Riassunti Biochimica clinica e applicata

SEQUENZIAMENTO ACIDI NUCLEICI

Il sequenziamento non è altro che una procedura che permette di ricavare l'informazione sulla successione di basi in un frammento di DNA. Esistono tante tecniche per il sequenziamento del DNA; in particolare vedremo le metodiche classiche che ancora sono utilizzate nei laboratori ma sono più lente e laboriose di altre metodiche di nuova generazione che utilizzano strumenti più complessi e più avanzati. Questi sequenziatori di nuova generazione riescono a produrre un numero di sequenze molto più ampio per unità di tempo però queste hanno dei limiti; in genere il limite è nella lunghezza della sequenza (cioè hanno un limite nel numero di basi che riescono a leggere, quindi mentre quelli standard leggevano anche migliaia di coppie di basi, in genere quelli automatici leggono fino a 100-200 coppie di basi, quindi come se dividessero quel frammento lungo in tanti piccoli frammenti). Con l'avanzare

La tecnologia si sta cercando di colmare questo limite e rendere anche i sequenziatori automatici altamente processivi, cioè in grado di leggere sequenze più lunghe. Perché leggere una sequenza più lunga mi permette di avere indicazioni sulla struttura e mi fa perdere l'integrità strutturale del cromosoma. Invece, spezzare in tanti frammenti del frammento originale, quindi per poter risalire alla sequenza originale, ho bisogno di leggere tante volte lo stesso campione diviso in frammenti. E allora cosa succede? Se per esempio abbiamo un frammento di 1000 nucleotidi è diviso in due, quei due frammenti sono isolati, ma magari in un altro frammento isolato invece di essere stato interrotto al centro è stato interrotto alle due estremità e avrò una lettura a cavallo del punto di rittura dei due filamenti e quindi dal fatto che ho una sequenza a cavallo dei due frammenti posso risalire alla sequenza originale del frammento.

Questo è il motivo per cui, in questi sequenziatori di nuova generazione, ho bisogno di sequenze moltopiù elevate per avere la sequenza originale di frammenti di DNA più lunghi. Il sequenziatore a singola elica mi permette di eliminare un passaggio importante che è quello dell'amplificazione mediante PCR proprio perché le tecniche di sequenziamento che vedremo, tranne quelle a singola elica, prevedono tutte una fase di amplificazione del mio materiale mediante PCR. Ovviamente il tutto è fatto in strutture con dei kit automatici in modo tale da limitare la variabilità dell'operatore, il tempo e lo spazio necessari per poter lavorare (quindi posso mettere in uno spazio ridotto più piastre e leggere un numero di campioni più elevato). Vediamo il concetto di sequenziamento cioè come sono stati fatti i primi sequenziamenti del DNA; dipende dalla tecnica che utilizzo. Immaginiamo di avere una sequenza di DNA e vogliosapere base per base qual è la sua composizione, persaperlo devo ricorrere a stratagemmi. Uno di questi stratagemmi è sfruttando la PCR(tecnica di Sanger). Insieme alla miscela dei 4 deossinucleotidi(dATP,dTTP,dCTP,dGTP) hanno messo il ddTTP (dideossiTTP cioè non ha il 3ossidrile in posizione 3'. Sappiamo che nel DNA l'aggiunta del nucleotide successivoavviene proprio grazie al legame fosfodiesterico del fosfato 5' con il 3'OH, se mancaOH non può essere aggiunta nessuna base, la catena è interrotta quindi se io mettessiin una miscela di reazione in cui faccio avvenire la PCR il ddTTP, dGTP, dCTP e dATPavrei che la prima volta che la polimerasi deve aggiungere una T, l'unica T che avrà lapolimerasi è la dideossi (dd) e quindi quello che verrà prodotto come risultato è unicotipo di frammento, quello in cui la prima base che ho aggiunto è la T. Mescolando inproporzioni opportune il

dideossi con il deossi quello che faccio è che rendo le condizioni di reazioni tali che nel corso della reazione, statisticamente, non tutte le volte che devo aggiungere una T aggiungerò la dideossi, qualche volta aggiungerò la dideossi e qualche volta la deossi e la catena può continuare. Quindi nel primo caso il frammento resta così com'è; per aggiunge la dideossi, la catena si interrompe effetto del caso altre volte invece di aggiungere il dideossi in quella posizione aggiungo il deossi e la catena può continuare, per effetto del caso la seconda volta che deve aggiungere la T in un certo numero di volte proverà il dideossi quindi una certa quantità di frammenti avranno l'interruzione nella seconda T e quindi statisticamente ogni volta che c'è una T ci sarà una certa quantità di frammenti interrotti proprio in quella posizione. Questo discorso vale sia per la T sia per la A sia per la C e

sara' la A, la seconda base legata sara' la G e nel filamento complementare sara' la C, e cosi' via. In questo modo, leggendo le posizioni delle basi lungo il filamento, posso ricostruire la sequenza di DNA originale.

c'è una A. Il frammento più lungo è quello che ha l'ultima base con il dideossi e quindi leggendo dal basso verso l'alto la posizione nella sequenza di DNA a partire dal primer utilizzato per la reazione di sequenziamento. Hanno sfruttato la lunghezza del frammento e il caricamento in posizioni differenti del gel per risalire alla sua composizione. Chiaramente in questo caso ho un unico marcatore (per esempio il fosforo 32) e quindi non potrei riconoscere la sequenza, inoltre l'utilizzo di marcatori radioattivi è comunque pericoloso quindi il suo utilizzo si cerca di limitare al minimo. Allora invece di utilizzare una marcatura uguale per tutti, di utilizzare il dideossi con un colorante; quindi il ddTTP ha un fluorocromo rosso, il ddGTP giallo, in questo caso è stesso il colore dell'ultima che mi dice che tipo di base c'è lì. La procedura poi base aggiunta (quella del dideossi) è la stessa solo che

c'è il fluorocromo invece del fosforo radioattivo; in questo caso statisticamente in ogni posizione c'è una base con il dideossi e quindi facendo migrare (sempre sul sistema elettroforetico) frammenti più piccoli che migrano velocemente e frammenti più grandi lentamente, il grado di risoluzione del sistema è tale da separare lo spazio per velocità di migrazione quindi nucleotide per nucleotide posso identificare delle zone di colore diverso e dal frammento più piccolo al più grande posso risalire alla sequenza del mio frammento. Il sistema di elettroforesi capillare ha una finestra trasparente attraverso la quale il raggio laser può andare ad irradiare il campione e a registrare la fluorescenza istante per istante. L'evoluzione del metodo di SANGER ha visto l'utilizzo di marcatori fluorescenti specifici per ognuno dei deossinucleosidi trifosfati. Tale metodica prevede che un singolo filamento, un singolo

prodotto di amplificazione venga sottoposto alla reazione di sequenziamento e caricato poi in elettroforesi capillare; ogni capillare avrà un'unica sequenza di un unico filamento. Altre metodiche, di nuova generazione, invece, permettono di poter aumentare in maniera esponenziale, in spazi ristretti, un numero di sequenze che si possono ottenere da una singola corsa del sistema di sequenziamento. In particolare vedremo, un tipo di sequenziatore (ROCHE) che sfrutta un altro tipo di reazione e quindi non utilizza il fluorocromo ovvero la reazione a terminazione di catena come nel caso del sequenziamento con SANGER. Dalla slide è possibile osservare che la polimerasi in presenza di un filamento stampo di un oligonucleotide di innesco con un 3'OH disponibile, aggiunge un nucleotide; l'aggiunta del nucleotide chiaramente libera per la reazione stessa un pirofosfato. Nel mix di reazione sono presenti anche altri enzimi tra cui la SOLFORILASI. Essa catalizza la formazione

di ATP a partire dal pirofosfato che si è liberato e dall'adesina5' fosfosolfato (APS). APS+Ppi, quindi, generano l'ATP grazie alla solforilasi. Nella miscela di reazione vi è anche l'enzima LUCIFERASI; tale enzima è in grado di produrre luce grazie alla trasformazione di luciferina in ossiluciferina. L'ATP generato dalla solforilasi è in grado di attivare la luciferasi e catalizzare la trasformazione di luciferina in ossiluciferina e quindi produrre luce. Nell'altro caso, ricordiamo invece, che vi era un fluorocromo diverso per ogni base legato all'ultima base aggiunta del filamento che veniva quindi separato dagli altri mediante un sistema elettroforetico. In tal caso abbiamo, invece, una celletta in cui avviene questa reazione luminosa che si ha ogni volta che viene aggiunta una base e si libera pirofosfato. Immaginiamo un stampo con un primer, un 3'OH libero e una celletta in cui andiamo ad aggiungere

progressivamente le basi. Aggiungiamo deossinucleoside trifosfato inmaniera controllata, uno dopo l'altro perché seguiamo la reazione nel suo avvenire. Ilnon distingue l'aggiunta di un nucleotide dall'altro perché ilsegnale luminosopirofosfato si libera in maniera sequenziale ogni volta che viene aggiunto unnucleotide. Per tale motivo definiamo il segnale luminoso ASPECIFICO. Dato ciò, nellaall'inizio è priva di deossinucleosidi trifosfati aggiungiamo ilmiscela di reazione chedGTP. Il sistema registra presenza o assenza e quantizza il segnale luminoso emesso.Se la prima base di quel filamento è la G allora avremo un segnale luminoso; se laprima base non è un G non avremo segnale luminoso. Dopo aver fatto ciò, dopo averottenuto o meno il segnale luminoso viene rimosso il tutto grazie ad un enzima PIRASI(enzima capace di eliminare i residui di dNTP o di ATP che si sono generati dallareazione precedente dato che

essi possono ostacolare la reazione luminosa del ciclo successivo). A questo punto, il sistema riparte da zero e ripete l'operazione.