Riassunti Biochimica clinica e applicata

TECNICHE CENTRIFUGATIVE

La sedimentazione è un processo mediante il quale le particelle solide sospese in un

fluido si depositano sul fondo ma il loro depositarsi sul fondo è dettato dalla presenza

di alcune forze che le spingono sul fondo. Nella sedimentazione per gravità grazie

alla forza di gravità queste particelle si depositano sul fondo(es soluzione di acqua e

sabbia). Per particelle particolarmente grandi e/o pesanti, il tempo necessario perché

sedimentano è relativamente più breve, al contrario per particelle più piccole e quindi

di massa inferiore il tempo necessario perché possano sedimentare è talmente lungo

da non essere utilizzabile ai fini laboratoristici. Per cui quello che si fa è di non sfruttare

la forza per gravità ma utilizzare la forza centrifuga. Quindi sulla stessa soluzione

(acqua e sabbia) si applica una forza centrifuga, una forza aggiuntiva che muove le

particelle in sospensione. Esistono degli strumenti che sono appunto le centrifughe

che permettono di creare un campo di forze che

e agiscono sulle particelle in sospensione e che permette loro di sedimentare in tempi

ragionevoli. I parametri che sono in gioco sono l’intensità del campo di forza, le

particelle che hanno una propria densità, forma e dimensione. Quando parliamo di

tecniche di centrifugazione abbiamo 2 categorie: PREPARATIVE e ANALITICHE.

Quella Analitica deve dare informazioni sulla particella e quindi con scopo diagnostico,

quelle Preparative invece permettono di lavorare con dei volumi maggiori di soluzioni o

omogenati per andare ad isolare le particelle e purificarle. Nel caso in cui non vi sia

una sospensione omogenea di alcune particelle la presenza di una campo di forza

gravitazione permette di ottenere 2 FASI: un sopranatante e un pellet (o sedimento).

Lo scopo di questa sedimentazione sia essa per effetto di una gravità o di un campo

centrifugo, è quella di separare le due fasi ma fare questo mi serve per andare via via

a purificare la mia soluzione da tutto quello che non mi interessa rispetto a tutto quello

che mi interessa. Per esempio se immaginiamo di rompere delle cellule dentro quelle

cellule ci sarà DNA,RNA, Proteine, membrane ecc e quindi se io voglio studiare il DNA

è importante rendere il mio campione pulito perché tutto quello che non è la mia

molecola di interesse potrebbe interferire con l’analisi che vado a fare su quella

molecola. Per cui l’esigenza di utilizzare varie tecniche per poter via via rimuovere da

questa sospensione eterogenea di tante molecole soltanto un gruppo di molecole , è

quello di avere un campione più puro su cui poter fare delle analisi sempre più fini.

Nelle tecniche centrifugative c’è un’asse di rotazione, una velocità di rotazione che è

l’asse di rotazione

la velocità angolare, una provetta che sposta perpendicolarmente e

dall’asse di rotazione. La forza che agisce sulla particella

posta ad una certa distanza

sarà tanto maggiore quanto maggiore è la velocità angolare ma è anche dipendente

dalla distanza dall’asse di rotazione; quanto più è grande la distanza dall’asse di

rotazione tanto più sarà intenso il campo di forza che agisce a parità di velocità

angolare sulla particella. Esistono a tal proposito centrifughe di varie dimensioni con

dei rotori di dimensioni variabili e con distanze dall’asse di rotazioni e capacità in

termini di velocità massima differenti. Di conseguenza, rotori più grandi permettono di

avere alloggiamenti più grandi quindi volumi di materiale biologico maggiori ma non è

solo un capacità di volumi ma anche capacità di ottenere delle velocità più spinte e

quindi la possibilità di isolare particelle sempre più piccole. Una particella più piccola,

infatti, avrà bisogno di un campo di forza maggiore per poter sedimentare rispetto ad

una particella più grande e più pesante. Esistono due modi per calcolare, leggere la

velocità di rotazione nelle centrifughe: rpm che sta per rivoluzione per minuto ovvero

quanti giri completi che il rotore compie per ogni minuto; ma secondo il tipo di rotore e

quindi dalla distanza della particella dall’asse quanto maggiore sarà la distanza tanto

maggiore sarà il campo centrifugo applicato e quindi a parità di velocità a seconda del

rotore posso avere una forza applicata differente. Siccome i protocolli sperimentali

hanno il compito di permettere a chiunque voglia fare una determinata operazione di

poterla ripetere con successo, non ha senso che si faccia un protocollo che vada bene

soltanto nel mio laboratorio ma devo mettere in condizione anche gli altri di poter

effettuare le stesse operazioni con le loro strumentazioni. Esistono delle tabelle di

conversione per ogni centrifuga che ci permettono di risalire dal valore di rpm al valore

dei cosiddetti RCF

= mω r/mg = ω

2 2

RCF = F /F r/g che sta per campo centrifugo relativo, esso esprime

c g

il rapporta tra il campo centrifugo applicato e la forza di gravità e quindi il risultato è

quante volte quel campo di forza applicato è rispetto alla forza di gravità , se è 2RCF

significa che il campo di forza applicato e due volte quello della gravità(0.5 è metà

della gravità ma questo è un valore universale che come riferimento ha la forza di

gravità). Quindi, chiunque conoscendo i parametri e quindi i valori di RCF potrà

ripetere la stessa operazione con la sua macchina. Utilizzando rpm io devo sapere con

quale macchina ho lavorato, ho fatto quell’operazione e se ho tutte le informazioni

posso ricavare il campo di forza applicato quindi RCF e utilizzare gli stessi valori trovati

con la mia centrifuga. Le macchine moderne adesso esprimono i valori di

dall’uno all’altro

centrifugazione sia in rpm che in RCF quindi facilmente si può passare

ma è importante scrivere i protocolli riportando le informazioni di RCF o rpm ma

specificando il tipo di macchina. Quando leggiamo un protocollo dove è riportato rpm

bisogna sapere che non è la stessa cosa dell’RCF e che se non conosciamo la

macchina con cui è stata fatta quell’operazione non possiamo essere sicuri che il

campo di forza applicato a parità di rpm sia lo stesso.

VELOCITA’ DI SEDIMENTAZIONE

Velocità con la quale le particelle raggiungono il fondo della provetta e questo

dipende chiaramente dal campo centrifugo, tanto maggiore è il campo centrifugo tanto

è maggiore la velocità con cui si muoverà questa particella all’interno della soluzione.

Non solo questo, ma anche la forma e la dimensione della particella come anche il

mezzo hanno un’influenza importante. Una particella che si muove in un mezzo andrà

incontro ad un’ opposizione in termini di attrito del suo movimento. Anche la densità è

un elemento fondamentale per il movimento di una particella in un fluido. I parametri

sperimentali con cui ci troveremo a lavorare sono la velocità di rotazione, il tempo di

rotazione e il mezzo di separazione. Molto spessi i mezzi di separazione sono mezzi

acquosi per cui i parametri che entrano in gioco sono fondamentalmente il tempo e la

velocità; normalmente più tempo si centrifuga tanto maggiore è la velocità di avere la

sedimentazione della mia particella. La particella si trova ad essere soggetta ad una

forza che è quella centrifuga che spinge la particella verso il basso ma ci sono anche

altre forze che entrano in gioco è che sono sia l’attrito che si oppone al movimento sia

la spinta di Archimede che agisce in direzione opposta a quella del movimento della

particella stessa. La forza d’attrito è tanto maggiore quant’è maggiore la viscosità del

mezzo e chiaramente tanto maggiore è il raggio della particella tanto maggiore è la

forza d’attrito che subisce la particella. Per quanto riguarda la forza a cui è soggetta

una particella idealmente sferica immersa in un mezzo con una densità p(ro)vm

abbiamo :

Pp=Pm

Pp-Pm=0; quando la densità della particella è uguale a quella del mezzo, la velocità

di sedimentazione è 0 quindi v=0 la particella non si muove. In base a questo la

densità della particella deve essere superiore a quella del mezzo altrimenti la particella

non si muove e questo viene sfruttato in alcune condizioni per far bloccare alcune

particelle e far rallentare altre modificando il mezzo in cui si trovano le particelle. Le

particelle che si muovono in un mezzo avranno velocità differenti a secondo della

forma, massa, dimensione e della viscosità del mezzo in cui sono immerse. Quindi, io

posso sia sfruttare il tempo di sedimentazione per isolare da una miscela di tante

particelle solo alcune particelle sapendo che alcune hanno una velocità di

sedimentazione molto maggiore di altre e quindi so che in un certo intervallo di tempo

con quel campo centrifugo applicato io potrò avere nel pellet una grande quantità delle

mie particelle e lasciare in sospensione le altre oppure in alcuni casi posso utilizzare il

livello di sedimentazione che si esprime però con dei gradienti. Sfruttando i gradienti io

posso avere che le particelle si dispongono in tanti strati a seconda della loro densità e

quindi si muoveranno a partire dalla parte apicale della provetta a velocità differenti e

quindi, dopo un certo intervallo di tempo avrò delle zone discrete all’interno delle quali

ci sarà un arricchimento di determinate particelle che hanno velocità di sedimentazione

simile. Per quando riguarda la velocità di sedimentazione, ci sono dei coefficienti di

che esprimono quel’è la velocità di sedimentazione di una particella a

sedimentazione

parità di campo centrifugo applicato. Questo è importante perché per determinare le

proprietà delle particelle che in determinate condizioni hanno una certa velocità di

sedimentazione e quindi mi permettono di sapere che tipo di esperimento devo fare

per permettere la sedimentazione di alcune particelle. Anche la temperatura è un

elemento importante nella centrifugazione come anche viscosità e densità. Per quanto

riguarda il coefficiente di sedimentazione ci sono quelli standard che sono a 20°(slide);

tipo di coefficiente di sedimentazione è quello di Svedberg che equivale a 10^-13s. Il

all’altra, quella di un enzima è

tempo di sedimentazione varia da una componente

molto più bassa rispetto ad una molecola con una struttura molto più grande.

CENTRIFUGA

La centrifuga è uno strumento che ha lo scopo di produrre le forze centrifughe che mi

permettono di separare i vari componenti di una miscela e chiaramente, la forza

centrifuga applica è superiore alla forza di gravità. La centrifuga è formata da un

apparecchio al cui interno c’è un motore con i massimi di rotazione, un rotore per gli

alloggiamenti che si chiude con un coperchio e che una volta avviata produce per

effetto della rotazione intorno all’asse un certo campo centrifugo e quindi applico una

certa forza alle particelle. Esistono vari tipi di centrifughe(slide) da quelle più semplici

con dimensioni ridotte a quelle ultracentrifughe che lavorano con delle velocità molto

veloci e queste velocità dipendono anche dal fatto che hanno dei motori più potenti. Un

elemento importante che hanno le centrifughe è la capacita di essere refrigerate

ovvero la capacità di lavorare a freddo quindi a temperature basse e quindi anche la

centrifugazione farla avvenire a temperature basse in modo tale da preservare l’

integrità del materiale biologico. Il materiale biologico, è vero che negli organismi è

presente a 35°quindi è stabile, ma è stabile in condizioni particolari; è isolato da altre

molecole tipo il DNA è insieme all’RNA e agli enzimi che vanno a degradare il DNA.

Quindi, tutto è molto controllato; si lavora in degli ambienti in cui la salinità, la

presenza di determinate proteine e quindi i livelli di organizzazione strutturale sono

complessi e quindi il materiale biologico in quelle condizioni lavora bene. Nel momento

in cui lo isoliamo, esponiamo non soltanto le molecole al contesto cellulare differente

ma anche a tutto quello che è il materiale circostante(saliva, batteri, ecc). Inoltre, è

importante saper manipolare il materiale biologico per evitarne la sua degradazione.

Le centrifuga da banco sono ad angolo fisso e hanno dei rotori molto piccoli e

possiedono degli alloggiamenti per le cosiddette eppendorf che sono delle provettine

da 2ml. Da queste si passa a centrifughe morandi che hanno degli alloggi per

300/400 ml di materiale (vedere dalle slide i vari tipi di centrifughe). Esistono

centrifughe che hanno 3 tipi di rotori: a braccio oscillante, ad angolo fisso e ad

alloggiamento verticale. Quelle con cui ci troveremo a lavorare sono quelle ad angolo

fisso e a braccio oscillante, quelle con gli alloggiamenti verticale sono usate molto

meno. Come dicevamo prima, la forza esercitata sulla particella dipende dalla distanza

della particella stessa dall’asse di rotazione ed è maggiormente evidente in quella a

braccio oscillante dove se la mia provetta è disposta perpendicolarmente all’asse di

rotazione, la forza centrifuga che si applica a particelle che sono sulla parte superiore

della provetta sono diverse da quelle che si trovano al centro o sul fondo; in particolare

sul fondo la forza sarà maggiore. Quindi in genere per calcolare la forza si considera il

centro della provetta e quindi la distanza media. Quella a braccio oscillante è molto più

in uso per la parte di biologia cellulare, in particolare, se andiamo ad inserire il nostro

campione nella provetta all’interno di un alloggiamento verticale , per effetto della

rotazione questo alloggiamento si dispone perpendicolarmente all’asse di rotazione e

nel momento in cui la centrifuga finisce il suo corso la provetta ritorna nella sua

posizione verticale. È importante tener presente quando lavoriamo in laboratorio vari

aspetti: tipo di campione, tipo di provetta da utilizzare, tipo di centrifuga e quindi tipo di

materiale (cloroformio o fenolo) da poter aggiungere nel mio campione.

Le tecniche centrifugative, come abbiamo già visto, vengono utilizzare per sapere

delle molecole biologiche; in particolare parleremo di due tipi di centrifugazione:

differenziale e quelle di gradienti di densità che si divide a sua volta in zonale e

isometrica. Per poter separare delle particelle a partire da un tessuto o da una cellula

è necessario rompere le cellule, la cosiddetta Lisi. Questo può essere realizzando

partendo da una serie di metodiche che vanno da quelle meccaniche quindi di stress

ad ultrasuono a quelle con una forzatura meccanica delle cellule attraverso un foro

molto piccolo oppure all’utilizzo di detergenti che sono dei composti che solubilizzano

la membrana biologica e quindi permettono al contenuto biologiche di disperdersi

nell’ambiente di reazione oppure c’è un meccanico che ruotando va a disgregare

meccanicamente le cellule liberandole, questa procedura si chiama di

OMOGENIZZAZIONE dove come risultato ottengo una soluzione in cui tutto il

contenuto delle cellule viene liberato nella mia miscela di reazione.

Molto comune è l’utilizzo di una Lisi di tipo chimico quindi utilizzando dei detergenti

oppure un altro metodo di lisi è quello di utilizzare delle soluzioni che hanno differente

osmolarità e quindi una pressione osmotica differente; in particolare se io metto delle

cellule in un ambiente in cui la concentrazione salina è molto bassa, le cellule

tenderanno ad incanalare acqua fino a scoppiare. A seconda dell’esigenze, posso

scegliere alcune procedure tenendo conto che gli stress meccanici posso andare

anche a rovinare le mie molecole d’interesse. In particolare, il DNA genomico è

sensibile agli stress di natura meccanica e quindi andare ad utilizzare un cestello ad

alta rotazione non solo produce un riscaldamento della soluzione ma anche uno stress

Detto questo abbiamo l’omogenasi.

meccanico che frammenta le molecole di DNA.

Nella centrifugazione differenziale si sfrutta la differenza di velocità di

sedimentazione delle particelle. Quindi cosa si fa? Si prende un campione e si

sottopone ad un campo centrifugo x e dopo un certo intervallo di tempo avrò ottenuto il

pellet; prendo il sopranatante e lo trasferisco in un’altra eppendorf. Faccio una nuova e

successiva centrifugazione questa volta però invece di sottoporre le particelle ad una

campo centrifugo x aumento il campo centrifugo e quindi sottopongo le particelle ad

una forza centrifuga superiore 2x. Ottengo di nuovo un pellet, predo il sopranatante e

faccio la stessa cosa utilizzando un campo centrifugo ulteriormente più alto. Quindi, la

differenziale non è altro che una sequenza in serie di centrifugazioni applicando dei

campi centrifughi sempre più spinti. Normalmente non posso andare a ridurre il campo

centrifugo perché già applicando quello massimo ottenendo la sedimentazione delle

particelle più piccole. Quindi, la prima centrifugata deve essere quella che ha un

campo centrifugo più basso via via che procedo con i tempi successivi aumento

progressivamente il campo centrifugo. Questo per ottenere nella prima frazione del

pellet le particelle che sedimentano x e nel secondo pellet le più leggere e quindi

quelle che sedimentano con un campo centrifugo 2x. Quindi posso ottenere man mano

delle particelle sempre più piccolo e quindi dei campioni sempre più puri.

Nella centrifugazione in gradiente di densità devo chiaramente avere un gradiente

quindi creare un gradiente, carica