Appunti resistenza agli antibiotici

Test di inibizione dell'agar a disco di Kirby Bauer

Il metodo di Kirby Bauer si basa sulla posizionamento di uno o più dischetti su una piastra di Petri contenente terreno di coltura agarizzato, precedentemente inoculato con un determinato organismo. Dopo 24 ore, viene misurato un alone di inibizione della crescita microbica intorno al dischetto stesso, indicando se l'antibiotico è efficace o meno.

Questo metodo può essere utilizzato in modo qualitativo e semi-quantitativo:

• Qualitativo: permette di correlare la concentrazione dell'antibiotico all'efficacia antimicrobica. A maggiori concentrazioni nel dischetto, si avrà una maggiore azione inibente e quindi un diametro dell'alone di inibizione più grande.
• Semi-quantitativo: non permette di correlare il dosaggio corretto di antibiotico al dosaggio terapeutico da somministrare in vivo. Tuttavia, è comunque un metodo utile per valutare l'efficacia dell'antibiotico.

Utilizzando questo test è possibile determinare se un antibiotico è efficace nel prevenire la crescita di colonie microbiche.

è e cace su microrganismo oppure se agisce su microrganismi differenti. Talvolta possono comunque formarsi colonie batteriche anche se l'antibiotico è efficace. Questo può succedere se il principio attivo non si distribuisce bene nell'agar oppure se i batteri sono mutati e sono diventati resistenti all'antibiotico. La determinazione della MIMIC (minima concentrazione inibente) è la quantità più bassa di composto antimicrobico capace di inibire la riproduzione cellulare del microrganismo che vogliamo saggiare dal punto di vista della sensibilità verso il composto antimicrobico. Ci sono tre metodi diversi per determinare la MIMIC: - Microdiluizione: si utilizzano piastre microtiter contenenti solitamente 96 pozzetti. - Macrodiluizione: si utilizzano provette che possono contenere fino a 3 mL di brodo di coltura a cui viene aggiunto l'antibiotico. - Agar-diluzione: si utilizza quando il composto antimicrobico è poco solubile nel brodo di coltura.coltura(poco solubile perché non si riesce a miscelare bene con la parte acquosa del brodo di coltura—> aggiunto al terreno solido quando questo non è ancora solidificato nelle piastre Petri). Micro/macrodiluzione: dopo aver aggiunto la stessa quantità di terreno di coltura liquido contenente microrganismo a concentrazione nota (si usa spettrofotometro per misurare torbidità di coltura microbica, poi si aggiunge al brodo di coltura, che poi verrà aggiunto ai vari pozzetti o provette). Agar-diluizione: si aggiunge quantità nota di microrganismi quando il terreno non è ancora solidificato. Poi si aggiunge composto antimicrobico di cui vogliamo saggiare l’efficacia, si diluisce cioè serialmente nei vari pozzetti / provette / piastre, poi si mette in incubazione per 24h. MIC poi si determina come assenza visibile della crescita microbica in pozzetto / provetta / piastra. Valore di MIC => più bassa concentrazione di antibiotico.capace di inibire la crescita dimicrorganismo.
MIC si valuta tramite osservazione visiva.
Talvolta però i composti non puri o alcune sostanze organica particolari reagiscono concomponenti del terreno di coltura, e quindi generano una certa torbidità —> per valutare MICbisogna prelevare campione da varie provette in sequenza e osservarla al microscopio.
Provetta in cui risulta non crescita a livello microscopico (non vedo cellule nel vetrino) sarà ilvalore di MIC.
10fi ffiffi ff C ff ff ffi fi ffi fi fi ffi ffi
Batteri appartenenti a specie di erenti o a stessa specie NON hanno stessa sensibilità ai diversiprincipi attivi.
Ceftazidima => cefalosporina ad ampio spettro.
Quando si determina la MIC, valore ottenuto è indicativo di sensibilità di solo quel ceppomicrobico che stiamo testando nell’esperimento.
Più ceppi appartenenti a stessa specie possono avere sensibilità di erente.
Questo si osserva soprattutto quando si

testa gli antibiotici su batteri wild type (=di isolamento ambientale, clinico), che hanno sensibilità minore rispetto a quella dei ceppi tipizzati, di collezione. Per avere idea chiara di reale efficacia di un antibiotico, quando si scopre un nuovo principio attivo, oltre alla MIC 50 o 90, si testa la MIC su un singolo sierotipo batterico. Si realizza anche un saggio per misurare la minima concentrazione inibente sul 50% dei ceppi saggiati (=la minima concentrazione di antibiotico capace di inibire il 50% di un certo numero di sierotipi, ceppi batterici che sto testando) o sul 90% dei ceppi saggiati. Il valore di MIC 50 o 90 cambia per i vari ceppi di antibiotico.

Esempio:

Batterio	MIC 50 (μg/mL)	MIC 90 (μg/mL)
Klebsiella pneumoniae	0.05	1.6
Pseudomonas spp.	6.3	50

Grazie alla determinazione della MIC, posso vedere quantitativamente se un antibiotico ha azione antimicrobica, se è batteriostatico o battericida. La MIC, però, non dice se un antibiotico è anche

in grado di uccidere i batteri —> per capire ciò devo fare saggio MBC (=minima concentrazione battericida). MBC è un valore espresso in μg/mL o mg/mL che indica la più bassa concentrazione di antibiotico necessaria per ridurre la carica microbica presente del 99.9%. L'effetto è battericida, cioè è la minima concentrazione di antibiotico capace di uccidere i batteri. Parto da MIC: considero valori da MIC in su. Da ogni provetta prelevo una quantità minima di aliquota di brodo di coltura (circa 20 μL) e la ri-inoculo in un terreno di coltura sterile, poi metto in incubazione per 24h, poi osservo quali sono provette limpide o piastre senza colonie, che corrispondono a MBC. Tecnicamente, togliendo una aliquota minima di brodo di coltura da provette di MIC in su e aggiungendola a terreno sterile, diluisco e annulla l'effetto inibente di quantità di antibiotico in 20 μL, ma rivitalizzo le cellule presenti (se sono ancora vitali); se

Le cellule sono morte, quindi non avranno crescita microbica.

Grazie a MIC o MBC posso capire se l'antibiotico è batteriostatico o battericida.

Un antibiotico batteriostatico non uccide le cellule batteriche, ma blocca la loro divisione cellulare, inibendo la crescita dei batteri. Il numero delle cellule non diminuisce quando l'antibiotico viene aggiunto all'organismo, ma il batterio non scompare. Successivamente, il sistema immunitario interviene ed elimina i batteri rimasti, che non sono più in grado di riprodursi.

Un antibiotico battericida, invece, uccide le cellule batteriche e il numero delle cellule batteriche diminuisce progressivamente quando l'antibiotico viene introdotto. Inoltre, la reazione del sistema immunitario è ancora più rapida.

L'azione battericida può essere influenzata da alcuni parametri.

I saggi per determinare MIC o MBC non forniscono informazioni sui danni che l'antibiotico arreca ai batteri, cioè sull'effetto e la persistenza dell'attività antimicrobica quando l'antibiotico viene allontanato dalla coltura.

—>e etto post antibiotico saggio di idrofobicità/idro licità.servono altri saggi, come oE etto post-antibiotico => capacità del farmaco di continuare a inibire la crescita batterica anchedopo che la sua concentrazione è calata sotto il valore di MIC.Misura e etto più o meno prolungato che antibiotico ha sui batteri.Si prende coltura batterica in fase esponenziale, si mette a contatto con antibiotico aconcentrazione variabile (solitamente 4 volte la MIC), si lascia a contatto per 1h, poi si allontanal’antibiotico e si mette la coltura batterica in incubazione a 37 °C, poi si e ettuano semine inpiastra a tempi pre ssati, anche no a 24h di distanza.E etto post-antibiotico si misura facendo di erenza tra tempo richiesto a coltura che è stata acontatto con antibiotico per 1h e alla coltura controllo per aumentare il proprio titolo microbico di1 logaritmo a livello di CFU (=unità formanti colonie in piastra).Saggio di

La idrofobicità permette di valutare l'effetto antiadesivo di una sostanza antimicrobica. Si misura misurando la capacità della sostanza antimicrobica, dopo il contatto con la coltura, di far aumentare l'idrofobicità delle cellule batteriche. Le cellule batteriche normalmente aderiscono al tessuto, solo lipo le; dopo il contatto con l'antibiotico dovrebbero diventare più idrofobiche.

Si mette a contatto la coltura batterica dopo crescita overnight con la sostanza antibiotica a un valore variabile di MIC (3, 4 volte la MIC stessa) per 1h di contatto. Poi si allontana l'antibiotico e si guarda come si ripartisce la coltura batterica in una sospensione contenente fase acquosa e fase oleosa costituita da n-ottano. Se la coltura batterica migra di più verso la fase acquosa vuol dire che è aumentata l'idrofobicità, quindi ha perso capacità di aderire a substrato lipo lo.

Il saggio di idrofobicità è una misura indiretta di...

Capacità dei batteri di aderire o meno a un tessuto dopo il contatto con l'antibiotico. Grazie a MIC e MBC posso capire l'attività antimicrobica di un battericida. Un antibiotico batteriostatico colpisce le funzioni cellulari che non determinano la morte del batterio, ma impediscono alla cellula batterica di riprodursi. Un antibiotico battericida colpisce bersagli fondamentali per la sopravvivenza delle cellule stesse. Gli antibiotici sulfamidici e il trimethoprim sono singolarmente batteriostatici, ma se agiscono come combinati insieme hanno un effetto battericida, perché bloccano due passaggi distinti dello stesso metabolismo cellulare, che combinati insieme portano alla morte della cellula.

Lezione 4

Dal punto di vista delle tecniche microbiologiche, qual è la differenza tra agar-diffusione e agar-diluizione? Agar-diffusione si basa sulla diffusione di una sostanza antibatterica o antifungina mediante l'uso di un supporto depositato sulla superficie di una piastra Petri.

contenente terreno agarizzato, che viene precedentemente inoculata con microrganismo di cui si vuole saggiare sensibilità. Dischetto nel tempo rilascia sostanza antimicrobica, e poi si misura l'eventuale attività antimicrobica della sostanza misurando l'alone di inibizione. È metodo alla base della tecnica di Kirby Bauer. Agar-diluizione usa sempre piastre Petri con terreno agarizzato, ma permette di valutare MIC quando sostanza non è sufficientemente solubile per essere inoculata nel terreno di coltura liquido. Serie di diluizione al raddoppio dell'agente antimicrobico nel terreno di coltura agarizzato caldo (=ancora liquido), fino a che terreno permetta migliore diffusione di principio attivo. Dopo 24h di incubazione si valuta la MIC osservando la diversa crescita nelle piastre Petri. Antibiotici batterici Antibiotici possono essere: - batteriostatici => principi attivi che agendo su cellule microbiche