Riasssunti di Microbiologia generale

Microbiologia: teoria della generazione spontanea (abiogenesi) di Aristotele

La teoria della generazione spontanea era la credenza, diffusa dall'antichità fino al XVII secolo, secondo la quale alcuni tra i più semplici organismi viventi (vermi, mosche, larve...) potessero generarsi spontaneamente dalla materia non vivente, in quanto considerata comunque dotata di influssi vitali. Alla fine dell'800, grazie allo sviluppo di nuove ricerche biologiche, la teoria di Aristotele iniziò ad essere messa in discussione:

Francesco Redi (1668)

Esperimento: Redi mise delle sostanze organiche (carne, pesce) in dei barattoli: uno fu lasciato all'aria senza protezione e in questo caso le mosche avendo libero accesso alla carne riuscirono a formare larve; un altro fu sigillato in modo tale da impedire il passaggio sia di mosche che di aria, e in questo caso le larve non si svilupparono; un terzo barattolo fu ricoperto con una garza che impediva il passaggio di mosche ma non di aria, e in questo caso non si svilupparono larve. Se però la garza veniva deposta sulla carne e il recipiente veniva sigillato si constatava lo sviluppo di larve, sviluppatesi da uova precedentemente depositate sulla garza dalle mosche.

Conclusione: Gli organismi non si originavano spontaneamente dalla materia inanimata, bensì nascevano da altri esseri viventi (come le larve provenivano dalle mosche che si nutrivano della sostanza in decomposizione).  Abiogenesi Biogenesi.

Anton van Leeuwenhoek (1675)

Inventa e utilizza il primo microscopio, osservando la presenza di molti microrganismi nelle acque dove vi erano presenti sostanze organiche (brodi, succhi di frutta, acque stagnanti). Biogenesi per organismi complessi ma abiogenesi per microrganismi.

Lazzaro Spallanzani (1800)

Esperimento: Prese due vasi contenenti brodo, uno sigillato e l'altro lasciato aperto, e li scaldò in modo da eliminare tutte le forme di vita presenti nell'infuso e nell'aria all'interno del vaso stesso. Nel vaso sigillato non si creò alcun tipo di microrganismo.

Conclusione: Anche i microrganismi come gli organismi più complessi non si originano spontaneamente dall'aria, bensì si sviluppano da altri organismi vitali presenti nell'aria.

Microbiologia: Spallanzani viene accusato

Spallanzani venne accusato di aver privato l'aria (contenuta nel vaso) del suo soffio vitale (caratteristica dell'aria al di fuori del vaso) tramite il suo riscaldamento.

Louis Pasteur (1864)

Esperimento: Preparò un brodo all'interno di un pallone di vetro dal collo ricurvo e la cui estremità lasciò aperta. Egli scaldò il brodo e l'aria per eliminare le forme di vita presenti, ma essendo il recipiente aperto allora l'aria esterna sarebbe potuta entrare e a contatto con il liquido creare la vita. Pur non essendoci quindi alcun impedimento da parte di un tappo, a causa del percorso tortuoso e della sottigliezza del collo di vetro le impurità presenti nell'aria si depositavano senza raggiungere il brodo. Al liquido perciò arrivava solo aria pura che non originava alcun tipo di microrganismo.

Conclusione: Qualsiasi tipo di organismo vitale ha origine sempre e solo da un altro organismo vivente. Biogenesi per tutti gli organismi.

Postulati di Koch

I postulati di Koch sono dei criteri destinati a stabilire la relazione di causa-effetto che lega un microrganismo a una malattia. Robert Koch fu il primo ad adottare sperimentalmente alcuni criteri che permettevano di stabilire se un certo microrganismo fosse o meno la causa di una certa malattia. Egli isolò dai tessuti di animali malati i bacilli del carbonchio, li coltivò in laboratorio su terreni di coltura di gelatina (innovazione tecnologica) e ne identificò il ciclo vitale di tipo sporigeno. Attraverso l'inoculazione delle cellule in animali non affetti da alcuna patologia osservò l'insorgenza della malattia e la possibilità di isolare tale microrganismo dal tessuto degli animali infettati sperimentalmente. Grazie alle sue osservazioni fu in grado di definire 4 postulati:

• L’agente causale deve essere presente in tutti i casi della malattia di cui è ritenuto responsabile, e al contempo deve essere assente negli individui sani.
• L’agente causale isolato dall’individuo affetto e posto in coltura deve dare origine a una popolazione cellulare omogenea.
• La coltura pura di un agente causale, se inoculato in un individuo sano, deve dar luogo alla comparsa della malattia di cui è ritenuto responsabile.
• L’agente causale può essere re-isolato dall’organismo infettato sperimentalmente.

Tali postulati, pur essendo stati molto utili in quanto hanno segnato l'inizio dell'utilizzo del metodo scientifico in microbiologia, presentano però alcuni punti deboli/limiti:

• I postulati associano ogni malattia ad un singolo agente patogeno e viceversa; non viene quindi considerata la possibilità di un’eziologia multipla (= una malattia molte cause) né l’eventualità che una stessa causa possa indurre malattie differenti.
• Il microrganismo è ritenuto da Koch l'unico responsabile dell’insorgenza della malattia; non si tiene quindi conto di altri fattori che agiscono in aggiunta al singolo agente per la comparsa della malattia (es. fattori ambientali ecc).
• Koch definisce necessaria la coltivazione dell’agente eziologico per una successiva re-inoculazione, ma spesso tale agente può NON essere coltivabile in vitro o NON essere re-inoculabile in un organismo (perché il patogeno ha tropismo unico per l'uomo o perché gli altri animali sviluppano una diversa patologia rispetto all'uomo).
• Kock considera la presenza della malattia una conseguenza inevitabile dopo l’inoculazione del patogeno; ma in realtà la totale ricomparsa della malattia nell’individuo infettato sperimentalmente può non avvenire, a causa del principio di “attenuazione della virulenza” = la prolungata incubazione di colture di microrganismi patogeni al di fuori dell’ospite ne induce la perdita della capacità di causare la malattia; tali microrganismi possono anzi sviluppare addirittura una risposta immunitaria nell’organismo, proteggendolo da una successiva iniezione di patogeni. ( nascita vaccini)

I postulati di Koch hanno perciò più che altro un valore storico, restando validi esclusivamente per agenti patogeni di elevata virulenza. I microrganismi che NON soddisfano i postulati vengono detti “patogeni opportunisti” = microrganismi normalmente poco o affatto virulenti, ma che possono divenire patogeni in occasione di una condizione di mancata resistenza immunologica dell’organismo ospite (es. infezioni provenienti dall’ambiente in un determinato periodo).

Replicazione DNA

La replicazione (o duplicazione) è il meccanismo attraverso cui viene prodotta una copia del DNA cellulare. Ogni volta che una cellula si divide, l'intero genoma deve essere duplicato per poter essere trasmesso alla progenie (tramite mitosi o meiosi). Il meccanismo della replicazione richiede l'intervento di numerosi enzimi e di proteine iniziatrici. Il processo di replicazione del DNA si definisce semiconservativo: il doppio filamento di DNA parentale funge da stampo per la sintesi di due filamenti figli complementari.

Nei procarioti

• Proteina iniziatrice (DnaA) si lega alla doppia elica nel punto di origine della replicazione (Ori) e, utilizzando l’energia ricavata dall’ATP, inizia a svolgere il DNA.
• La DNA elicasi continua a svolgere il DNA, nel frattempo la DNA girasi facilita la separazione dei filamenti grazie a superavvolgimenti negativi a monte dell’elicasi. Filamenti slegati vengono mantenuti separati da proteine che si legano a filamenti singoli (SSBP)  permettendogli di fare da stampo formazione di una forcella di replicazione.

A questo punto la duplicazione del DNA procede con la sintesi di due filamenti stampo: uno veloce che procede in modo continuo, e uno lento che procede in modo discontinuo.

Filamento veloce

• Una primasi (proteina DnaG) si lega al primo filamento e sintetizza un corto innesco di RNA complementare al DNA stampo.
• La DNA polimerasi III usa questo innesto per sintetizzare il DNA e aggiunge nuovi nucleotidi alla sua estremità 3’. La sintesi procede poi in direzione 5’-3’.

Filamento lento

• Sul secondo filamento viene sintetizzato un altro innesco di RNA da dove successivamente la DNA polimerasi III inizierà la sintesi.
• Sul filamento lento però la sintesi del DNA è discontinua poiché la DNA pol è costretta a leggere in direzione opposta a quella di srotolamento del DNA. Per permettere questo meccanismo sono perciò necessari più inneschi di RNA.
• La DNA pol sarà quindi in grado di sintetizzare non in modo continuo, bensì passando da un primer all’altro, formando quindi dei frammenti detti frammenti di Okazaki.
• Terminata la sintesi di un frammento la DNA pol si stacca e torna a legarsi al nuovo primer sulla forcella di replicazione.
• Una volta che tutto il filamento viene copiato entra in azione la DNA polimerasi I che rimuove i primer e lo sostituisce con DNA.
• Infine la DNA ligasi unisce i frammenti di Okazaki adiacenti con legami fosfodiesterici.

N.B: la sintesi del filamento lento si svolge in direzione opposta rispetto al filamento veloce, questo fa sì che il filamento lento neo sintetizzato formi un loop tra la polimerasi e la forcella di replicazione.

DNA polimerasi III

Funzioni:

• Polimerasica = aggiunge nuovi nucleotidi al filamento
• Anti-errore = individua eventuale aggiunta di un nucleotide sbagliato al filamento
• Esonucleasica = in caso di errore la DNA polimerasi inverte la sua direzione di marcia rimuovendo i nucleotidi uno a uno fino ad arrivare al nucleotide sbagliato, che viene sostituito con quello corretto

Inibitori della replicazione

• Actinomicina: intercalante del DNA. Grazie alle loro proprietà idrofobe, gli agenti intercalanti sono in grado di inserirsi tra due basi azotate lungo i filamenti della doppia elica. Quando la cellula inizia il suo ciclo replicativo e il punto in cui si è inserito l'agente intercalante viene raggiunto dalla DNA polimerasi, questa non lo distingue dalle basi azotate adiacenti e procede inserendo un nucleotide che si appaia con l'agente intercalante. Ciò provoca mutazioni genetiche di frameshift e di conseguenza prodotti genici non funzionali. Questo tipo di antibiotici intercalanti sono utilizzati soprattutto come anti-tumorali poiché bloccano la crescita cellulare.
• Chinoloni, norfloxacina: inibitori della DNA girasi. Tutti i composti chinolonici inibiscono l'azione di due enzimi appartenenti alla classe delle topoisomerasi: l'enzima girasi e la topoisomerasi IV; entrambi sono coinvolti nell'isomerizzazione spaziale dell'alfa-elica (DNA girasi) e nel mantenimento della separazione tra il filamento stampo e il filamento inerte nel processo di replicazione batterica.

Interazioni proteina-DNA

• Proteine aspecifiche histon like protein (legano DNA in maniera non sequenza specifica)
• Proteine specifiche  Proteine particolari SSBP (mantengono separati i due filamenti durante la replicazione), IHF o H-NS (legano sequenze ricche di A/T)

Trascrizione

La trascrizione è il processo mediante il quale l’informazione contenuta in un gene (DNA) viene copiata (trascritta) in una molecola di RNAm. “Trascrizione” perché vi è un trasferimento di informazione da un acido nucleico a un altro, utilizzando quindi lo stesso linguaggio base.

Nei procarioti (avviene nel citoplasma)

• Il processo inizia con il legame della RNA polimerasi a un promotore (sequenza di DNA) che induce un locale srotolamento della doppia elica del DNA.
• Utilizzando uno dei due filamenti di DNA come stampo la RNA polimerasi inizia la sintesi di una catena di RNA.
• RNA polimerasi si muove quindi lungo il DNA stampo srotolando la doppia elica ed allungando la catena di RNA aggiungendo via via nuovi ribonucleotidi all’estremità 3’ del filamento nascente.
• Infine l’enzima trascrive una particolare sequenza (terminatore) che termina la sintesi dell’RNA e porta alla dissociazione della RNA polimerasi dallo stampo di DNA seguito dal rilascio della molecola di RNA neosintetizzata.

RNA polimerasi

È un enzima complesso composto da diverse subunità. Il complesso ααββ viene definito core enzyme e possiede l’attività catalitica per la sintesi dell’RNA a partire da una molecola stampo di DNA. Questo però è in grado di legare i promotori solo in presenza del fattore σ, che conferisce un riconoscimento specifico. L’assemblaggio del core enzyme insieme al fattore σ porta alla formazione dell’oleoenzima. L’oleoenzima quindi si lega al promotore, separa la doppia elica del DNA e comincia a formare RNA, una volta che la trascrizione è innescata allora il fattore σ si stacca.

Promotore

È una regione di DNA costituita da specifiche sequenze dette consenso, si trova a monte del gene di cui inizia la trascrizione ed è lungo circa 200 bp. La sequenza consenso rappresenta la successione migliore di basi, riconosciuta dall'RNA polimerasi per legarsi allo stampo e dare avvio alla trascrizione. Nei procarioti il promotore si compone di tre parti:

• Un sito di inizio (quasi sempre una purina)
• Una sequenza che si trova a -10 (rispetto al sito di inizio della trascrizione), formata da sei paia di basi (con funzioni analoghe alla TATA box eucariotica e sequenza TATAAT)
• Una sequenza a -35 (rispetto al sito di inizio della trascrizione) contenente sei paia di basi con sequenza TTGACA

Gli elementi -10 e -35 sono separati da un frammento non specifico formato da 17-19 nucleotidi.

Terminatore

È la sequenza palindroma in grado di bloccare la trascrizione di un gene. Nei procarioti esistono due tipi di terminatore:

• Terminatore intrinseco o rho-indipendente: in questo sito l'oloenzima è in grado di terminare la trascrizione senza l'intervento di fattori esterni. La terminazione è causata dalla formazione di strutture secondarie intramolecolari nell'RNA nascente. Tali strutture, dette strutture a forcina, si formano per adesione di regioni complementari ed impediscono all'RNA polimerasi di procedere oltre. La struttura a forcina, chiamata anche stem-loop, caratterizzata da una lunghezza di 7-20 coppie di basi, presenta uno stelo (la regione in cui i due filamenti si appaiano per effetto della complementarità) ricco in coppie guanina-citosina molto stabili. Lo stelo è poi seguito da una serie (circa 6) di residui di uracile, che si appaiono debolmente alle adenine del DNA stampo. Una proteina legata a RNA polimerasi (nusA) si lega saldamente alla struttura stem-loop, in modo da causare l'arresto temporaneo dell'enzima stesso. Tale pausa coincide con la trascrizione della sequenza di poli-uracile. I legami deboli adenina-uracile destabilizzano il duplex RNA-DNA, generando il rilassamento e la dissociazione dalla RNA polimerasi. Le strutture stem-loop seguite da una sequenza di poli-uracile, possono causare l'arresto della RNA polimerasi; in genere però possono continuare la trascrizione data la stabilità del duplex.
• Terminatore rho-dipendente: tale terminazione è controllata dalla capacità del fattore Rho di accedere all'RNA. A causa della presenza di un ribosoma che traduce l'mRNA, Rho non può caricarsi sull'RNA appena formato fino alla fine del gene o dell'operone. A quel punto il ribosoma non si muove più lungo l'mRNA, e quindi il segmento di RNA appena formato che emerge dall'RNA polimerasi diventa accessibile a Rho. La RNA polimerasi si ferma sulla sequenza di terminazione grazie alla presenza di un sito specifico (Rho-sensibile) 100 nucleotidi a monte dal punto di legame per Rho. Quindi, la proteina Rho, una volta riconosciuta la sequenza di legame si lega all'RNA e risale la catena fino a raggiungere la RNA polimerasi. Il fattore Rho (ρ) è un complesso proteico composto da subunità identiche a forma di anello con un dominio distinto di legame per l’RNA e un dominio per l'ATP; l'attività elicasica ATP-dipendente gli consente di dissociare l'ibrido DNA-RNA. Questo fattore si lega in modo specifico a siti detti Rut (da Rho utilization) all'estremità 5' dell'RNA appena formato. Tali siti sono ricchi in citosina, poveri in guanina e non formano strutture secondarie. In un processo dipendente da ATP, Rho scorre lungo l'RNA alla ricerca dell'RNA polimerasi la quale è ferma sulla struttura stelo-ansa del terminatore. Una volta raggiunta, Rho svolge il debole ibrido DNA-RNA provocando la terminazione della sintesi dell'RNA e il rilascio di tutti i componenti. Entrambi i terminatori inducono un arresto della RNA polimerasi, situazione necessaria perché si verifichi la terminazione.

La trascrizione negli archea

Somiglianze con Eucarioti:

• Complessità dell’RNA polimerasi
• Presenza di introni in alcuni geni
• Insensibilità a rifampicina ed altri antibiotici che inibiscono la trascrizione dei batteri

Somiglianze con Batteri:

• mRNA policistronico (presenza di operoni)
• mRNA privi di sequenza leader (non sono necessarie delle sequenze specifiche d’inizio)

Traduzione

La sintesi proteica (traduzione) è l’ultima tappa del processo di espressione di un gene. “Traduzione” perché avviene un cambiamento di linguaggio, dai nucleotidi di un RNAm agli amminoacidi di una catena polipeptidica. Gli RNA trascritti in precedenza e pr...