Replicazione Virale, Lezione 2

In questo caso la situazione è un po’ diversa perché ci sono delle proteasi che permettono il clivaggio e la

fuoriuscita dalla cellula attivata e dall’acidificazione.

Questo è il picornavirus che tramite la formazione di pori immettono direttamente il proprio genoma nel

citoplasma, quindi né endocitosi né fusione.

Allora, per quanto riguarda le proteine di fusione abbiamo detto

che al primo gruppo appartiene l’emoagglutinina. Questa è

costituita da due subunità e il peptide esogeno è rappresentato

dalla subunità 2 presente all’N-terminale, cioè l’N-terminale

contiene il peptide esogeno; una volta che l’emoagglutinina è

riuscita ad interagire con la superficie della cellula ospite, quali

appunto le cellule del sistema respiratorio, abbiamo un clivaggio

della proteina stessa perché ci sono dei siti specifici per le

proteasi simile alla tripsina che in pratica permettono

l’esposizione dell’H2 in particolare della porzione N-terminale dell’H2 che media il processo di fusione.

Il cambio di ph è necessario affinché ci sia

quest’esposizione; per questo il virus presenta nel suo

involucro questa proteina che si chiama M2 che a ph

acido può formare questo canale ionico e permette

l’acidificazione e questo cambio di conformazione dell’HA

con il seguente distacco dell’M2 affichè il virus possa

uscire e rilasciare il genoma.

Un’altra proteina di fusione è rappresentata dalla proteina GB

del virus dell’ herpes, appartenente alla famiglia delle

glicoproteine vas che costituiscono i complessi per l’adesione,

e media proprio il processo di penetrazione. Abbiamo un

primo complesso che va a riconoscere l’acido sialico delle

membrane cellulari. L’interazione della proteina GB con il

complesso gHgL permette la fuoriuscita, poi ci sono una serie

di proteine accessorie che sono specie-specifiche, come gD,

GP50, UL130, UL138 gp42, che sono diverse a seconda della

specie di Herpes. L’elemento costante è appunto questa

proteina GB e la glicoproteina gHgL che vengono coinvolte nel processo di fusione.

Qui abbiamo una sequenza di eventi che permettono la fusione dell’envelope dell’herpes con la membrana

cellulare. Il processo di interazione è mediato dalla glicoproteina D che va a riconoscere la nectina 1,

questo in HSV di tipo 1, come possiamo vedere dall’immagine. Dopo di che, nella fase successiva,

abbiamo un cambiamento conformazionale per l’interazione tra gHgL. L’aggiustamento di questa struttura a

sua volta determina un’interazione con il peptide fusogeno gB e con il gruppo di glicoproteine gHgL già

associate di per sé. La variazione di questa struttura permette l’avvicinamento di questo complesso alla

membrana cellulare e si ha il processo di fusione con conseguente integrazione dell’envelope dell’hsv nella

membrana cellulare. E’ chiaro che sia per quanto riguarda l’emoagglutinina dell’orthomyxovirus sia per gB

gHgL, possiamo ritenere questi peptidi di fusione del processo di adesione-fusione come dei target per i

farmaci di nuova generazione, creare quindi

degli antipeptidi che possano mimare l’attività

delle glicoproteine di fusione e non, anche

recettoriali semplicemente, che possano

prevenire l’interazione delle glicoproteine virali

con i propri recettori, quindi occupare, saturare, i

recettori cellulari e impedire così l’interazione o

anche creare dei peptidi complementari che

possano interagire con le glicoproteine stesse

bloccandone l’attività quindi non rendendole più

disponibili e impedendo che entrino in contatto

con la cellula target.

L’esposizione dell’acido nucleico: possiamo

vedere come l’evento principale, soprattutto per

quelli che presentano capside, è il trasporto

attraverso il citoscheletro cellulare mediato dalle proteine capsulari oppure l’esposizione diretta mediante

attività enzimatica presente anche a livello virale o processi di fosforilazione che permettono così l’utilizzo

del genoma da parte di enzimi virali ma anche enzimi cellulari per procedere poi alla sintesi

macromolecolare. Questi sono gli eventi schematizzati a seconda del tipo di virus, se viene esposto

direttamente il genoma. Nel caso dei Poxvirus, essendo molto grandi, avendo una grossa quantità di dna,

gli enzimi che vengono utilizzati per le sintesi macromolecolari sono enzimi già presenti nel capside virale

stesso.

La fase di uncoating, quindi di esposizione dell’acido nucleico, prevede una situazione di totale eclissi delle

particelle virali all’interno delle cellule e questo proprio perché il virus si prepara a replicarsi, e quindi

“disgregandosi” non è visibile seppur presente. I periodi di eclissi possono durare dalle 4 alle 6 ore ma

dipende dal tipo di genoma e dalla specie di virus.

Sintesi macromolecolare: intendiamo la trascrizione del genoma

in rna messaggeri ma anche replicazione del genoma così come

traduzione del dna e quindi del progetto genomico, dna o rna che

sia (template), per la produzione di proteine. Diciamo che per i

virus il dogma centrale viene sconvolto dalla conoscenza dei

processi di replicazione virale, ancor di più con i prioni ecc.,

poiché non vi era più questo flusso unico e costante da un gene,

una proteina ecc. Abbiamo già

visto, che

quando i virus sono a rna, devono avere delle rna polimerasi rna dipendenti proprie. Devono essere

presenti o venir sintetizzate precocemente per poter innescare la sintesi di dna o del genoma. Questo

perché nella cellula non abbiamo rna polimerasi rna dipendenti nelle cellule eucariotiche e soprattutto non

si presenta mai un ibrido a rna o dna a doppio filamento; queste sono le due cose che differenziano una

cellula infettata da una cellula non infettata, poiché nella cellula infettata troveremo questi due elementi.

Questi sono quindi gli enzimi di cui il virus si deve servire per arrivare all’rna messaggero; generalmente il

dna a singola o a doppia catena sono trascritti nel nucleo.

Diverse specie di virus sfruttano il complesso del poro nucleare

(sappiamo che la membrana è tempestata di queste strutture) per

poter permettere al proprio genoma di penetrare all’interno del dna.

Nel caso degli orthomyxovirus parliamo di 8 segmenti di rna che

vengono trascritti nel nucleo; l’herpes, allo stesso modo, inietta in

maniera quasi integra all’interno il proprio dna che circolarizza

all’interno del virus stesso. Nel caso degli adenovirus invece la

molecola iniettata sarà di tipo lineare; e poi ci sono gli hepadnavirus,

poliomavirus, ecc. quindi arrivano al nucleo per poter poi agire.

Per classificare i virus, oltre a verificarne la struttura, secondo

Baltimor, è utile far riferimento al tipo di genoma che contengono nel proprio nucleo capside e alle modalità

di replicazione che sfruttano, sia per replicare il dna che per sintetizzare rna messaggero. Nel caso della

classe 1, dove abbiamo adenovirus, herpesvirus, abbiamo il genoma circolare che sfrutta un sistema di

“rolling cirle” (sfruttato anche dai batteri per la sintesi di genoma che circola rizza all’interno del prorpio

nucleo), abbiamo la sintesi di proteine precoci e tardive, queste ultime rappresentate da proteine strutturali

tra cui quelle capsidiche. Noi partiamo da questo dna che fungerà da stampo sia per la sintesi di rna

messaggeri sia per la duplicazione del dna stesso; la caratteristica è proprio la produzione in più step delle

componenti strutturali e funzionali del capside. Nel caso dei Poxvirus e degli Iridovirus che sono sempre

costituiti da un dna a doppia catena, vediamo che la caratteristica è quella di possedere una rna polimerasi

associata al virione e la replicazione è citoplasmatica e non nucleare.

Dal genoma abbiamo quindi la trascrizione di questi rna precocissimi e traduzione di queste particolari

proteine che sono in pratica rna e dna polimerasi di origine così virale, e sintesi di rna messaggeri, di rna

messaggeri precoci in seguito, quindi enzimi virali,

replicazione del dna, e infine trascrizione degli rna

messaggeri tardivi che sono proteine che serviranno per

l’assemblaggio e che serviranno per la costituzione della

progenie virale. Naturalmente l’assemblaggio sarà diverso a

seconda dei tipi di virus (adenovirus, herpesvirus, ecc.). Il

genoma una volta assemblato dovrà essere veicolato verso

la membrana, nel caso degli herpesvirus questo si arricchirà

attraverso il golgi di glicoproteine quindi poi ci saranno

ulteriori cambiamenti conformazionali con la maturazione.

La formazione della progenie virale avviene in più step che

sono diversi a seconda delle specie di virus e quindi dei

compartimenti che vengono assemblati a seconda se nel nucleo o nel citolasma vengono interessati dalla

replicazione.

Della classe due fanno parte i virus che presentano dna a singolo filamento. Da quest’ultimo abbiamo la

sintesi di dna a doppio filamento che fungerà da stampo per

la sintesi di rna messaggeri con conseguente sintesi di

proteine strutturali. La dna e l’rna polimerasi utilizzate sono

quelle cellulari e la replicazione è essenzialmente nucleare.

Sarà poi il template negativo a fungere da stampo per la

sintesi del dna stesso.

Il genoma dei virus può essere a rna a doppio filamento, rna

a polarità negativa e a polarità positiva.

La terza classe dei virus, in rapporto alla capacità replicativa,

comprende i virus con rna a doppio filamento. La

caratteristica peculiare è la presenza di questa rna polimerasi

rna virale dipendente che è associata al capside, nel momento in cui il virus infetta la cellula già presenta

quest’enzima che può precocemente innescare il processo di replicazione. Tutti questi virus presentano un

genoma che può essere segmentato, cioè che varia dai 2 ai 12 segmenti di rna, che vanno a costituire

questo microsoma e tutti questi segmenti vengono poi trascritti separatamente in rna messaggeri

monocistronici; spesso vengono tradotti in policistronici e questo rappresenta un escamotage per poter

aumentare la velocità di replicazione dei virus stessi. Poi c’è il clivaggio, il riarrangiamento delle proteine

che permette la separazione. La trascrizione avviene nel citoplasma, proprio perché presentano quest’rna

polimerasi rna dipendente, e la varibilità antigenica di

questi Reoviridae è dovuta proprio alla presenta dell’rna

polimerasi rna dipendente che durante la trascrizione

crea molti esoni.

Queste sono le 4 strategie di replicazione dei virus a rna

a doppio filamento. Per cui da questo rna a doppio

filamento avremo lo stampo per l’rna positivo che funge

da messaggero e in seguito si avrà duplicazione grazie all’rna

polimerasi rna-dipendente. A seconda della polarità, l’rna

virale, e quindi il genoma, puà fungere direttamente da

messaggero oppure da stampo per poi sintetizzare o degli

intermedi o direttamente rna negativi che saranno poi lo

stampo sia per il genoma della progenie virale sia per l’rna

messaggero. Quindi a seconda del tipo di polarità del genoma

potremo avere una diversa strategia, qui riassunta (questo per

gli rna a singolo filamento).

Nella classe 4, appartengono i virus a singolo filamento ma a

polarità positiva. Questo genoma può fungere direttamente da rna messaggero, quindi avremo una

poliproteina, che viene clivata e utilizzata come proteina strutturale, e in essa ci sarà la rna polimerasi. A

questi appartengono gli picornavirus, togavirus, ecc., dove

i togavirus hanno bisogno di più cicli di traduzione per

arrivare alla produzione di dna genomico. Dall’rna + verrà

sintetizzato un rna -, il quale fungerà da template per l’rna

genomico.

E qua è quello che accade nella replicazione di questi

virus a singolo filamento a polarità positiva. Il genoma

funge da rna messaggero e con l’enzima virale

abbiamo la trascrizione dell’rna genomico

producendo rna positivo.

La classe 5, a cui appartengono gli orthomyxovirus, i

paramyxovirus, i rhabdoviruse e i filoviridae, in cui

troviamo sempre la polimerasi associata a capside

rna virale dipendente, abbiamo un rna a polarità –

che non può fungere direttamente da rna messagero ma deve essere duplicato per poter produrre

proteine e per dare un intermedio a polarità positiva

per la sintesi del genoma della progenie virale. In

questo caso, abbiamo la trascrizione dell’rna

negativo in rna messaggero monocitostronico, grazie

a quest’enzima associato al virus.

Quando parliamo degli orthomyxovirus abbiamo tanti

segmenti che devono essere tradotti all’interno del

nucleo (altra caratteristica peculiare: pur essendo a rna

vengono tradotti nel nucleo, grazie alla presenza di

quest’enzima, poiché di solito i virus a rna si replicano nel

citoplasma).

La classe 6 comprende tutti quei virus che presentano un

rna a filamento a singola elica con polarità positiva, ma la

caratteristica è quella di avere un intermedio a dna nel

processo di duplicazione del genoma dovuta a una

dna polimerasi rna dipendente cioè una

retrotrascrittasi inversa presente all’interno del

nucleocapside virale mentre per la sintesi di rna

messaggeri utilizzano una rna polimerasi cellulare a

partire da template di dna trascritto. Proprio il dna

sintetizzato attraverso la trascrittasi inversa migra

all’interno del nucleo e può integrarsi in uno dei

cromosomi cellulari e qui persistere creando la

sintomatologia, eventualmente fenomeni oncogeni.

I retrovirus sono diploidi e l’rna nonostante sia a

polarità positiva non viene utilizzato come rna messaggero ma è solo template della retrotrascrittasi

inversa. Questa è un po’ la cascata di eventi a partire dal genoma di rna, la retrotrascrittasi, intermedio di

dna, duplicazione, migrazione nel nucleo, ecc.

Anche i virus della classe 7, a cui appartengono gli hepadnavirus, presentano genoma di dna a doppio

filamento ma parzialmente bicatenario, la trascrittasi inversa serve per sintetizzare il genoma a partire da

un intermedio di rna positivo che fungerà sia da rna messagero, per la sintesi di alcune proteine, sia da

template. L’rna polimerasi è generalmente cellulare mentre la trascrittasi è di origine virale ed è contenuta

nel capside stesso. Questi sono gli enzimi che vengono attivati una volta che è stato creato l’intermedio di

dna/rna grazie alla trascrittasi inversa perché ci sono delle rnasi attivate dall’ibrido.

Questa è la cascata degli eventi: il dna viene

circolarizzato per tutta la sua sequenza, trascrizione

in rna messaggeri genomici con traduzione e quindi

produzione di proteine del core ma anche della

retrotrascrittasi, gli rna messaggeri possono fungere

da template grazie alla retrotrascrittasi e far avvenire

così l’assemblaggio per la progenie virale.

La capacità replicativa di un virus è legata a tutta una serie di

componenti cellulari quali retrosomi, rna transfert e quei

meccanismi post traduzionali importanti per la maturazione del

virus stesso; ad es., il legame dell’rna messaggero può essere

legato a eventi che sono simil cellulari come la presenza del cap

cellulare, terminale di guanosina metilata, che media l’attacco ai

ribosomi, se non c’è cap non c’è attacco. Molto spesso il virus

invece di utilizzare il cap utilizzano una seq al 5’ che viene

riconosciuta comunque dai ribosomi e permette l’innesco della

sintesi proteica. Ci sono, quindi, due sistemi di riconoscimento mediati dal riconoscimento ribosoma-rna

messaggero che permettono l’attivazione della sintesi proteica: la sequenza IRES e il cap. Ci sono

messaggeri virali che non presentasno nè il poliA nè il cap di innesco.

La maggior parte di rna, retrovirus, dna ecc., trascrivono rna messggeri

separati cioè monocistronici per le varie proteine ma esistono anche virus

che producono rna messaggeri policistronici che hanno poi bisogno di

essere rimaneggiati, in seguito a fenomeni di splicing, per poter avere poi

proteine virali.