni di Holliday, che vengono, poi, tagliate dalle resolvasi, ripristinando così la forca replicativa. Questo meccanismo è error free.

Un altro meccanismo è il BIR, break induced repair. In questo caso, si ha un nick sulla forca replicativa, che è pericoloso perché genera dei pezzi di DNA replicati che vengono staccati e si ha il collasso della forca replicativa. Per ristabilire la forca, il segmento parzialmente replicato si infila in un filamento double strand completamente replicato. Si formano le giunzioni di Holliday, poi, vengono tagliate dalle resolvasi, ripristinando così la corretta forca replicativa. Anche questo meccanismo non è mutageno.

Un altro processo per ristabilire la forca bloccata alla lesione è il template switching, in cui in seguito alla lesione, i filamenti di neosintesi perdono l’annealing con il filamento stampo e si annealinano tra di loro. Superata la lesione, i filamenti di neosintesi ri-annealinano al loro filamento stampo d’origine, ristabilendo così la forca replicativa.

L’ultimo meccanismo coinvolto è quello della forca regressa, si ha sempre una lesione al DNA, l’elica di neosintesi che ha come filamento stampo quello lesionato forma una forca regressa, perdendo l’annealing con l’elica stampo. L’elica di neosintesi è usata come stampo per superare la lesione. Si formano degli intermedi a legami a idrogeno che vengono tagliati dalle elicasi che ristabiliscono la corretta forca replicativa. Nell’uomo c’è la famiglia di elicasi RecQ, di cui fanno parte WRN, BLM e RecQ4, mutazioni nelle elicasi causano delle patologie. Il lievito possiede solo Sgs1.

Meccanismo per bypassare blocco della forca replicativa dopo la lesione

La molecola di DNA è una molecola piuttosto stabile, tuttavia, è soggetta a delle lesioni che possono essere provocate da agenti endogeni, quali, ad esempio, la DNA polimerasi, e da agenti esogeni, come i raggi UV. Una volta danneggiata, la molecola di DNA può essere riparata tramite specifici meccanismi. La cellula, oltre di meccanismi di riparazione, dispone di meccanismi che non riparano la lesione, ma permettono alla cellula di sopravvivere, in modo da avere più tempo per riparare la lesione. Questi sono definiti meccanismi di tolleranza alla lesione, di cui fanno parte quei processi che prevedono il recupero della forca bloccata.

Nello strand exchange, si ha la forca bloccata alla lesione, invece, il filamento non danneggiato prosegue con la replicazione. Per continuare la replicazione anche sul filamento danneggiato, interviene una DNA primasi, che fa un secondo primer, saltando la lesione e permettendo la continuazione della replicazione. Tuttavia, si è generato un gap che deve essere riempito: viene riempito tramite la ricombinazione omologa. Si formano così le giunzioni di Holliday, che vengono, poi, tagliate dalle resolvasi, ripristinando così la forca replicativa. Questo meccanismo è error free.

Un altro meccanismo è il BIR, break induced repair. In questo caso, si ha un nick sulla forca replicativa, che è pericoloso perché genera dei pezzi di DNA replicati che vengono staccati e si ha il collasso della forca replicativa. Per ristabilire la forca, il segmento parzialmente replicato si infila in un filamento double strand completamente replicato. Si formano le giunzioni di Holliday, poi, vengono tagliate dalle resolvasi, ripristinando così la corretta forca replicativa. Anche questo meccanismo non è mutageno.

Un altro processo per ristabilire la forca bloccata alla lesione è il template switching, in cui in seguito alla lesione, i filamenti di neosintesi perdono l’annealing con il filamento stampo e si annealinano tra di loro. Superata la lesione, i filamenti di neosintesi ri-annealinano al loro filamento stampo d’origine, ristabilendo così la forca replicativa.

L’ultimo meccanismo coinvolto è quello della forca regressa, si ha sempre una lesione al DNA, l’elica di neosintesi che ha come filamento stampo quello lesionato forma una forca regressa, perdendo l’annealing con l’elica stampo. L’elica di neosintesi è usata come stampo per superare la lesione. Si formano degli intermedi a legami a idrogeno che vengono tagliati dalle elicasi che ristabiliscono la corretta forca replicativa. Nell’uomo c’è la famiglia di elicasi RecQ, di cui fanno parte WRN, BLM e RecQ4, mutazioni nelle elicasi causano delle patologie. Il lievito possiede solo Sgs1.

RecQ elicasi

Il nome deriva da RecQ di E. coli. Il lievito S. cerevisiae possiede solo Sgs1. In S. pombe è presente Rgh1. Nell’uomo c’è la famiglia di elicasi RecQ, di cui fanno parte WRN, BLM, RecQ4, RecQ1 e RecQ5. Sono coinvolte nella reversione delle forche, uno dei meccanismi di Recombinational repair, che è uno dei sistemi di tolleranza alla lesione del DNA. Non ripara la lesione al DNA, ma permette alla cellula di superare il blocco della replicazione e sopravvivere.