Resistenza agli antibiotici

Studio sugli antibiotici

In terapia sono stati studiati circa 6 mila differenti principi attivi, ma solo circa 150 possono essere usati in terapia sia a livello ospedaliero che non.

Gli antibiotici sono divisi in diverse classi; i più frequenti sono i beta-lattamici che occupano il 55%, di cui il 37% sono cefalosporine semisintetiche e il 17% penicilline semisintetiche. Abbiamo poi i chinoloni per il 14% che sono antibiotici sintetici, i macrolidi che possono essere sia naturali che semisintetici e infine le tetracicline.

Un aspetto fondamentale quando si lavora con gli antibiotici è verificarne l'attività antimicrobica. Questo vale sia per i nuovi principi isolati, sia per quelli già in commercio per valutarne la stabilità o l'efficacia su nuovi ceppi microbici. È perciò necessario mettere a punto sei saggi di attività.

Si può avere un duplice approccio:

• Qualitativo: su quali microbi agisce
• Quantitativo: quanto antibiotico è necessario per inibire la crescita dei microbi

concentrazione battericida, si tratta di un test che determina la concentrazione minima di un antibiotico necessaria per uccidere i batteri. Questo test viene eseguito utilizzando una serie di diluizioni dell'antibiotico e inoculando i batteri su piastre di agar contenenti l'antibiotico diluito. La concentrazione minima battericida è quella in cui non si osserva alcuna crescita batterica dopo un periodo di incubazione. Inoltre, esistono anche altri metodi per valutare la crescita microbica e l'efficacia degli antibiotici, come il test di sensibilità agli antibiotici mediante disco-diffusione, il test di diluizione in brodo e il test di diluizione in agar. La crescita microbica può essere influenzata da diversi fattori, come la temperatura, il pH, la presenza di sostanze nutritive e la presenza di antibiotici. È importante valutare la crescita microbica e la sensibilità agli antibiotici al fine di determinare il trattamento più efficace per combattere le infezioni batteriche.

concentrazione battericida 11

Resistenza agli antibiotici

Metodo di Kirby Bauer o metodo dell'alone di inibizione:

Si basa sul principio dell'agar diffusione, cioè si pone uno o più dischetti su una piastra petri contenente un terreno di coltura agarizzato e inoculato con un microorganismo e si va a misurare dopo 24 ore se si è sviluppato un alone di inibizione della crescita microbica.

Se l'antibiotico è efficace non dobbiamo avere delle colonie intorno al dischetto.

Questo è un metodo qualitativo, ma anche semi-quantitativo, perché se l'antibiotico è efficace a maggiori quantità di antibiotico si aspetta un alone più grande.

Si dice semi-quantitativo perché non permette di collegare il corretto dosaggio di antibiotico al dosaggio terapeutico da fornire in vivo.

È però comunque un metodo utile per capire se l'antibiotico è efficiente su un

determinatomicrorganismo e per confrontare l'efficacia di antibiotici differenti. Possono però capire degli episodi anomali. Si vede che intorno al dischetto pur essendoci un alone di inibizione ci sono delle colonie. Queste colonie possono essere dei batteri diventati resistenti, o può succedere perché il principio attivo non è penerato bene nell'agar e ci sono zone in cui quindi non di è diffuso e non ha ucciso i batteri. Determinazione della MIC: la MIC è la concentrazione più bassa di composto antimicrobico capace di inibire la riproduzione cellulare del microorganismo che vogliamo saggiare dal punto di vista della sensibilità verso il composto stesso. Ci sono 3 metodi differenti: - microdiluzione: su piastro microtiper contenenti 96 pozzetti - macrodiluzione; su provette che contengano fino a 3 ml di terreno liquido - agar diluzione: si utilizza quando un composto antimicrobico è poco solubile nel brodo di coltura. Pocosolubile perché non si riesce a mischiarsi con la componente acquosa del brodo. Viene quindi aggiunto del terreno di coltura solido delle piastre petri. 12 Resistenza agli antibiotici Il principio è che dopo aver aggiunto nelle varie provette la stessa quantità di terreno liquido (primi casi) contenente il microorganismo a concentrazione nota (preparo un bordo a concentrazione nota usando uno spettrofotometro che calcola la torbidità della coltura dopo 24 h). Se si tratta di agar diluzione allora si aggiunge nel terreno quando ancora non è solidificato una quantità nota di microorganismi. Dopo aver preparato i pozzetti, le provette o le capsule petri, si aggiunge il composto antimicrobico di cui vogliamo testare l'efficienza. Si diluisce nei vari pozzetti, provette o capsule l'antimicrobico. Fatto questo si incuba per 24h. Al termine delle 24h, la MIC si determina come assenza visibile della crescita microbica. Nell'immagine si vede.usata la microdiluzione. In questo caso si vede che la MIC corrisponde alla prima provetta limpida, cioè ad una concentrazione di antibiotico pari a 1.6 mcg/ml. La MIC si valuta quindi con un'osservazione visiva. In alcuni casi succede che i composti non puri e sostanze organiche particolari che queste agiscono con i componenti del terreno di coltura e danno una certa torbidità. In questi casi, per valutare la MIC, bisogna prelevare un campione da ogni provetta e osservarlo al microscopio. La prima provetta in cui non si ha crescita a livello microscopico corrisponde al valore di MIC. I batteri hanno tutti la stessa sensibilità ai diversi antibiotici? NO, i batteri, sia della stessa specie che del genere, possono avere diverse sensibilità agli antibiotici. Quando si determina la MIC, il valore ottenuto è indicativo solo alla sensibilità di quel ceppo microbico a quel determinato antimicrobico. Più ceppi (sierotipi) appartenenti alla stessa specie possono avere.

sensibilità differenti.I ceppi wildtype inoltre hanno sensibilità minore rispetto ai ceppi di collezione. 13Resistenza agli antibioticiQuindi è importante quando si scoperte un nuovo antimicrobico fare il test della MIC50.Cioè si a determinare la MIC sul 50% dei ceppi saggiati.Si va a valutare quale sia quindi la minima concertazione di antibiotico in grado di inibire il 50%dei sierotipo che sto testando.La MIC90 allo stesso modo consente di valutare la MIC sul 90% dei ceppi saggiati.Il valore di MIC50 e MIC90 cambia molto a seconda degli antibiotici sui vari ceppi batterici.Questi test sono molto importanti per capire la reale efficacia di un antibiotico, nel caso questovenga usto per la terapia clinica.Grazie alla determinazione delle MIC vedo quantitativamente se l’antibiotico ha un azioneantimicrobica.Non ci dice però se l‘antibiotico ha azione batteriostatica o battericida.Per fare ciò bisogna fare il test della MBC

Cioè la minima concentrazione battericida. MBC è il valore espresso in microgrammi/ml o milligrammi/ml, che indica la più bassa concentrazione di sostanza antibiotica necessaria per ridurre la carica microbica presente del 99.9%. È quindi la minima concentrazione di antibiotico in grado di uccidere i batteri.

Per testare la MBC, vado a prendere tutte le provette limpide della MIC; da ogni provetta si prende un aliquota minima (circa 20 microlitri) del brodo di coltura, e la vado ad inoculare in una coltura sterile (su una piastra o in provette contenenti brodo). Inoculo per 24h.

Osservo le provette o piastre limpide senza colonie. La prima piastra senza colonie indica la MCB.

Togliendo una minima parte della colonia e diminuendola in un nuovo terreno sterile, inibisco l'azione dell'antimicrobico e rivitalizzo le cellule eventualmente presenti; nel caso non ci sono cellule è perché sono tutte morte.

indicano la MCB. Grazie quini alla MCB possiamo capire se l'antibiotico è battericida o batteriostatico. A livello fisiologico quando si aggiunge un antibiotico batteriostatico, nel nostro organismo il numero di cellule non aumenta più, ma i batteri agenti di infezione rimangono tali. È comunque utile usare un antibiotico batteriostatico perché in questo modo blocchiamo la proliferazione del batterio. È poi il sistema immunitario che uccide i batteri che non sono più in grado di riprodursi. Se somministrai una antibiotico battericida il numero di cellule batteriche agenti di infezione progressivamente cala, e quindi l'azione del sistema immunitario è ancora più rapido. Il numero di cellule cala in diversi momenti a seconda di quando si somministra l'antibiotico. I saggi per determinare la MIC o la MBC pur essendo utili per valutare l'efficacia di una antibiotico non danno informazioni sui danni che

L'antibiotico reca ai batteri ce dopo l'allontanatodell'antibiotico stesso. Per cui sono utili altri due tipi di saggi:

effetto post antibiotico: l'effetto post antibiotico è la capacità del farmaco di continuare inibire lacrescita batterica anche dopo che la sua concentrazione è calata al di sotto del valore d MIC. Questo saggio si realizza prendendo una coltura batterica in fase esponenziale, e si mete a contattoun antibiotico a concentrazione variabile (solitamente è 4 volte la MIC) e lo si lascia a contato per 1ora. Dopo 1 ora, si toglie l'antibiotico e si mette la coltura in incubazione a 37°. A questo punto si preleva dalla coltura delle aliquote e si semina in tempi prefissati, fino a 24 h didistanza dall'allontanamento dell'antibiotico. Questo effetto si misura facendo la differenza tra il tempo richiesto alla coltura che è stato acontatto con l'antibiotico per 1 ora e alla colonia di controllo,

Per aumentare il proprio titolomicrobico di 1log a livello di CFU (unità formanti colonia), si può effettuare un saggio di idrofobicità o di idrofilicità. In questo saggio si valuta l'effetto antiadesivo di una sostanza antimicrobica.

Si misura la capacità di un antibiotico, dopo che è stato a contatto con la coltura, di aumentare l'idrofobicità delle cellule batteriche. Le cellule batteriche normalmente aderiscono al tessuto, ma dopo il contatto con l'antibiotico diventano idrofiliche.

Si mette in contatto la coltura batterica con la sostanza antibiotica (4 volte la MIC), e una volta tolto l'antibiotico si osserva come si ripartisce la coltura batterica in una sospensione contenente una fase oleosa e una acquosa.

Se la coltura batterica si dispone più verso la parte acquosa significa che ha aumentato l'idrofilicità e quindi ha perso la sua capacità di aderire ad un substrato di tipo lipofilo.

Si determina quindi la capacità di una coltura batterica di

essere ancora in grado o meno di aderire ad un substrato