Replicazione

SELEZIONE STERICAPREMESSA:

All’interno del nucleo la concentrazione di desossiribonucleotidi trifosfatoè minore rispetto a quella dei ribonucleotidi trifosfato, quindi vi è un’elevataprobabilità che all’interno del sito attivo entri un ribonucleotide trifosfato ma ciò nonpuò essere tollerato.

1. Nel sito attivo sono presenti un gruppo di amminoacidi che rappresentano il sitodiscriminatorio → esso permette il corretto posizionamento solo al desossiribosioil quale in 2’ non ha l’ossigeno, ma solo un atomo di idrogeno.
2. Nel momento in cui il ribonucleotide entra nel sito attivo, portando una base ingrado di complementarizzarsi ma, avendo un ossigeno in più in posizione 2’ perentrare nel sito attivo, deve spostarsi lateralmente.
3. Ciò causa una modifica posizionale anche del fosfato alfa che si disallinea e nonpuò attaccarsi in modo nucleofilo all’ossidrile in 3’.

Conseguentemente non può essere catalizzato il legame fosfoestereo in 3'.5. Dunque, il ribonucleotide così com'è entrato, deve uscire, lasciando il posto a un desossiribonucleotide. Finchè non si forma il legame fosfodiestereo, questi legami sono molto deboli quindi se la base non viene incorporata, si rompono in modo meccanico. REPLICAZIONE NEI PROCARIOTI (E. Coli) La replicazione è BIDIREZIONALE: - Uno dei due filamenti va da 3'-> 5' e viene sintetizzato in modo continuo o secondo la direzione della forca replicativa = FILAMENTO LEADING - L'altro, che va da 5' -> 3', è antiparallelo rispetto al primo, dovrebbe essere sintetizzato in senso inverso ma ciò non è possibile; Per rimediare a ciò il filamento viene sintetizzato in porzioni (frammenti di Okazaki) alternati a molti primer ai quali si aggancia la DNAPOL di volta in volta. Dal momento che vi è un

leggero ritardo nella sintesi, viene denominato FILAMENTO LAGGING (vedi dopo per approfondimento)

Sono necessarie delle sequenze dette origine di replicazione, in E. Coli

• denominate oriC (lunghe 245 bp) all'interno delle quali sono presenti 4 consensi:
• Primo consenso: 4 ripetizioni di nove coppie di basi uguali
• Altri tre consensi: 13 coppie di basi uguali particolarmente ricche in adenina e timina (quindi 2 legami ad idrogeno)!! Nel DNA di E. Coli è particolarmente rappresentata la sequenza GATC (cene sono 14 nell'origine di replicazione)

I procarioti hanno 5 tipi di DNA polimerasi: Polimerasi I, II, III, IV, V- DNA

• Pol I = attività esonucleasica e rimozione dei primer; il suo lavoro è completato dalla DNA-Ligasi
• Pol II = per riparazioni specializzate
• Pol III = replica nell'effettivo la molecola di DNA; è l'enzima processivo più importante per la replicazione del DNA batterico.
• Pol IV e V = o DNA-polimerasi di translesione,

Riparano il DNA in modo diretto o meno, se ci sono dei danni gravi che impediscono alle polimerasi di replicare il DNA permettendo di superare questi ostacoli TRANSITORIAMENTE.

Entrambe le DNAPol I e III sono agganciate ad una proteina τ (tau) a loro volta associate ad un complesso proteico detto complesso γ (o caricatore della pinza).

La processività della DNA-polimerasi è la capacità della stessa di restare il più possibile attaccata allo stampo, quindi consente all'enzima di catalizzare reazioni consecutive senza rilasciare lo stampo molecolare, catalizzando la formazione di migliaia di legami fosfodiesterici.

PROCEDIMENTO

1. Quando E. Coli si trova in un mezzo ricco di nutrimento (e quindi l'ambiente è favorevole alla replicazione) riceve dall'esterno un segnale che permette di produrre la prima proteina del processo replicativo: il dna-A (adenosintrifosfatasi) che viaggia sempre con ATP (che all'attivazione idrolizza in ADP).

Il dna-A riconosce le 4 ripetizioni di 9 coppie di basi e vi si lega. Così facendo modifica la sua conformazione e da inattiva diventa attiva, idrolizzando ATP che diventa ADP e aumentando così notevolmente la sua affinità per il DNA. Presso il sito attivo si forma questo complesso, il REPLISOMA, e laddove il DNA è più debole (a livello delle 3 ripetizioni di 13 coppie di basi) si verifica l'apertura meccanica della doppia elica. Adesso interviene la dna-C che funge da carrier per il dna-B (o ELICASI) che, utilizzando ATP, rompe i legami idrogeno e quindi l'apertura dei filamenti di DNA. Con questa rottura, separando i giri dell'elica, essi non fanno altro che concentrarsi verso la parte non denaturata, questo superavvolgimento comporterebbe o il blocco della denaturazione o addirittura la rottura meccanica del DNA → per evitare ciò interviene la TOPOISOMERASI (I o II). Per proteggere, stabilizzare e

mantenere aperto il DNA a singolo filamento intervengono le SSB (SINGOL STRAND BINDING PROTEINS) che si legano allo scheletro di zucchero-fosfato lasciando libere le basi.

8. Intervengono dunque le PRIMASI che sintetizzano un PRIMER di RNA (di 5-10 basi) necessario per innescare la reazione di replicazione.

9. Lo scorrimento del filamento stampo attraverso la DNAPol è garantito da una proteina che nell'E. Coli è chiamata PINZA DI SCORRIMENTO (o Pinza β), trasportata dal COMPLESSO ψ (gamma) → ogni volta che una primasi sintetizza un primer questa pinza vi si aggancia collegando il filamento al pollice della DNAPol, permettendo la sintesi.

NB – il dna di E. Coli è circolare e le due forche replicative procedono in senso opposto sino a quando, replicato tutto il DNA, si fondono e si staccano in un punto diametralmente opposto all'origine, liberando le molecole di DNA, grazie all'intervento della GIRASI (negli altri organismi topoisomerasi).

II). Per evitare che la replicazione si ripeta, per via della presenza di oriC, sono presenti delle proteine, le Sec-A che mascherano i consensi impedendo qualsiasi legame.

SINTESI FILAMENTO LAGGING

Per sintetizzare il filamento lagging sono necessari molti primer:

1. Prima viene sintetizzato un primer e il filamento viene esteso in senso inverso e copiato.
2. Dunque viene sintetizzato un altro primer e il processo si ripete.
3. Ne consegue che questa molecola è sintetizzata a porzioni (frammenti di Okazaki) intervallati ai primer.
4. Interviene dunque un altro enzima associato alla forca replicativa, una RIBONUCLEASI (ribonucleasi p nei procarioti, mrp negli eucarioti) che degrada i ribonucleotidi che hanno costituito i primer.
5. Rimane dunque un gap fra i due frammenti di Okazaki.
6. La DNAPol I procede dunque a riempire i vuoti lasciati dai primer denaturati con del nuovo DNA.
7. Ma, quando questo nuovo DNA raggiunge il precedente si forma un NICK, il 5’ monofosfato e il 3’OH non hanno

L'energia necessaria per unirsi e saldare il legame è fornita dalla DNA-Ligasi. Nei procarioti, viaggiano associate a molecole di ATP, mentre negli eucarioti con NADH.

La velocità della DNA-polimerasi è minore negli eucarioti, al fine di ridurre il rischio di introdurre errori. Di conseguenza, il DNA degli eucarioti presenta moltissime origini di replicazione, ognuna rappresentata da una forca replicativa che si sposta, detta replicone.

I meccanismi di replicazione sono identici a quelli dei procarioti. I primer sono sintetizzati dalla DNA Pol α, che successivamente muta la propria funzione e assume attività DNA-polimerasica, sintetizzando un tratto iniziatore o iDNA (a lunghezza variabile per organismo, da 3-4 nucleotidi a 200).

L'iDNA è necessario perché le DNAPol δ e ε, che allungano il filamento, necessitano di un

Frammento di DNA, dato che non riconoscono RNA

Dopo aver sintetizzato questa porzione, la DNAPol α si stacca, la δ e la ε si assemblano e sono esse che effettivamente polimerizzano

DNA-POLIMERASI NEGLI EUCARIOTI

Li eucarioti hanno diverse classi di DNA polimerasi, 15, quelle effettivamente coinvolte nella replicazione sono le polimerasi α, δ, ε (+ β e γ).

- DNAPol α = è costituita da due subunità. La prima è una primasi (RNA-polimerasi) e quindi sintetizza i primer di RNA; la seconda è una DNA-polimerasi a bassa processività.

- DNAPol β = riparativa e “gap filling”.

- DNAPol ε (epsilon) = è molto processiva; sintetizza filamento guida; riparazione del DNA; coopera con la α ed è associata alla δ nei meccanismi principali della replicazione.

- DNAPol δ (delta) (simile alla DNAPol III) = non è processiva e ha bisogno della pinza di scorrimento.

(negli eucarioti detta PCNA – Antigene di Proliferazione Cellulare); sintetizza il filamento discontinuo; enzima principale della replicazione (con la Polimerasi α)- DNAPol γ = determina la replicazione del DNA nei mitocondri

REPLICAZIONE NELLA CELLULA DI LIEVITO

Premessa:

L’origine di replicazione del lievito è indicata come ARS (Sequenza di Replicazione Autonoma), costituita da 11 coppie di basi in un tratto di DNA in cui sono presenti 4 consensi:

Il primo consenso detto A è ricco di adenine e timineo B1, ricco di adenine e timineo B2o B3o

Il ciclo cellulare è regolato da speciali proteine dette CICLINE

La CICLINA E, sintetizzata in G1, permette la transizione dalla fase G1o alla S

Le SSB negli eucarioti sono le RPA

Il complesso ψ è il RFC

La pinza β è il PCNA (con caratteristica forma ad anello)

CLAUDIA PORTO ©

PROCEDIMENTO

1. Durante la fase G1 le sequenze ARS vengono pre-assemblate a livello dei consensi

A e B1 in un complesso di 6 proteine detto ORC (Complesso cheRiconosce l'Origine)2. Nel momento in cui ORC si lega a A e B1, esso modifica la propriaconformazione ed espone dei gruppi chimici in prossimità dei consensi di B23. Questi gruppi e i consensi sono riconosciuti da Cdc6 e Cdt1 (caricatori delleelicasi) che vi si legano4. Quindi Cdc6 e Cdt1 cambiano la propria conformazione e richiamano, a livellodell'ARS, l'ELICASI (che nel lievito è detta Mcm2-Mcm7)5. L'elicasi si lega su entrambi i filamenti di dna e nel totale si forma ilCOMPLESSO PRE-REPLICATIVO (o pre-RC), che però è inattivo6. Esso crea una certa tensione sulla doppia elica, e soprattutto a livello deiconsensi A e B1 (ricchi di adenine e timine), che comincia ad aprirsimeccanicamente7.