Replicazione

Replicazione del DNA

Funzione primaria

La prima funzione del DNA consiste nel duplicare sé stesso, cedendo due sue copie dalla cellula madre alla figlia. Si genererà una doppia molecola di DNA in cui si avrà un filamento di vecchia sintesi e uno di nuova, per questo la replicazione è un fenomeno semiconservativo. Si tratta di una polimerizzazione su uno stampo grazie al quale si assemblano uno dietro l'altro i dNTPs (desossiribonucleotidi trifosfato) formando il nuovo filamento.

È termodinamicamente sfavorito, ma l'idrolisi del pirofosfato (grazie a una pirofosfatasi) dopo l'attacco nucleofilo genera 2 fosfati + energia. La DNA Polimerasi degli esseri viventi non è in grado di introdurre autonomamente il primo nucleotide quando inizia il processo di replicazione. Questa capacità è posseduta dalla RNA-polimerasi (o primasi) che sintetizza il primer (che quindi è una sequenza di RNA).

Ha un punto di inizio, l'origine della replicazione, che nei procarioti è unica mentre negli eucarioti sono multiple. Si ha attivazione dell'origine quando si verifica la denaturazione dei due filamenti ad opera delle proteine iniziatrici.

Funzionamento

Il DNA per potersi replicare si deve denaturare, a tale scopo esistono enzimi in grado di rompere il legame idrogeno in qualsiasi molecola di DNA utilizzando energia fornita dalle molecole di ATP. Quindi i due filamenti si separano e possono fungere da stampo, creando la forca replicativa. Gli enzimi a cui è affidata la replicazione sono le DNA Polimerasi che copiano un nuovo filamento su quello preesistente grazie alla caratteristica della complementarietà delle basi.

Dunque, condizione essenziale affinché possa avvenire l'incorporazione di un nuovo nucleotide, è che questo formi i corretti legami ad idrogeno con la base presente sullo stampo. Se i legami ad idrogeno sono corretti, il fosfato in alfa sarà allineato con l'ossidrile che si ionizza ed esercita un attacco nucleofilo sul fosfato, formando il legame fosfoestereo. Si libera dunque un primo fosfato che grazie a una pirofosfatasi viene degradato in due molecole di fosfato inorganico, rendendo irreversibile la reazione di polimerizzazione. Se la base è stata ben incorporata e si è formato il legame fosfodiestereo, viene esibito un OH in 3’ e sarà pronta per innescare la successiva reazione con il nucleotide entrante.

DNA polimerasi

Strutturalmente somiglia a una mano destra parzialmente chiusa, vi possiamo dunque riconoscere 3 domini:

• Palmo: formato un foglietto beta. Sono presenti:
  • Il sito di polimerizzazione, che catalizza l’ingresso dei deossiribonucleotide trifosfato e quindi che determina la replicazione del DNA
  • Due cationi metallici (quindi due cariche positive): 1 zinco (Zn) e 1 magnesio (Mg) o entrambi magnesio.
    • Uno ionizza 3’OH e ciò rende possibile l’innesco nucleofilo; l’altro mantiene la posizione corretta del deossiribonucleotide
• Pollice:
  • Formata da α-elicine. Non partecipa alla reazione di polimerizzazione ma serve per agganciare la DNA-polimerasi allo stampo
  • Vi è associata una esonucleasi per la correzione di errori
• Dita:
  • Formate da α-elicine. Grazie al loro movimento facilitano la catalisi

Selezione sterica

Premessa: All’interno del nucleo la concentrazione di desossiribonucleotidi trifosfato è minore rispetto a quella dei ribonucleotidi trifosfato, quindi vi è un’elevata probabilità che all’interno del sito attivo entri un ribonucleotide trifosfato ma ciò non può essere tollerato.

• Nel sito attivo sono presenti un gruppo di amminoacidi che rappresentano il sito discriminatorio → esso permette il corretto posizionamento solo al desossiribosio il quale in 2’ non ha l’ossigeno, ma solo un atomo di idrogeno.
• Nel momento in cui il ribonucleotide entra nel sito attivo, portando una base in grado di complementarizzarsi, ma avendo un ossigeno in più in posizione 2’ per entrare nel sito attivo, deve spostarsi lateralmente.
• Ciò causa una modifica posizionale anche del fosfato alfa che si disallinea e non può attaccarsi in modo nucleofilo all’ossidrile in 3’.
• Conseguentemente non può essere catalizzato il legame fosfoestereo in 3’.
• Dunque, il ribonucleotide così com’è entrato, deve uscire, lasciando il posto a un desossiribonucleotide.

!! Finché non si forma il legame fosfodiestereo, questi legami sono molto deboli quindi se la base non viene incorporata, si rompono in modo meccanico.

Replicazione nei procarioti (E. Coli)

La replicazione è bidirezionale: Uno dei due filamenti va da 3’→ 5’ e viene...