replicazione procarioti ed eucarioti

UNA SOLA VOLTA PER CICLO CELLULARE,

poiché non possiamo andare

incontro a fenomeno di poliploidia che produrrebbe gravi danni alle cellule figlie.

Sapendo ciò allora si è capito che

devono esistere dei particolari meccanismi che regolano e controllano che

questa attivazione avvenga una e una sola volta per ciclo

cellulare.

Nei procarioti, in particolare in E.coli, uno di questi

meccanismi di controllo della replicazione sfrutta i

cambiamenti dello stato di metilazione del dna a livello

delle origini, prima e dopo la replicazione. In particolare

sappiamo che esistono degli enzimi chiamati DAM-

metilasi(metil-trasferasi Dam) che aggiungono un gruppo

metile o alle citosine(metil-citosine) o alle adenine (metil-

adenine), solo dopo però che esse sono state inglobate

nel nuovo filamento complementare, infatti la metilazione

non avviene prima su un nucleotide che deve essere

ancora inglobato nella catena nascente, ma avviene solo

nel momento in cui questa base viene inserita all’interno

del filamento complementare. In altri termini non esiste

una metil-citosina o un metil-adenina che viene inglobata

come tale, ma esiste solo una citosina o un adenina che

una volta inglobate vengono metilate dalla Dam metilasi.

In particolare nei procarioti (E.coli) troviamo sempre la

sequenza palindromica GATC/CTAG, in cui le adenine

possono essere o non essere metilate.

In E.coli è stato dimostrato che solo le origini completamente metilate possono dare

inizio alla replicazione, mentre le origini figlie (ovvero delle molecole figlie) essendo

emimetilate, non possono essere riutilizzate, o meglio non possono andare incontro

ad un nuovo evento di replicazione, fino a quando non verrà ristabilita la condizione

completa di metilazione. Quindi diciamo che solo il dna completamente metilato,

ovvero quello che presenta le sequenze GATC/CTAG (con le adenite metilate) può

andare incontro a replicazione, mentre il dna emimetilato non può andare subito

incontro a replicazione, ma deve aspettare che le adenine di queste sequenze

vengano metilate sul filamento di nuova sintesi grazie all’azione delle dam-metilasi,

questo perchè la replicazione del dna metilato (a livello delle sequenze GATC)

genera dna emi-metilato, che si mantiene in questa condizione finche la Dam

metilasi non ristabilisce la condizione di completa metilazione.

Quindi in definitiva possiamo dire che il segnale che fa si che il dna possa iniziare la

replicazione è la completa metilazione delle sequenze GATC/CTAG a livello

dell’origine di replicazione,

se invece queste sequenze risultano emimetilate, allora il dna non può andare

subito incontro a replicazione.

Nel genoma di E.coli esistono numerose sequenze GATC che sono normalmente

metilate, tuttavia in seguito all’inizion della replicazione le sequenze GATC presenti

a livello della bolla di replicazione divengono emi-metilate e in questa situazione

vengono legate da una proteina detta SeqA, che è solamente capace di legare

sequenze emimetilate e non completamente metilate.

In particolare SeqA funziona da inibitore della replicazione, poichè il legame della

proteina SeqA con queste sequenze, previene la metilazione del dna da parte della

Dam metilasi e del legame della proteina d’inizio della replicazione DnaA.

Quindi il legame di SeqA porta a due conseguenze:

(1) da un lato impedisce l’azione della Dam-metilasi, quindi riduce drasticamente

la velocità di metilazione delle sequenze GATC,

(2) mentre dall’altro lato previene l’associazione di DnaA su oriC e quindi l’inizio

di un nuovo ciclo replicativo.

Alla fine soltanto in seguito al distacco di SeqA (che avviene attraverso un

meccanismo di regolazione ad orologio), alla totale metilazione delle sequenze

GATC ad opera della Dam.metilasi e grazie alla presenza di Atp, la proteina DnaA

potrà legarsi ai siti di legame presenti su OriC e potrà cosi dare inizio ad un nuovo

ciclo replicativo.

Inoltre esiste un altro meccanismo che riduce drasticamente la possibilità di un

immediato reinizio della replicazione,ed è il fatto che oltre ai novimeri presenti nelle

sequenze dell’origine, esistono numerose altre copie di novimeri al contorno di tale

origine, ovvero sparse per il genoma che quando vengono replicati,ovvero nel

minuto in cui avviene la replicazione (partita dall’origine), raddoppiano di numero

(se erano 10, dopo la replicazione diventano 20) e sottraendo quindi proteine DnaA

al legame con le seuqnze dei novimeri dell’origine; quindi queste ripetizioni sparse

di novimeri riducono drasticamente la concentrazione di DnaA persente, in modo

tale che essendo in concentrazione bassa, riducono le possibilità di legame di

queste proteine con i novimeri dell’origine.

Quindi tutti questi fenomeni: (1)l’emi-metilazione, (2) la proteina SeqA, (3) la

presenza/assenza di ATP, (4)le ripetizioni sparse di novimeri, riducono

drasticamente la possibilità di un reinizio immediato della replicazione, ovvero

inibiscono la replicazione, fino a quando chiaramente non cessano le cause di

inibizione. Infatti basta che anche viene meno uno di questi meccasnimi di controllo

che si perderà l’inibizione.

Sebbene questi meccanismi impediscano un rapido reinizio, questi fenomeni di

inibizione non durano necessariamente fino al completamento della divisione

cellulare; in verità nelle cellule di E.coli , quando sono nella fase esponenziale di

crescita, le origini di replicazione che si trovano sulle molecole figlie possono

iniziare a replicarsi prima del completamento del ciclo di divisione cellulare.

Questo vuol dire che i cromosomi che vengono segregati nelle cellule figlie sono in

attiva fase di replicazione.

Questo può avvenire perché, noi sappiamo che il ciclo vitale di un batterio a

seconda delle condizioni nutritive in cui lo facciamo crescere, può variare

temporalmente. In particolare noi sappiamo che il ciclo cellulare di un batterio dura

circa 1ora (40 di replicazione + 20 di accrescimento), però se noi supportiamo il

mezzo di coltura di questo batterio, con dei composti già pre-esistenti (gli forniamo

tutto noi, ovvero gli aminoacidi), questo ciclo può sensibilmente ridursi in termini

temporali.Tuttavia questo non significa che noi siamo in grado di far avvenire il

processo di replicazione in maniera più veloce, perché questo rimane sempre lo

stesso, poiché dipende dalla processività della Dna pol III, ma noi siamo solo in

grado di variare solamente il periodo di sovrapposizione tra la duplicazione e il

tempo di accrescimento; ad esempio se noi arriviamo a 55minuti, avremo sempre

40+20, però è come se 5 minuti dei 20 di accrescimento si sovrapponessero ai 40 di

replicazione, per cui questo sta a significare che durante durante l’accrescimento

avviene pure la duplicazione. Quindi questo significa che noi possiamo sovrapporre

alla fase di duplicazione quella di accrescimento, in modo che da arrivare a quel

tempo minimo di 40 minuti,che è il tempo minimo e indispensabile (fornendo tutti gli

aa) per fare duplicazione e accrescimento contemporaneo. Quindi operando questa

parziale sovrapposizione, succede che all’interno del batterio le orgini di

replicazione che si trovano sulle molecole di dna figlie, possono iniziare a replicare

prima del completamento del ciclo di replicazione che risulta ancora in corso sulla

molecola parentale.

Tuttavia anche in queste condizioni di rapida crescita, l’inizio non avviene più di una

volta per ogni divisione cellulare, per cui per ogni divisione cellulare esiste soltanto

un ciclo di replicazione iniziata da oriC.

Tutto questo ovviamente è in contrasto con quanto accade negli eucariorti, dove

non c’è segregazione cromosomica se la fase di sintesi del dna non è completata.

Tuttavia nei batteri esiste un meccanismo correlato con le origini di replicazione che

serve a ridistribuire i cromosomi nelle cellule figlie. Questo meccanismo avviene

una successione di eventi che possono essere riassunti in 3 step; in particolare nel

1°step una cellula batterica che si trova nella fase iniziale della

duplicazione, presenta il cromosoma parzialmente replicato, attaccato alla faccia

interna della membrana plasmatica, attraverso le origini delle due molecole di dna

figlie, in particolare attraverso quella proteina SeqA, in particolare vediamo che le

origini di replicazione dei cromosomi replicati hanno siti di attacco alla membrana

indipendenti l’uno dall’altro, per cui seguono indipendentemente la crescita della

membrana. Successivamente nel 2° step vediamo che le due molecole figlie si sono

ormai completamente separate e seguono l’accrescimento della parete batterica.

Alla fine nel 3°step si formerà un setto divisorio che dividerà fisicamente la cellula

in due cellule figlie, e di conseguenza ciascuno delle cellule figlie avrà un

cromosoma attaccato alla membrana plasmatica.

Quindi in definitiva possiamo dire che le origini di replicazione non soltanto

servono a definire quante duplicazioni devono avvenire per ciclo cellulare, ma

servono anche a far si che i cromosomi vengano separati nelle cellule figlie.

ORIGINE DELLA REPLICAZIONE E MODELLO D’INIZIO IN LIEVITO:

Il lievito (S.cerevisiae) nonostante sia un organismo unicellulare è un eucariota e di

conseguenza presenta tutte quelle caratteristiche di questi organismi; in particolare

il lievito come tutti gli eucarioti, non presenta una sola origine di repli, ma ne

presenta molte copie (lievito= 400 a 500; eucarioti superiori = 20,000 a 50,000),

questo perché per prima cosa aumentano le dimensioni del genoma e per seconda

cosa si deve tenere conto della processività della polimerasi, perché se noi

pensassimo di avere negli eucarioti una sola origine di replicazione e una sola

polimerasi, per replicare l’intero genoma ci vorrebbero giorni, mesi o addirittura

anni, ecco allora perché gli eucarioti come il lievito e soprattutto gli eucarioti

superiori presentano un numero elevatissimo di origini di replicazione che non

vengono attivate la maggior parte tutte contemporaneamente; In realtà non vengono

attivate tutte contestualmente, ma magari alcune solo 100 o 200 verranno utilizzate

contestualmente per fare replicazione.

In particolare l’origine di replicazione di lievito S.cerevisiae è chiamata ARS

(Autonomously Replicating Sequence), ed esiste in più copie (circa 400-500 origini)

lungo tutti i 17 cromosomi.

Presenta una lunghezza di circa 100bp al cui interno ritroviamo siti di legame

all’iniziatore e siti facilmente denaturabili, in particolare queste sequenze sono:

sequenze B1 e A a cui si va a legare permanentemente il complesso proteico ORC

(da notare che qui il complesso proteico d’inizio è gi&agra