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Riassunti di Biologia cellulare

Appunti di biologia cellulare basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. Donati dell’università degli Studi di Firenze - Unifi, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali, Corso di laurea magistrale in biologia. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Biologia cellulare con laboratorio dal corso del docente Prof. C. Donati

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LA SINTESI PROTEICA (fase di trascrizione)

Introduzione alla sintesi proteica ] Ci sono geni che codificano per la formazione di proteine istoniche, le quali

sono fondamentali per tanti aspetti. Ad esempio:

le proteine istoniche assieme al DNA tendono a compattarsi a formare la eucromatina e l'eterocromatina

– le proteine istoniche assieme all'r-RNA formano i ribosomi, gli organuli sede della sintesi proteica

– Studiando nel dettaglio la composizione delle proteine istoniche abbiamo visto che più o meno la loro

sequenza amminoacidica è similare in ogni individuo vivente. Questo non può altro che significare che

anche i ribosomi sono molto simili in ogni individuo vivente. Se infatti andiamo a vedere nel passato,

notiamo che i ribosomi sono strutture altamente statiche dal punto di vista evolutivo, in pratica

possiamo affermare che non hanno subito alcun tipo di cambiamento. Questo è dovuto sicuramente al

fatto che i ribosomi devono effettuare uno dei processi più importanti e complessi che ci sia, ovvero la

sintesi proteica. La sintesi proteica è quel processo unidirezionale che permette al DNA di essere

trascritto di m-RNA (trascrizione), che successivamente viene tradotto in amminoacidi (traduzione).

Gli amminoacidi successivamente andranno a legarsi formando proteine tridimensionali

Differenza fra la sintesi proteica negli eucarioti e procarioti ] Quando si parla di sintesi proteica dobbiamo

considerare che avviene differentemente a seconda che si parli di organismi procarioti o eucarioti. Una cosa

diversa sussiste nel luogo della trascrizione. Infatti:

Negli organismi eucarioti morfologicamente parlando sono costituiti da un nucleo, caratterizzato da una

– membrana nucleare che a sua volta separa il materiale genetico (DNA) dall'ambiente citoplasmatico.

Per questo motivo la fase di trascrizione avviene nel nucleo, mentre la fase di traduzione avviene nel

citoplasma a contatto coi ribosomi. Per poter passare dal nucleo al citoplasma e raggiungere i ribosomi,

ricordo che l'm-RNA trascritto deve passare attraverso i pori nucleari. I pori nucleari sono molto stretti,

e per questo motivo solo gli esoni (tratti codificanti di ridotte dimensioni) riescano a passare, mentre gli

introni (tratto non codificanti di notevoli dimensioni) non riescono a passare. Per questo motivo il

filamento di m-RNA subisce il processo di maturazione, in cui vengono eliminati gli introni.

Con l'eliminazione degli introni l'm-RNA può passare tranquillamente attraverso i pori nucleari e

raggiungere i ribosomi nel citoplasma, andando incontro a traduzione.

Negli organismi procarioti morfologicamente parlando non c'è il nucleo, in quando il DNA si trova

– immerso in una regione casuale del citoplasma che prende il nome di “Nucleoide”. Per questo motivo la

trascrizione e la traduzione avvengono entrambe nel citoplasma, una dietro l'altra. La rapidità della

sintesi proteica in questi organismi è notevolmente maggiore, in quanto non vi è la fase di maturazione.

La rapidità della sintesi proteica è di fondamentale importanza, infatti i batteri per sopravvivere devono

essere in grado di adattarsi il prima possibile alle continue variazioni dei parametri fisici-chimici-

ambientali!! TIPI DI RNA TRASCRITTI A PARTIRE DAL DNA

m-RNA ] sta per “RNA-messaggero”, ed è una molecola a singolo filamento che una volta trascritta va incontro

alla traduzione e quindi alla formazione di amminoacidi. Quest'ultimi poi si legheranno a formare proteine.

Come abbiamo visto prima nei procarioti il singolo filamento di m-RNA viene trascritto nel citoplasma e

– viene tradotto immediatamente dopo sempre a livello citoplasmatico a contatto coi ribosomi

Negli eucarioti invece la presenza del nucleo, fa si che il singolo filamento di m-RNA venga per prima

– cosa trascritto nel nucleo, successivamente maturato (attraverso processo di maturazione, in cui

vengono eliminati gli introni) ed infine vada incontro a traduzione nel citoplasma a contatto coi ribosomi

t-RNA ] sta per “RNA-transfert”, ed è la molecola che partecipa alla traduzione come trasportatore di

amminoacidi (amminoacil-tRNA) e peptidi (peptidil-tRNA). I t-RNA possono essere di 32 tipi diversi, anche se

hanno praticamente tutti la stessa forma e la stessa dimensione, che varia dalle 73 alle 93 paia di basi.

Strutturalmente parlando ogni t-RNA assomiglia moltissimo ad un trifoglio, ma prima di formare questa classica

struttura, il t-RNA deve andare incontro al processo di maturazione.

All'inizio abbiamo la presenza di un singolo filamento di RNA che presenta un estremità 3'OH ed una

– estremità 5'P.

successivamente rimossa una sequenza intronica dall'estremità 5'P

– dopo di che a livello dell'estremità 3'OH, viene trasformato un codone AUU in un codone ACC.

– Questa parte andrà a costituire il sito di legame per l'amminoacido

a questo punto viene rimosso un introne presente in un ansa, formando l'anticodone

– infine vengono modificate alcune basi organiche azotate, formando l'Ansa D e l'ansa T

–

Dopo la fase di maturazione, si sono formati ben quattro steli e anse a doppio filamento. Questi steli e anse si

formano in virtù della complementarietà intracatena che consente a brevi tratti di RNA di interagire fra loro a

formare doppi filamenti. Questi steli sono:

Stelo accettore ] non è altro che un tratto di t-RNA che presenta un estremità libera 3', alla quale

– generalmente di lega l'amminoacido corrispondente alla tripletta dell'anticodone

Ansa D ] è un tratto di t-RNA che presenta la 5,6-di-idrouridina, che rappresenta una uridina ridotta da

– due idrogeni. Ricordo che l'uridina è ribonucleoside, che nello specifico è caratterizzato da un uracile

legato ad una molecola di ribosio

Ansa variabile ] è quella parte di t-RNA che può variare le sue dimensioni. Sulla base del tipo si ansa

– variabile, ricaviamo difatti i 32 tipi di t-RNA conosciuti fino ad ora

Ansa dell'anticodone ] è un tratto di t-RNA formato da tre nucleotidi corrispondenti alla tripletta che

– codifica per l'amminoacido legato allo stelo accettore

Ansa T ] è un tratto di t-RNA che presenta che presenta una ribotimidina

–

r-RNA ] sta per “RNA-ribosomiale”, ed è una molecola a singolo filamento lineare che, può assumere

conformazioni tridimensionale molto complesse. Tale molecola rappresenta l'impalcatura su cui si ancorano le

proteine ribosomiali al fine di formare il ribosoma. Alcuni filamenti di r-RNA

la molecola che si associa alle proteine ribosomiali per formare i ribosomi.

RNA-interference (RNA-i) ] Sostanzialmente dobbiamo sapere che nelle cellule di un mammifero:

una piccola percentuale del DNA va in contro a trascrizione formando m-RNA che a sua volta verrà

– tradotto in amminoacidi

una grande percentuale del DNA produce invece RNA a doppio filamento non codificanti, che

– sembrerebbero i diretti responsabili della complessità funzionale dei nostri meccanismi cellulari.

Questi RNA non codificanti vengono definiti come ncRNA (No Coding RNA) e sono alla base del

meccanismo della “Interferenza a RNA”

L'interferenza a RNA è stato scoperto da Craig Mello e Andew Fire, che per questo vinsero il premio nobel nel

2006. Si tratta praticamente di un meccanismo epigenetico grazie al quale è possibile ottenere una forma di

silenziamento genico, cioè vengono inattivati determinati geni. Questo meccanismo avviene dopo la trascrizione,

in quanto agisce direttamente a livello degli m-RNA.

L'esperimento di Mello e Fire consisteva costruire inizialmente in laboratorio tre RNA differenti:

uno senso (a singolo filamento)

– uno antisenso (a singolo filamento)

– uno a doppio filamento (costituito da un filamento senso ed un filamento antisenso)

–

Inserirono questi tre RNA in tre gruppi differenti di nematodi e videro che nel nematode i qui avevano inserito il

filamento senso o il filamento antisenso, non succedeva nulla. Nei nematodi in cui avevano inserito l'RNA a

doppio filamento si notavano dei movimenti incontrollati dell'animale. Da qui dedussero che solo l'RNA a doppio

filamento era stato in grado di inibire determinati geni che avevano cambiato il comportamento dell'animale.

Ripetettero l'esperimento anche con altri animali, come ad esempio i vermi, ed anche in tal caso i risultati furono

gli stessi. La deduzione fu che quindi c'erano molecola di RNA a doppio filamento in grado di inibire la

trascrizione ed inattivare cosi determinati geni dell'animale.

L'interferenza a RNA si è scoperto poi col tempo che può avvenire in ben tre modalità:

o viene bloccata la traduzione del filamento di m-RNA

– o viene idrolizzato il filamento di m-RNA, che per tanto non può andare incontro a traduzione

– viene promossa la formazione di eterocromatina (avente DNA inattivo, il quale non subisce trascrizione)

–

Determinando il blocco della traduzione o l'idrolisi del filamento di m-RNA trascritto, non si viene a formare

nessuna proteina. Infatti ciò che notiamo visivamente è che abbiamo il DNA e l'm-RNA, ma nessuna proteina.

1 ] Guardiamo come avviene il meccanismo dell'interferenza a RNA attraverso l'idrolisi dell'm-RNA:

inizialmente abbiamo gli ncRNA (No Coding RNA). Gli ncRNA vengono tagliati da un particolare

– enzima del tipo ribonucleasi che prende il nome “Dicer”.

Una volta tagliati gli ncRNA, si formano tanti piccoli frammenti più piccoli chiamati “siRNA”.

– Gli siRNA sono caratterizzati da RNA a doppio filamento, di cui un filamento è detto “filamento

passeggero”, l'altro filamento è detto “filamento guida”

successivamente i siRNA vengono caricati in un complesso proteico chiamato “pre-RISC”.

– Tale complesso proteico è caratterizzato da un proteina argonauta, caratterizzata da tre domini detti

“dominio PAZ”, “dominio PIWI” e “dominio MID”

grazie ai propri domini la proteina argonauta è in grado di interagire coi filamenti di siRNA, nello

– specifico abbiamo che:

- il filamento passeggero viene legato al dominio PAZ e viene tagliato in due parti col conseguente

distacco immediato

- il filamento guida viene legato al dominio MID formando il cosiddetto “Complesso RISC”

- il dominio PIWI non è altro che un canale carico positivamente che attrae i filamenti di siRNA carichi

negativamente)

il complesso RISC ottenuto, a questo punto interagisce con un m-RNA bersaglio. Questo accade grazie al

– fatto che il filamento guida, direziona la proteina argonauta verso un filamento di m-RNA bersaglio.

Una volta che è arrivato a destinazione, la proteina argonauta idrolizza in due parti il filamento di m-

RNA grazie alla propria attività ribonucleasica

l'm-RNA non è quindi più in grado di andare incontro a traduzione, per tanto non può più formare

– amminoacidi. Senza gli amminoacidi non si formano le proteine.

Abbiamo quindi terminato il meccanismo dell'interferenza a RNA!!

–

2 ] Guardiamo come avviene il meccanismo dell'interferenza a RNA tramite il blocco della traduzione dell'm-

RNA: inizialmente abbiamo un filamento di RNA a singolo filamento contente delle basi complementari molto

– vicine che permettano al filamento di ripiegarsi su se stesso formando un RNA a doppio filamento con

un ansa ad una delle due estremità. Tale RNA prende il nome di pri-miRNA

il pri-miRNA è riconosciuto da un complesso multiproteico chiamato “Complesso del Microprocessore”

– che a sua volta è formato da due proteine: la DGCR8 e la Drosha.

Per prima cosa la proteina DCGR8 si lega al pri-miRNA a doppio filamento e riconoscono l'ansa presene

a livello dell'estremità terminale. Successivamente interviene la proteina Drosha che taglia il filamento

di pri-miRNA a livello dell'ansa terminale andando a formare il pre-miRNA

(l'azione del complesso multiproteico del microprocessore avviene completamente nel nucleo)

il pre-miRNA è esportato dal nucleo al citoplasma attraverso i pori nucleari. Questa esportazione è resa

– possibile da proteine come le “Esportine” e le “Proteine Ran GTP”. Infatti le esportine si legano al pre-

miRNA ed interagiscano successivamente con le proteine Ran GTP. Tali proteine vanno incontro a

defosforilazione formando proteine Ran GDP (forma inattiva delle proteine Ran), grazie alla reazione

[Ran GTP → Ran GDP + Pi ]. Tale reazione è fortemente esoergonica. L'energia liberata viene utilizzata

dalle esportine per trasportare i pre-miRNA dal nucleo al citoplasma cellulare

il pre-miRNA una volta arrivato nel citoplasma va incontro ad un processo di maturazione attuato

– dall'enzima Dicer (ribonucleasi), che sostanzialmente lo taglia. Si viene quindi a formare un piccolo

“mi-RNA” a doppio filamento lungo circa 21-24 nucleotidi. Un filamento è detto “filamento passeggero”,

mentre l'altro è detto “filamento guida”

successivamente il mi-RNA viene caricato in un complesso proteico chiamato “pre-RISC”.

– Tale complesso proteico è caratterizzato da un proteina argonauta, caratterizzata da tre domini detti

“dominio PAZ”, “dominio PIWI” e “dominio MID”, con al centro una molecola di magnesio situata nel

sito attivo della proteina, che permette alla proteina argonauta di interagire con altre molecole

sostanzialmente grazie ai propri domini e al sito attivo, la proteina argonauta è in grado di interagire coi

– filamenti di mi-RNA. Nello specifico abbiamo che:

- il filamento passeggero viene legato al dominio PAZ e viene tagliato in due parti col conseguente

distacco immediato

- il filamento guida viene legato al dominio MID formando il cosiddetto “Complesso RISC”

- il dominio PIWI non è altro che un canale carico positivamente che attrae i filamenti di mi-RNA

carichi negativamente)

il complesso RISC a questo punto interagisce con un m-RNA bersaglio. Questo accade grazie al fatto che

– il filamento guida, direziona il complesso RISC verso un filamento di m-RNA bersaglio. Una volta che è

arrivato a destinazione, il filamento guida si lega ad una regione parzialmente complementare del

filamento di m-RNA ed inibisce l'avvio del processo di traduzione

il fatto che sia parzialmente complementare lo si vede dal fatto che, una volta che il filamento guida si è

– legato alla regione dell'm-RNA, si forma una piccola ansa, a manifestare proprio la non totale

complementarietà fra i due filamenti

l'm-RNA non è quindi più in grado di andare incontro a traduzione, per tanto non può più formare

– amminoacidi. Senza gli amminoacidi non si formano le proteine.

Abbiamo quindi terminato il meccanismo dell'interferenza a RNA!!

–

3 ] Guardiamo come il meccanismo dell'interferenza a RNA promuove la formazione di eterocromatina:

la cellula come abbiamo visto precedentemente è in grado di formare determinati tipi di RNA chiamati

– “si-RNA” e “mi-RNA” che sono in grado non solo di inibire la sintesi proteica, ma anche di regolare lo

stato della cromatina. Per “regolazione dello stato della cromatina”, intendiamo dire che viene regolata

la quantità di eterocromatina ed eucromatina presente nella cellula

nello specifico i siRNA inducono una metilazione a livello dei residui di lisina 9 e lisina 27 che

– compongono l'istone H3. Questo comporta una compattazione della cromatina e la formazione

dell'eterocromatina

invece i frammenti di mi-RNA che partecipano a questo processo si legano nelle vicinanze dei residui di

– lisina da metilare dell'istone H3 ed attivano l'enzima “Istone-metil-transferasi” (HMT). Tale enzima è in

grado di metilare i residui di lisina dell'istone H3 inducendo una compattazione della cromatina e la

formazione dell'eterocromatina

l'eterocromatina formata a partire dai si-RNA e mi-RNA viene mantenuta attraverso altre proteine

– come la HP1 e la SWI6 che si associano alla eterocromatina regolando il giusto grado di compattazione

sno-RNA e maturazione dell'r-RNA ] sta per “RNA nucleolari a piccole dimensioni” ed è costituito da corti RNA

a singolo filamento composti da circa 100-300 nucleotidi. Tali sno-RNA sono particolarmente importanti per il

processo di maturazione dell'r-RNA. La maturazione dell'r-RNA avviene in una regione particolare del nucleo

definita come “Nucleolo”. Durante la maturazione dell'r-RNA, quello che succede è che:

inizialmente alcuni filamenti di sno-RNA si associano con proteine ribosomiali portando alla formazione

– di tante piccole molecole chiamate snoRNP (proteine-ribo-nucleiche a piccole dimensioni)

le snoRNP iniziano ad associarsi al r-RNA immaturo, che prende il nome di “pre-r-RNA”.

– Il pre-r-RNA è sostanzialmente formato dagli sno-RNA-U3 ed una dozzina di proteine snoRNP differenti

fra loro

le pre-r-RNA successivamente vengono modificate grazie all'azione enzimatica del complesso

– “Exosoma”, che sarebbe un complesso multienzimatico caratterizzato da ben 12 esonucleasi diverse

a seguito delle modifiche apportate dall'exosoma, come ad esempio la conversione di una uridina in una

– pseudouridina o la metilazione a livello del carbonio C2 del ribosio di un nucleotide, si ha che il

pre-r-RNA diventa un r-RNA maturo

r-RNA maturo può essere di quattro forme differenti negli eucarioti : r-RNA 28s, r-RNA 18s, r-RNA 5,8s

– e r-RNA 5s. Fra queste forme di r-RNA, possono essere formate tutte tranne l'r-RNA 5s, che viene

codificata da un gruppo di geni differenti ad opera direttamente della RNA-polimerasi III.

Questa forma di r-RNA 5s, infatti non subisce alcuna modificazione chimica da parte dell'exosoma!!

r-RNA maturo può essere di tre forme differenti nei procarioti: r-RNA 23s, r-RNA 16s e r-RNA 5s

–

RNA-telomerico ] è una componente strutturale dell'enzima “Telomerasi”

TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI

La trascrizione differentemente dalla replicazione, è un processo che non comprende tutto il DNA, ma è un

evento circoscritto al singolo gene. Inoltre la replicazione è un processo che in alcune cellule non avviene, infatti

ci sono cellule che non proliferano mai, mentre la trascrizione avviene continuamente in tutte le cellule viventi.

La trascrizione nei procarioti avviene interamente nel citoplasma, per via dell'assenza del nucleo. Tale processo è

reso possibile grazie alla presenza di un particolare enzima chiamato “RNA-polimerasi-DNA-dipendente”, detto

generalmente anche “RNA-polimerasi”. L'RNA-polimerasi delle cellule procariote è diverso da quello delle

cellule eucariote. Generalmente quello dei procarioti è un enzima caratterizzato da quattro subunità proteiche:

due subunità alfa (alfa-1 e alfa-2)

– due subunità beta (beta e beta')

–

Talune subunità si legano ad una proteina chiamata fattore-sigma o subunità sigma, ed assieme formano il

cosiddetto “Oloenzima” che permette l'apertura della bolla di trascrizione e l'avvio della trascrizione.

Le due subunità alfa e le due subunità beta sono prevalentemente implicate nella sintesi dell'm-RNA.

Il fattore sigma serve invece per riconoscere il promotore, ossia quella regione del DNA dalla quale ha inizio la

trascrizione. L'enzima RNA-polimerasi ha un attività di Proof reading molto scarsa, per tale motivo fa molti

errori durante la formazione del filamento m-RNA (circa un errore ogni 10000 nucleotidi). Nonostante i molti

errori, tale attività è comunque compatibile con la vita. Inoltre la RNA-polimerasi ricordo che non necessita di

nessun innesco, è sempre processiva ed attiva a svolgere la propria funzione a differenza della DNA-polimerasi

Il processo di trascrizione nei procarioti è caratterizzato da una fase di inizio, di allungamento e di terminazione:

FASE DI INIZIO ] inizialmente il fattore sigma della RNA-polimerasi riconosce il promotore.

Il promotore è una sequenza del DNA procariote molto breve, caratterizzata da due regioni distinte:

la regione meno dieci (regione-10) viene definita anche col nome di “Pribnow box” ed è la regione del

– promotore posizionate a 10 nucleotidi dal punto di inizio della trascrizione. Essa è caratterizzata da 6

paia di basi organiche azotate, tutte adenine e timine. Questa non è una casualità, infatti adenine e

timine sono legate assieme da soli due legami a idrogeno (ricordo che invece citosine e guanine sono

legate da tre legami ad idrogeno), e questo gli permette di essere una regione facilmente despiralizzabile.

Non a caso è proprio in questa regione del promotore che avviene l'apertura del DNA.

la regione meno trentacinque (regione-35), è la regione del promotore posizionata a 35 nucleotidi dal

– punto di inizio della trascrizione

Una volta che il promotore è stato riconosciuto dal fattore sigma, inizia il legame effettivo fra l'RNA-polimerasi e

il promotore.

per prima cosa il fattore sigma riconosce e si lega alla regione -35, formando il cosiddetto complesso

– chiuso, che determina la fase di “Standby”. Nella fase di standby il promotore modica parzialmente la

propria topologia

successivamente il fattore sigma riconosce e si lega alla regione-10, formando il complesso aperto, in cui

– la doppia elica del DNA inizia a despiralizzarsi

al momento in cui il fattore sigma si è legato stabilmente con le regioni -10 e -35 del promotore, si forma

– la cosiddetta “bolla di trascrizione”, che consiste in una sequenza di circa 12 nucleotidi

il fattore sigma interagisce con le subunità alfa-1 e alfa-2 dell'RNA-polimerasi II e si ha la formazione

– dell'oloenzima (fattore sigma + RNA-polimerasi II) che permette l'apertura della bolla di trascrizione e

da il via al processo di trascrizione stesso

FASE DI ALLUNGAMENTO ] una volta che è iniziata la trascrizione l'RNA-polimerasi trascrive solo uno dei

due filamenti di DNA. L'altro filamento non trascritto viene definito come “filamento senso”.

La trascrizione è resa possibile specificatamente dalla subunità beta e dalla subunità beta' della RNA-polimerasi,

che riescano ad allungare il filamento di m-RNA grazie alla nascita di nuovi legami fosfodiesterici che

intercorrono fra particolari nucleotidi attivati, detti “Ribonucleotidi Trifosfati”, i quali invece di avere un gruppo

fosfato, ne hanno ben tre, grazie all'azione catalitica delle pirofosfatasi. Dopo che sono stati polimerizzati una

decina di ribonucleotidi, viene rilasciato il fattore sigma che andrà a riconoscere altri promotori e rimane solo la

RNA-polimerasi attaccata al filamento di DNA. Il filamento di m-RNA continua quindi ad allungarsi fino a che

non andiamo incontro ad uno dei tre fattori di terminazione, quali:

“sequenza di terminazione”, detta anche “sequenza pseudo-palindromica”

– andiamo incontro alla proteina di terminazione Rho

– andiamo incontro ad eventi casuali che causano il distacco precoce dell'RNA-polimerasi dal DNA

–

FASE DI TERMINAZIONE ] la terminazione del processo di trascrizione può avvenire in tre modi:

ad un certo punto durante la trascrizione del filamento di m-RNA andiamo incontro alla sequenza

– pseudo-palindromica. Tale sequenza determina un incurvamento del filamento di DNA che forma una

struttura a forcina molto robusta per via della presenza di guanina e citosina, che si legano tramite

triplo legame a idrogeno. Questa struttura a forcina robusta destabilizza il legame fra il DNA e l'RNA-

polimerasi, che si distacca inesorabilmente. Col distacco della RNA-polimerasi termina anche la

trascrizione. Questo tipo di terminazione prende il nome di “terminazione Rho-indipendente”, perché

non dipende dalla presenza o meno della proteine Rho

ad un certo punto durante la trascrizione, alcuni geni codificano per la formazione di un complesso

– proteico caratterizzato da 6 subunità, detta “Proteina Rho”. Tale proteina si lega al DNA e lo

destabilizza, separandolo dall'RNA-polimerasi. Con il distacco dell'RNA-polimerasi termina la

trascrizione

ci sarebbe anche un terzo modo, molto più raro, in cui in maniera del tutto casuale si formano dei

– complessi di terminazione che distaccano precocemente il DNA dalla RNA-polimerasi. In tal modo viene

terminata la trascrizione e si viene a formare un filamento di m-RNA non funzionale. Per evitare ciò il

nostro organismo sintetizza continuamente delle proteine con funzione “Co-Trascrizionale”, che vanno

di pari passo alla RNA-polimerasi, stando attente a che tutto il processo vada correttamente!!

TRASCRIZIONE DEGLI EUCARIOTI

La trascrizione negli eucarioti avviene interamente nel nucleo. Tale processo è reso possibile grazie alla presenza

di un particolare enzima chiamato “RNA-polimerasi-DNA-dipendente”, detto generalmente anche

“RNA-polimerasi”. Negli eucarioti, l'RNA-polimerasi è diverso da quello delle cellule procariote. Ed inoltre

mentre nei procarioti abbiamo un unica molecola di RNA-polimerasi, negli eucarioti ne abbiamo ben 4 tipi:

RNA-polimerasi I. Tale enzima si trova nel nucleolo e si occupa dell sintesi degli r-RNA

– RNA-polimerasi II. Tale enzima si trova nel nucleo e si occupa della sintesi degli m-RNA,

– RNA-telomerico e alcuni RNA non codificanti come si-RNA e mi-RNA

RNA-polimerasi III. Tale enzima si trova nel nucleo e si occupa principalmente della sintesi del t-RNA

– RNA-polimerasi mitocondriale

–

Per capire la presenza dei quattro tipi di RNA-polimerasi fu fatto un esperimento con l'α-amanitina, una tossina

che prodotta da un fungo chiamato “Amanita falloide”. Tale tossina infatti interagisce in maniera differente con i

tre RNA-polimerasi:

non interagisce quasi per nulla con la RNA-polimerasi I

– è estremamente attiva nei confronti dell'RNA-polimerasi II

– è poco attiva nei confronti dell'RNA-polimerasi III

–

La RNA-polimerasi che interessa a noi nel processo di trascrizione è fondamentalmente la RNA-polimerasi II,

ossia colei che è in grado di trascrivere un filamento di DNA in un filamento di m-RNA

La Trascrizione negli eucarioti abbiamo visto che è resa possibile grazie all'enzima RNA-polimerasi II, che

trascrive un filamento di DNA in un filamento di m-RNA. Il problema è che questo filamento di m-RNA non è

del tutto continuo, ma presenta delle discontinuità, ovvero dei tratti sono molto brevi e codificanti, altri tratti

sono molto lunghi e non codificanti (non codificano per nessuna funzione). I tratti brevi prendono il nome di

“Esoni”, quelli lunghi prendono il nome di “Introni”. Questo è un grosso problema, perché il filamento di

m-RNA, una volta trascritto dalla RNA-polimerasi II, deve passare attraverso i pori nucleari e raggiungere i

ribosomi, per poter essere tradotto. Gli introni però sono troppo lunghi e per ingombro sterico non passano dai

pori nucleari, per questo motivo devano essere eliminati. L'eliminazione degli introni dal filamento di m-RNA è

detto “processo di maturazione”, grazie al quale il filamento di m-RNA potrà essere finalmente in grado di

passare perfettamente attraverso i pori nucleari e raggiungere i ribosomi nel citoplasma cellulare.

La presenza degli esoni e degli introni negli eucarioti è stata vista per la prima volta in assoluta da Chambon nel

1978, grazie al suo esperimento:

Chambon e i suoi collaboratori sfruttarono la funzionalità dell'enzima “Trascrittasi inversa” detta anche

– in gergo “DNA-polimerasi-rna-dipendente”

inizialmente Chambon isolò l'm-RNA citoplasmatico dell'ovoalbumina di pollo tramite un processo di

– estrazione e purificazione

successivamente l'm-RNA citoplasmatico fu fatto reagire con la trascrittasi inversa, ottenendo cosi un

– cDNA (DNA copia)

dopo di che il cDNA fu denaturato ed introdotto equamente all'interno di due provette.

– In una provetta vi era la presenza di m-RNA citoplasmatico. Nell'altra provetta vi è era la presenza di

m-RNA nucleare. Abbiamo quindi due provette contenenti rispettivamente:

[cDNA + m-RNA citoplasmatico ] e [cDNA + m-RNA nucleare ]

Chambon ebbe un idea geniale. Sapeva benissimo che il cDNA e l'm-RNA nelle due provette per via

– dell'energia libera non sarebbero mai potuti reagire e formare conseguentemente degli ibridi.

Per tanto abbassò la temperatura ed utilizzò degli accorgimenti tecnici, riuscendo ad ottenere l'ambiente

ideale nelle provette per poter formare gli ibridi.

A questo punto nelle due provette avremo [cDNA-mRNA citoplasmatico] e [cDNA-mRNA nucleare]

non rimase altro che vedere e studiare nel dettaglio i due ibridi.

– L'ibrido cDNA-mRNA citoplasmatico presentava una doppia elica continua senza punti di discontinuità.

L'ibrido cDNA-mRNA nucleare invece presentava una struttura altamente discontinua caratterizzate da

anse (tratti di DNA di discreta entità) molto lunghe dette “non codificanti” (Introni) e anse più corte

dette “codificanti” (Esoni)

Dalla scoperta di Chambon riuscimmo a capire quindi che il genoma di un organismo eucariote è caratterizzato

da tratti codificanti, molto brevi, detti Esoni e tratti non codificanti, molto lunghi, detti Introni. Gli esoni e gli

introni si intervallano fra di loro formando all'univoco il genoma di un organismo eucariote.

La formazione degli introni, si pensa sia una nota evolutiva per salvaguardarci dalla formazione delle mutazioni

genomiche. Infatti gli introni si comportano metaforicamente da spugne, assorbendo in continuazione grandi

quantità di mutazioni. Questo è dovuto al fatto che essendo molto più grandi rispetto agli esoni, hanno

semplicemente una probabilità maggiore di essere colpiti da mutazioni. Il punto è che una mutazione quando

colpisce un introne non sortisce alcun effetto, poiché l'introne stesso non codifica per nessuna funzione specifica

dell'organismo.

Il processo di trascrizione negli eucarioti è composto da una fase di riconoscimento (detta fase pre-inizio), una

fase di inizio, una di allungamento e una di terminazione. Successivamente abbiamo anche che il filamento di

m-RNA trascritto va incontro alla fase di maturazione e di esportazione per poter decorrere tra i pori nucleari ed

andare nel citoplasma, dove i grazie ai ribosomi potrà essere tradotto in amminoacidi. Abbiamo 6 fasi distinte:

riconoscimento (pre-inizio)

– inizio

– allungamento

– terminazione

– maturazione

– esportazione

–

FASE PRE-INIZIALE ] tutto nasce a partire da determinate regioni del DNA chiamate “Promotori”.

A differenza dei procarioti, in cui vi è un solo promotore per ogni gene, negli eucarioti abbiamo molti più

promotori simultaneamente. Ogni promotore non è altro che una corta sequenza di DNA composta da tre parti:

regione TATA box. Essa è caratterizzata da ripetizioni di timina e adenina (TA) una dietro l'altra.

– Generalmente è situata a 25 nucleotidi di distanza dal punto di inizio della trascrizione

regione CAAT box. Essa si trova a 80 nucleotidi dal punto di inizio della trascrizione

– regione GC box. Essa si trova a 100 nucleotidi dal punto di inizio della trascrizione

–

Inizialmente la regione TATA box viene riconosciuta da particolari proteine dette “Fattori trascrizionali”.

Tali proteine via via che si legano alla TATA box formano un complesso multiproteico che richiama a loro la

RNA-polimerasi II. A questo punto la RNA-polimerasi II si lega a questo alla TATA-box formando il complesso

“Pre-Trascrizionale”. A questo punto il dominio CDT (che rappresenta la coda della RNA-polimerasi II) viene

parzialmente fosforilato. La fosforilazione del dominio CDT è fondamentale perché permette l'attivazione a tutti

gli effetti della RNA-polimerasi II. Tale fosforilazione avviene grazie a due proteine specifiche. Infatti:

inizialmente abbiamo l'intervento della proteina TFIIE. Tale proteina enzimatica è sostanzialmente una

– elicasi. La TFIIE si lega inizialmente al dominio CDT della RNA-polimerasi II, determinando l'apertura

della doppia elica del DNA. Si formano quindi i due filamenti singoli

successivamente abbiamo l'intervento della proteina TFIIH. Tale proteina una volta che la TFIIE ha

– attuato la sua funzione, va ad interagire con l'RNA-polimerasi II fosforilandone una serina in posizione

5' nel dominio CDT. Questa fosforilazione attiva la RNA-polimerasi II, che può iniziare a polimerizzare i

filamento di m-RNA

Una cosa molto importante è che vicino alla regione TATA-box abbiamo la presenza di determinati elementi di

controllo (costituiti da corte sequenze di DNA) che interagiscono con altre proteine specifiche in grado di indurre

o inibire il processo di maturazione dell'm-RNA trascritto. Alcuni di questi elementi di controllo sono:

gli elementi “Enhancers”, che sono in grado di attivare il processo di sintesi e maturazione dell'm-RNA

– gli elementi “Silencers”, che sono in grado di inibire il processo di sintesi e maturazione dell'm-RNA

–

FASE INIZIALE ] dopo che l'RNA-polimerasi è stata attivata, inizialmente vengono polimerizzati tanti piccoli

frammenti di RNA che poi vengono immediatamente rimossi. Tali frammenti di RNA prendono per tanto il nome

di “Filamenti di RNA trascritti abortiti”. Una volta che sono stati rimossi questi frammenti, può avvenire la vera

e propria trascrizione del gene

FASE DI ALLUNGAMENTO ] in questa fase l'attività della RNA-polimerasi II è massima. Tale enzima quindi

polimerizza un lungo filamento di m-RNA complementare al filamento di DNA del gene. L'RNA-polimerasi II

però ogni tanto attua delle pause dovute a dei cambi di conformazione. Tali pause vengono risolte dai cosiddetti

“Fattori di allungamento”, detti anche “Proteine TFIIS”, che permettono di cambiare nuovamente la

conformazione della RNA-polimerasi II e riprendere l'azione polimerasica in maniera quasi immediata

FASE DI TERMINAZIONE ] il filamento di m-RNA viene trascritto fino a che ad un certo punto l'RNA-

polimerasi II sintetizza una particolare sequenza detta “sequenza segnale di poliadenilazione”, che forma a sua

volta una sorta di struttura a forcina. La struttura a forcina può determinare la terminazione della trascrizione

in due modi diversi:

la struttura a forcina viene riconosciuta da particolari fattori proteici che attivano una serie di

– endonucleasi che tagliano il filamento di m-RNA determinandone il distacco dalla RNA-polimerasi II e

la fine della trascrizione

la struttura a forcina induce direttamente un cambiamento conformazione della RNA-polimerasi II.

– Questo cambiamento conformazionale induce un distacco dell'enzima dal filamento di m-RNA e la fine

della trascrizione

FASE DI MATURAZIONE ] una volta che la RNA-polimerasi ha terminato la trascrizione del nuovo filamento

di m-RNA, quest'ultimo è ricco di punti di discontinuità, ovvero è formato da tratto brevi e codificanti detti

“Esoni” che si intervallano con tratti molto lunghi e non codificanti detti “Introni”.

Gli introni come abbiamo visto precedentemente nel riassunto, per ingombro sterico non possono passare

attraverso i pori nucleari e quindi devono essere tagliati, in maniera tale da permettere all'm-RNA trascritto di

passare attraverso i pori nucleari ed andare incontro a traduzione nei ribosomi. Il processo che porta alla

eliminazione degli introni è definito come “Maturazione dell'm-RNA” e si divide in tre fasi:

Capping: La prima fase è quella del “CAPPING” che consiste nella formazione, sull'estremità 5' del filamento di

m-RNA, di un cappuccio detto (CAP). Tale cappuccio è caratterizzato da un nucleotide guaninico metilato detto

“Metil-guanosina”, che si viene a formare tramite una serie di fasi rese possibili da determinati enzimi specifici

richiamati dalla CDT della RNA-polimerasi II. Vediamole in dettaglio:

Per prima cosa una fosfatasi rimuove un gruppo fosfato dall'estremità 5' del filamento di m-RNA

– Per seconda cosa una Guanil transferasi aggiunge una GMP (guanosin mono fosfato) sull'estremità 5'

– del filamento di m-RNA. La GMP viene aggiunta con un orientamento invertito, in modo tale che

l'estremità 5' dell'm-RNA si leghi alla catena di m-RNA stessa tramite un tipico legame 5' → 5',

formando difatto una sorta di cappuccio

Per terza cosa una Metil transferasi aggiunge un gruppi metilico al cappuccio precedentemente formato,

– andando a formare difatto il tipico cappuccio di Metil-guanosina

al termine di ciò arriva una proteina CBC che si lega al cappuccio

–

La formazione del cappuccio è importantissima i quanto permette all'estremità 5' del filamento di m-RNA di:

di non essere digerito da enzimi esonucleasici

– la proteina CBC del cappuccio permette al filamento di m-RNA di essere riconosciuto e trasportato

– attraverso i pori nucleari

infine il cappuccio è importante per il riconoscimento del filamento di m-RNA da parte del ribosoma per

– iniziare la traduzione

Poliadenilazione: La seconda fase è quella della “POLI-ADENILAZIONE”, che consiste nella formazione,

sull'estremità 3' del filamento di m-RNA, della cosiddetta “Coda di Poli-A”. Tale coda di Poli-A è polimerizzata a

partire dall'azione catalitica di un enzima specifico chiamato “Poli-A-polimerasi”, che non fa altro che

permettere la sintesi di una sequenza poliadenilica di 200 nucleotidi sull'estremità 3' del filamento di m-RNA.

Essa si forma attraverso un processo articolato da varie fasi, vediamole in dettaglio:

Inizialmente ci sono due proteine dette “CstF” e “CPSF” che riconoscono il segnale di poliadenilazione e

– si spostano verso l'estremità 3' del filamento di m-RNA

le CstF vengono distaccate grazie all'azione endonucleasica di alcune endonucleasi

– CPSF a questo punto richiama l'enzima Poli-A-polimerasi” sull'estremità 3' dell'm-RNA.

– La Poli-A-polimerasi si lega all'estremità 3' grazie al gruppo ossidrile libero, attraverso un legame di

condensazione

successivamente la Poli-A-polimerasi inizia a richiamare molte proteine che legano una dopo l'altra un

– serie di adenine, formando una lunga catena poliadenilica detta “Coda di poli-A”

arrivati alla duecentesima adenina, la Poli-A-polimerasi si stacca dall'm-RNA e la poliadenilazione è

– dunque terminata

Splicing: La terza fase quella dello “SPLICING”, che consiste nella eliminazione degli introni e nel successivo

legame fra i vari esoni rimasti. Al termine dello splicing quindi si viene a formare un m-RNA del tutto

codificante, formato dai soli “Esoni”. Tale processo è reso possibile da un complesso costituito da proteine (con

attività enzimatica) e frammenti di sn-RNA. Tale complesso prende il nome di “Spliceosoma”. Ed è composto da:

100 proteine enzimatiche complessate da frammenti di sn-RNA, chiamate “snRNP”

– 50 proteine enzimatiche non complessate da frammenti di sn-RNA, chiamate per questo “non-snRNP”

– 5 frammenti di sn-RNA fatti da 100-300 ribonucleotidi del tipo U1, U2, U3, U4, U5 e U6.

– Tali sn-RNA sono importanti perché permettano di riconoscere le estremità degli introni, in maniera tale

da posizionare lo spliceosoma correttamente.

Inoltre generalmente quando uno spliceosoma è caratterizzato da 100 snRNP, 50 non-snRNP e 5 frammenti di

sn-RNA fatti per lo più da U1, lo spliceosoma prende il nome di “Spliceosoma U1”.

Quando invece uno spliceosoma è caratterizzato da 100 snRNP, 50 non-snRNP e 5 frammenti di sn-RNA fatti per

lo più da U2, lo spliceosoma prende il nome di “Spliceosoma U2”.

Quando uno spliceosoma è caratterizzato da 100 snRNP, 50 non-snRNP e 5 frammenti di sn-RNA fatti per lo più

da U3, lo spliceosoma prende il nome di “Spliceosoma U3”.

Quando uno spliceosoma è caratterizzato da 100 snRNP, 50 non-snRNP e 5 frammenti di sn-RNA fatti per lo più

da U4, lo spliceosoma prende il nome di “Spliceosoma U4”.

Quando uno spliceosoma è caratterizzato da 100 snRNP, 50 non-snRNP e 5 frammenti di sn-RNA fatti per lo più

da U4, lo spliceosoma prende il nome di “Spliceosoma U4”.

Quando uno spliceosoma è caratterizzato da 100 snRNP, 50 non-snRNP e 5 frammenti di sn-RNA fatti per lo più

da U5, lo spliceosoma prende il nome di “Spliceosoma U5”.

Quando infine uno spliceosoma è caratterizzato da 100 snRNP, 50 non-snRNP e 5 frammenti di sn-RNA fatti per

lo più da U6, lo spliceosoma prende il nome di “Spliceosoma U6”.

Lo spliceosoma riconosce nello specifico tre porzioni dell'introne del filamento di m-RNA trascritto. Esse sono:

il sito di splicing 5', caratterizzato dalla sequenza GUAAGU

– il sito di splicing 3', caratterizzato dalla sequenza CAG

– il punto di ramificazione dell'introne, caratterizzato da un nucleotide adeninico (A)

–

Guardiamo come avviene in dettaglio il processo di splicing, che può essere diviso in tre gradi fasi:

prima e seconda reazione di trans-esterificazione

– azione dello spliceosoma

– ricongiungimento fra i vari esoni

–

Prima e seconda reazione di trans-esterificazione:

inizialmente avviene la prima reazione di trans-esterificazione. Tale reazione vede formarsi il legame fra

– l'OH legato al carbonio 2' del punto di ramificazione intronico ed il gruppo fosfato dell'estremità 5'

dell'introne. Questo legame porta alla rottura del legame fosfodiesterico tra il primo nucleotide

dell'introne e l'ultimo nucleotide dell'esone adiacente, formando la cosiddetta “Struttura a cappio”.

Successivamente avviene la seconda reazione di trans-esterificazione. In questa fase il gruppo OH in

– posizione 3' dell'esone induce la rottura del legame fosfodiesterico tra il primo nucleotide dell'introne e

l'ultimo nucleotide dell'esone

il risultato è che grazie alla prima reazione di trans-esterificazione viene tagliata la parte terminale

– dell'introne, mentre grazie alla seconda reazione di trans-esterificazione viene tagliata la parte iniziale

dell'introne. A seguito di ciò quindi l'introne può essere rimosso completamente

Azione dello spliceosoma:

la rimozione dell'introne è carico dello spliceosoma.

– Quello che succede è che lo spliceosoma riconosce nello specifico tre porzioni ad esso complementari

dell'introne prim'anzi tagliato. Esse sono:

- il sito di splicing 5', caratterizzato dalla sequenza GUAAGU

- il sito di splicing 3', caratterizzato dalla sequenza CAG

- il punto di ramificazione dell'introne, caratterizzato da un nucleotide adeninico (A)

inizialmente l'adenina del punto di ramificazione si lega alla proteina BBP che induce il legame dello

– spliceosoma U1 a livello dell'estremità 5' dell'introne.

Dopo di che anche il secondo spliceosoma U2 si lega sempre all'adenina del punto di ramificazione

– poi arrivano anche gli spliceosomi U4, U5 e U6 che si legano fra loro formando una sorta di trimero.

– Anche tale trimero si lega all'adenina del punto di ramificazione. Nel momento esatto in cui il trimero si

lega al punto di ramificazione, vi è un cambio conformazionale che permette l'uscita degli spliceosomi

U1, U2 e U4. Solo gli spliceosomi U2, U5 e U6 rimangono adesi al punto di ramificazione, determinando

cosi la rottura dei legami fosfodiesterici terminali. Con ciò vi è il distacco fisico della parte terminale e

della parte iniziale dell'introne

ricordo che il maggior protagonista della rottura dei legami fosfodiesterici è lo spliceosoma U6, il quale

– funge da ribozima, un enzima in grado di degradare il legame fosfodiesterico che intercorre fra i vari

ribonucleotidi. Mentre invece lo spliceosoma U4 non è un caso che inizialmente sia associato ad U6 e poi

venga allontanato. Infatti esso funge da inibitore per U6. Quando U4 e U6 sono assieme lo spliceosoma è

inattivo. Quando U4 e U6 sono separati, U6 può attuare la sua funzione enzimatica

Ricongiungimento fra i vari esoni:

al momento in cui è stato eliminato l'introne, gli esoni adiacenti vengono riuniti fra loro, attraverso una

– proteina specifica chiamata “EJT” (complesso di giunzione esonico). Quello che succede è che le

proteine EJT riconoscono le proteine SR (che a loro volta marcano le estremità dei vari esoni post-

splicing. Una volta riconosciute iniziano a catalizzare la reazione di formazione dei vari legami

fosfodiesterici fra i vari nucleotidi dei tratti iniziali e terminali degli esoni, permettendo cosi la

formazione finale di un filamento di m-RNA maturo, completamente caratterizzato da esoni!!

Splicing alternativo: è un processo che porta alla formazione di differenti m-RNA maturi a partire da uno stesso

filamento di m-RNA ancora immaturo. Tali m-RNA maturi successivamente una volta tradotti daranno vita a

proteine isoformi, ma non identiche. Lo splicing alternativo caratterizza circa il 75% dei geni umani, ed è molto

importante per il nostro organismo. Ad esempio i nostri muscoli necessitano di diversi tipi di troponine

(proteine), in base a che debbano svolgere la loro funzione all'interno dei muscoli lisci o striati. La sintesi delle

troponine è strettamente endogena, infatti vengono prodotte direttamente dal nostro organismo. Vediamo come:

alcuni geni specifici vanno incontro a trascrizione formando m-RNA

– l'm-RNA trascritto va al Capping e alla Poliadenilazione

– successivamente invece di andare incontro al classico splicing, subisce uno splicing alternativo.

– In pratica il filamento di m-RNA non viene solo privato degli introni grazie allo spliceosoma, ma alla fine

del processo di maturazione si formano due o più filamenti di m-RNA maturi

i filamenti di m-RNA maturi vanno incontro a traduzione, formando difatto troponine isoformi, ma non

– identiche. Alcune di queste troponine andranno nel tessuto liscio, altre nel tessuto striato

Alcune modalità per la quale avviene lo splicing alternativo possono essere:

il caso in cui durante lo splicing, lo spliceosoma non riconosce un esone fra due introni e quindi

– considera tutto un grande introne, e lo taglia. Dopo di che gli esoni rimasti vengono legati fra loro ed il

filamento di m-RNA maturo ottenuto sarà privo dell'esone eliminato.

L'esone prende il nome di “Esone saltato”

il caso in cui durante lo splicing lo spliceosoma non riconosce un introne fra due esoni e quindi considera

– tutto un grande esone. Il filamento di -RNA maturo ottenuto sarà quindi caratterizzato da due esoni

intervallati da un lungo introne. Tale frammento prende il nome di “Introne mantenuto”

il caso in cui durante lo splicing, parte di un introne viene considerato esone, e di conseguenza

– quest'ultimo viene integrato nel filamento m-RNA. In tal caso parliamo quindi di “Esone esteso”

Un esempio di mal funzionamento dello splicing lo si ha anche nel caso della “Talassemia”, una malattia

dell'uomo dovuta al fatto che determinate specifiche proteine vengono prodotte in piccole quantità.

Un esempio di Talassemia è la “β-Talassemia”, una malattia che causa una ridotta produzione di emoglobina.

La ridotta produzione di emoglobina comporta successivamente anemia.

La β-Talassemia è dovuta ad una mutazione che impedisce il corretto funzionamento dello splicing.

Nello specifico durante la maturazione dell'm-RNA avviene una mutazione che annulla il confine fra alcuni esoni

e gli introni e di conseguenza gli introni vengono riconosciuti come esoni senza essere rimossi dal filamento di

m-RNA. Successivamente il filamento m-RNA va incontro a traduzione formando delle proteine imperfette che

non possono formare correttamente le catene-β dell'emoglobina. Il risultato finale si traduce in una riduzione

della quantità di emoglobina prodotta dal nostro organismo, che si traduce in anemia.

Editing: esiste un altro processo che alcuni determinati filamenti di m-RNA possono subire, esso è l'EDITING.

Esso è quel processo grazie al quale si ottiene un alterazione genica nel filamento di m-RNA.

Ad esempio alcuni Editing sono la deaminazione di un adenina o di una citosina che compongono il filamento di

m-RNA, le quali vanno a formare rispettivamente l'inosina e l'uracile. Vediamo rispettivamente come avvengono

nel dettaglio i due processi:

l'adenina viene inizialmente riconosciuta da un enzima specifico chiamato “ADAR”.

– Tale enzima si lega a livello della forcina ed elimina un gruppo amminico (NH3) dell'adenina,

trasformandola difatto in inosina!

la citosina viene riconosciuta da determinati enzimi. Tali enzimi si legano al frammento di m-RNA ed

– eliminano un gruppo amminico (NH3) dalla citosina, trasformandola difatto in uracile!

Generalmente la maggior parte dei frammenti di m-RNA alterati che vengono formati a seguito del processo di

Editing, vengono degradati nel nucleo cellulare, grazie ad un complesso proteico che prende il nome di “Esosoma

nucleare”. Tale complesso permette di scindere i frammenti di m-RNA alterati in tanti singoli nucleotidi che

possono anche essere riutilizzati dalla cellula. L'esosoma nucleare distingue i frammenti di m-RNA alterati da

quelli non alterati grazie al fatto che nei frammenti di m-RNA alterati non vi è la presenza di proteine come la

CBC, SR ,EJC, recettori ed altri proteine specifiche. Per tanto ogni qual volte che l'esosoma non riconosce la

presenza di queste proteine sa che che il filamento di m-RNA è alterato e deve per tanto smaltirlo!!

FASE DI ESPORTAZIONE ] il filamento di m-RNA è quindi andato incontro a Capping, Poliadenilazione e

splicing (oppure splicing alternativo o editing). Una volta che il filamento di m-RNA ha subito tutti questi

processi, esso viene quindi maturato, formando un filamento di m-RNA maturo. La cellula riesce a percepire che

il filamento di m-RNA è maturo grazie alla presenza su di esso di alcune proteine specifiche come:

proteine che si legano alle giunzioni “esone-esone”, che fanno capire alla cellula che non c'è la presenza

– di introni e che lo splicing è avvenuto correttamente

proteine che si legano alla coda di poli-A, indicando che la poliadenilazione è avvenuta correttamente

– proteine che si legano al cappuccio (CAP), indicando che il Capping è avvenuto correttamente

–

Una volta che la cellula ha capito che il filamento di m-RNA è maturo, attraverso alcuni recettori di trasporto

nucleare, vengono aperti i pori nucleari e gli m-RNA maturi decorrono in essi ed arrivano quindi a contatto

diretto coi ribosomi nel citoplasma!!

LA SINTESI PROTEICA (fase di traduzione)

Differenze fra traduzione negli eucarioti e nei procarioti ] Al momento in cui il filamento di m-RNA è andato in

contro a maturazione, può andare incontro successivamente a traduzione:

nel caso dei procarioti non essendoci il nucleo, il filamento di m-RNA trascritto maturo viene

– immediatamente riconosciuto dai ribosomi e avviene la traduzione. Infatti parliamo non a caso di

processo di “Trascrizione-traduzione”. Inoltre nei

nel caso degli eucarioti essendoci il nucleo, il filamento di m-RNA trascritto maturo passa attraverso i

– pori nucleari e raggiunge i ribosomi dove avviene la traduzione. L'arco di tempo che intervalla la

trascrizione dalla traduzione è notevolmente maggiore rispetto a quello dei procarioti proprio per questo

motivo

Un altra differenze sta nel fatto che:

i geni dei procarioti sono “Policistronici”, ossia codificano per la formazione di molte catene

– polipeptidiche contemporaneamente [ Gene → traduzione → molte catene polipeptidiche ]

i geni degli eucarioti sono “Monocitronici”, ossia codificano per la formazione di una singola catena

– polipeptidica soltanto [ Gene → traduzione → una sola catena polipeptidica ]

Analogie fra traduzione negli eucarioti e nei procarioti ] le analogie sono:

la direzione in cui avviene la traduzione del filamento di m-RNA è 5'P → 3'OH

– una volta che è avvenuta la sintesi degli amminoacidi, quest'ultimi di legano a partire dall'estremità N-

– terminale all'estremità C-terminale, formando lunghe catene polipeptidiche che formeranno a loro volta

le proteine tridimensionali

durante la traduzione è possibile anche che più ribosomi contemporaneamente possono legarsi allo

– stesso filamento di m-RNA, formando cosi una struttura chiamata “Polisoma” o “Poliribosoma”.

Il polisoma è sicuramente una struttura più efficace, poiché si ha la sintesi contemporanea di più copie

della stessa proteina a partire dal solito filamento di m-RNA

I più importanti componenti della fase di traduzione ] I maggiori componenti della traduzione sono:

ribosoma

– t-RNA

– fattori traduzionali

– m-RNA

–

RIBOSOMA ] Una volta che il filamento di m-RNA è giunto nel citoplasma, viene quindi riconosciuto dai

ribosomi, degli organuli fondamentali alla vita, che permettano difatti di tradurre un filamento maturo di

m-RNA in amminoacidi, a loro volta implicati nella sintesi di proteine funzionalmente attive a livello cellulare.

Se al giorno d'oggi abbiamo compreso così tanto sui ribosomi è grazie soprattutto alle ricerche svolte dagli

scienziati George Palade (premio nobel nel 1974) e Ada Yanath e Steitz (premi nobel nel 2009) i quali scoprirono

rispettivamente la fisiologia dei ribosomi e la loro funzionalità. Tali ricerche infatti hanno confermato che ogni

ribosoma è caratterizzato soprattutto da r-RNA disposto con una certa tridimensionalità. Esternamente e nel

mezzo ai filamenti di r-RNA abbiamo la presenza di alcune fessure e nicchie che vengono riempite da proteine

ribosomiali. Queste proteine a loro volta hanno il compito di interagire con l'r-RNA facilitandone il ripiegamento

tridimensionale corretto e adatto al processo di sintesi proteica. Infatti una variazione della forma e quindi della

tridimensionalità dell'r-RNA porta alla fine a problematiche varie nel processo di sintesi proteica!!

Andando nello specifico i filamenti di r-RNA e le proteine ribosomiali vanno a formare due subunità:

una subunità detta “Maggiore” poiché è caratterizzata da dimensioni e un peso molecolare più grande.

– L'unità di misura del peso delle subunità proteiche del ribosoma è lo “Sweberg” (S) che è proporzionale

al peso molecolare della subunità

una subunità detta “Minore” poiché è caratterizzata da dimensioni e un peso molecolare più piccolo.

– L'unità di misura del peso delle subunità proteiche del ribosoma è lo “Sweberg” (S) che è proporzionale

al peso molecolare della subunità

La subunità maggiore e minore del ribosoma rimangano separate e libere nel citoplasma, fino a che non inizia la

traduzione. Al momento in cui inizia la traduzione le due subunità si assemblano e formano la struttura del

ribosoma completa (detta matura). Al momento in cui il ribosoma assume la forma completa, anche se le due

subunità sono assemblate fra loro, presentano fra loro uno spazio continuo detto “Solco ribosomiale”. Attraverso

questo solco, il filamento di mRNA scorre dalla subunità minore a quella maggiore e viene quindi tradotto in

amminoacidi che formeranno successivamente una proteina funzionale.

Un'altra particolarità dei ribosomi è quella che i ribosomi delle cellule procariote sono più piccoli rispetto a

quelli presenti nelle cellule eucariote. Questo deriva dal fatto che le cellule eucariote hanno ribosomi

caratterizzati da una subunità minore e una subunità maggiore

molto più grandi rispetto a quelle che compongono un ribosoma procariote. Infatti:

i ribosomi della cellula procariote sono caratterizzati da una massa di circa 2700 Kdalton, un diametro

– di 20 nanometri ed un coefficiente di sedimentazione di 70 Sweberg.

La subunità minore è formata da 21 proteine ribosomiali ed una molecola di r-RNA

La subunità maggiore è formata da 34 proteine ribosomiali e due molecole di r-RNA

i ribosomi della cellula eucariote sono caratterizzati da una massa di circa 4000 Kdalton, un diametro di

– 23 nanometri ed un coefficiente di sedimentazione di 80 Sweberg.

La subunità minore è formata da 33 proteine ribosomiali ed una molecola di r-RNA

La subunità maggiore è formata da 47 proteine ribosomiali e tre molecole di r-RNA

Ciascun ribosoma abbiamo visto che è strutturalmente caratterizzato da una subunità maggiore ed una subunità

minore. La subunità minore è la funzione di riconoscere a legarsi al filamento di m-RNA maturo. La subunità

maggiore ha la funzione di tradurre il filamento di m-RNA maturo in amminoacidi.

Ogni subunità maggiore è caratterizzata da:

Sito A, detto anche “Sito amminoacidico” è quella regione della subunità maggiore dove i t-RNA carichi

– dei loro amminoacidi, si attaccano al filamento di m-RNA maturo

Sito P, detto anche “Sito peptidico” è quella regione della subunità maggiore dove i t-RNA rilasciano i

– loro amminoacidi

Sito E, detto anche “Sito Exit” (sito di uscita) è quella regione della subunità maggiore dove i t-RNA

– scarichi (privi dei loro amminoacidi), si staccano dal filamento di m-RNA maturo

t-RNA ] RIVEDERE PAGINA 28!!! RIPROPONGO LA STRUTTURA DEL t-RNA nell'immagine sottostante:

m-RNA ] RIVEDERE PAGINA 28!!! Una caratteristica fondamentale è quella di possedere una sequenza

particolare detta “Sequenza ORF” (Open Reading Frame). Tale sequenza comprende un codone di inizio “AUG”

che codifica per metionina, ed uno dei tre codoni di stop (UAA; UAG; UGA). Queste parti sono fondamentali in

quanto identificano precisamente il punto di inizio della traduzione e il punto terminale di quest'ultima!!

Fattori traduzionali ] sono proteine specifiche che permettano la traduzione. Alcuni di essi si ritrovano sia nei

procarioti che negli eucarioti, mentre altri sono differenti.

TRADUZIONE NEI PROCARIOTI

Il processo di traduzione nei procarioti è caratterizzato dalle stesse identiche fasi della traduzione negli eucarioti.

Esse sono:

Attivazione e caricamento dell'amminoacido sul t-RNA

– fase di inizio

– fase di allungamento

– fase di terminazione

–

FASE DI ATTIVAZIONE E CARICAMENTO DELL'AMMINOACIDO SUL t-RNA ] Nei procarioti il processo

di traduzione prende il nome di “Traduzione Cotrascrizionale”, ad indicare il fatto che immediatamente dopo il

termine della trascrizione, parte la traduzione. La prima cosa che accade all'inizio di ogni traduzione è che il

t-RNA dev'essere attivato. Il t-RNA è attivo quando è legato ad un amminoacido. Fondamentalmente quindi:

t-RNA da solo → forma inattiva

– t-RNA associato all'amminoacido → amminoacil-tRNA → forma attiva

–

L'attivazione dell'amminoacido è resa possibile da un enzima specifico chiamato “t-RNA sintetasi”.

Di tale enzima ce ne sono circa 20, tutti diversi fra loro. Il numero 20 non è una casualità, infatti ogni t-RNA

sintetasi è specifica per un determinato amminoacido. Ci sarà quindi un t-RNA sintetasi per la serina, una per la

lisina, una per il triptofano, una per l'arginina e cosi via quant'altro per tutti gli altri amminoacidi..

La funzione di questi enzimi è quella di riconoscere due siti del t-RNA, che sono lo Stelo accettore e l'ansa

dell'anticodone. Una volta riconosciuti legano al t-RNA l'amminoacido corrispondente.

Attivazione e caricamento dell'amminoacido sul t-RNA : la t-RNA sintetasi inizialmente sfrutta l'idrolisi di una

molecola di ATP, per attivare un determinato amminoacido. In pratica quello che succede è che:

l'ATP va incontro alla reazione [ ATP → AMP + 2 Pi ]

– arriva l'amminoacido e la t-RNA sintetasi lega un AMP al gruppo carbossilico dell'amminoacido

– (estremità C-terminale), attraverso un legame fosfoanidrinico ad alta energia. Si forma quindi un

amminoacido adenilato

a questo punto il gruppo carbossilico dell'amminoacido adenilato, interagisce con l'estremità 3' dello

– stelo accettore del t-RNA, attraverso un legame acilico, altamente energetico. In questa maniera viene

indotto il rilascio della molecola di AMP e si forma l'amminoacil-tRNA (forma attiva del t-RNA)

alla fine la t-RNA sintetasi attraverso la propria attività di Proof reading (rilettura) riesce a percepire se

– la traduzione è andata a buon fine o meno. In caso di errori o mal funzionamenti verranno poi stimolate

altre molecole proteiche per riadattare il processo affinché tutto vada come deva andare

FASE DI INIZIO ] Inizialmente vengono prodotte delle proteine particolari detti “Fattori traduzionali della fase

di inizio”, o generalmente chiamate anche “IF” (Initiating Factor). Tali proteine sono 3, ed hanno delle funzioni

precise: IF1 occupa il sito A della subunità maggiore del ribosoma, in modo che il primo t-RNA che porta la

– formil-metionina sia costretto a legarsi al sito P

IF3 serve ad impedire in un primo momento l'arrivo della subunità maggiore

– IF2 è una GTPasi che attraverso l'energia prodotta dalle GTP, si occupa di posizionare il primo t-RNA

– legato alla formil-metionina, all'interno del sito P. In questo modo la subunità maggiore può legarsi al

complesso “mRNA-subunità minore-tRNA”

Successivamente inizia la vera e propria fase iniziale della traduzione:

per prima cosa nell'estremità 5' del filamento di m-RNA trascritto, abbiamo una sequenza consenso

– chiamata “ORF” o in questo caso “Sequenza Shine-Delgarno”. Tale sequenza si trova a 25 nucleotidi

dalla sequenza di inizio della traduzione, ed è una sequenza ricca di purine perfettamente

complementare ad una sequenza di pirimidine presente sul filamento di r-RNA 16s della subunità

minore del ribosoma. Attraverso una serie di legami covalenti la sequenza shine-delgarno del filamento

di m-RNA si lega quindi alla subunità minore del ribosoma. Ciò è reso possibile anche grazie alla

proteina IF3 che, come abbiamo visto precedentemente, impedisce alla subunità maggiore di legarsi

prima della subunità minore del ribosoma

una volta che è avvenuto il legame fra m-RNA e ribosoma, il filamento di m-RNA scorre fra le due

– subunità fino a che non viene letto il primo codone AUG (codone di avvio)

A questo punto interviene uno specifico t-RNA detto “t-RNA iniziatore” che si lega al codone di avvio

– “AUG”, tramite il suo anticodone complementare “CAU”, attraverso legami covalenti

una volta che è avvenuto il legame fra l'anticodone del t-RNA e il codone di avvio dell'm-RNA, inizia la

– traduzione. Il codone AUG che generalmente codifica per una metionina, nei procarioti viene tradotto in

una metionina formilata (formil-metionina). Infatti il gruppo formile viene aggiunto al gruppo

amminico della metionina, per evitare che la metionina stessa possa reagire con altri gruppi radicalici.

Abbiamo quindi il t-RNA legato alla formil-metionina (formil-metionin-tRNA)

a questo punto vengono attivate altre due proteine, le IF1 e le IF2. La IF1 permette alla formil-metionin-

– tRNA di legarsi al sito P della subunità maggiore del ribosoma. La IF2 permette di posizionare

correttamente la formil-metionin-tRNA sul sito P della subunità maggiore del ribosoma.

A questo punto si ha che la subunità maggiore del ribosoma è legata alla formil-metionin-tRNA che è

legata a sua volta alla subunità minore del ribosoma. Il risultato finale è che le due subunità del

ribosoma si uniscono e nel mezzo, vi è un solco in cui scorre il filamento di m-RNA

FASE DI ALLUNGAMENTO ] dopo che è stato tradotto il primo amminoacido (la formil-metionina), a questo

punto interviene una proteina specifica denominata “Fattore di allungamento TU”. Questa proteina presenta

una molecola energetica di GTP o GDP:

quando il fattore TU è legato ad una molecola di GTP è in forma attiva

– quando il fattore TU è legato ad una molecola di GDP è in forma inattiva

–

Quello che succede è che nella prima parte della fase di allungamento:

il filamento di m-RNA scorre nel solco ribosomiale. Ogni tre nucleotidi del filamento di m-RNA (detti

– anche tripletta o codone) che scorrono nel solco, vanno ad essere legati al corrispettivo anticodone di una

molecola di t-RNA.

Ricordo che due codoni che codificano per lo stesso amminoacido, possono essere riconosciuti dallo

stesso t-RNA, come ci suggerisce l'ipotesi del “Vacillamento della terza base”. Infatti generalmente i

requisiti sterici tra l'anticodone e il codone sono molto forti nelle prime due posizioni e molto più

flessibili nella terza posizione. [ Per capire meglio guardiamo le due immagini nella pagina successiva ]

a questo punto il codone codifica per un determinato amminoacido specifico che viene legato da un

– t-RNA, e si viene a formare un amminoacil-tRNA. Il fattore TU attivo, riconosce e si lega

all'amminoacil-tRNA e lo posiziona nel sito A del ribosoma

una volta posizionato, a questo punto la molecola di GTP del fattore TU viene idrolizzata in GDP e perde

– un gruppo fosfato. Questa reazione induce la inattivazione del fattore TU che si stacca dal sito A.

[ fattore TU + GTP → fattore TU +GDP + Pi ].

per far si che questo meccanismo si possa ripetere per ogni t-RNA, il fattore TU deve continuamente

– riattivarsi, ovvero rilasciare GDP ed acquisire GTP. Per far ciò interviene un altro fattore proteico

chiamato “Fattore TS”. Il fattore TS si lega a fattore TU inattivo inducendo il distacco della GDP.

A questo punto una molecola di GTP si lega al fattore TU, attivandolo e contemporaneamente induce

anche il distacco del fattore TS dal fattore TU attivo. Il fattore TS tornerà a rifare la solita cosa con altri

fattori TU inattivi, mentre il fattore TU attivo sarà pronto a riposizionare altri amminoacil-tRNA nel

sito A del ribosoma!!

Nella seconda parte della fase di allungamento:

dopo che il fattore TU ha posizionato l'amminoacil-tRNA nel sito A del ribosoma, viene idrolizzato il

– legame che lega l'amminoacido al t-RNA. Questo porta al fatto che l'amminoacido viene rilasciato nel

sito P

contemporaneamente arriva un altro amminoacil-tRNA e succederà la stessa cosa. Nel sito P del

– ribosoma quindi i vari amminoacidi inizieranno a legarsi assieme fra loro attraverso dei veri e propri

legami peptidici formando delle corte catene polipeptidiche

a questo punto intervengono in sinergia due proteine: una traslocasi e il fattore EFG (una GTPasi).

– Esse permettono di far scorrere il ribosoma sul filamento di m-RNA, in modo tale che:

- il t-RNA che è stato idrolizzato dal rispettivo amminoacido (t-RNA scarico) possa passare dal sito P al

sito E ed essere espulso dal ribosoma

- l'amminoacil-tRNA che arriva con un nuovo amminoacido (t-RNA carico) possa passare dal sito A al

sito P e scaricare il proprio amminoacido!!

alla fine vediamo che quindi la catena polipeptidica si allunga sempre di più fino ad arrivare ad un

– punto di terminazione!!

FASE DI TERMINAZIONE ] abbiamo visto che nella fase di allungamento il filamento di m-RNA scorre nel

solco ribosomiale ed ogni tre nucleotidi del filamento di m-RNA (detti anche tripletta o codone) si legano al

corrispettivo anticodone di una molecola di t-RNA. A questo punto il codone codifica per un determinato

amminoacido specifico e si viene a formare un amminoacil-tRNA. Il fattore TU attivo, riconosce e si lega

all'amminoacil-tRNA e lo posiziona nel sito A del ribosoma. Questa cosa si ripete sempre fino a che i tre

nucleotidi (codone) del filamento di m-RNA non possono legarsi al corrispettivo anticodone, perché quest'ultimo

non esiste. Siamo arrivati al cosiddetto “Codone di stop” o “Codone di terminazione”.

A questo punto il codone di stop viene riconosciuto dai cosiddetti “Fattori RF” (Releasing Factor), che sono due,

RF1 e RF2. I fattori RF sono molto simili strutturalmente al t-RNA, infatti queste proteine si legano al sito A e lo

occupano. Una volta occupato il sito A, questi fattori inducono il rilascio della catena polipeptidica fuori dal

ribosoma. A questo punto intervengono altri due fattori detti “EF-G” e “RRF” che si occupano di smantellare il

complesso traduzionale mettendo fine al processo di traduzione!!

TRADUZIONE NEGLI EUCARIOTI

Il processo di traduzione negli eucarioti è caratterizzato dalle stesse identiche fasi della traduzione nei procarioti.

Queste fasi sono: