Replicazione, trascrizione, traduzione

Telomeri e loro funzione

I telomeri servono per impedire che le estremità di cromosomi diversi si uniscano tra loro e per facilitare la replicazione del DNA evitando che venga perduto del materiale. La sequenza nucleotidica che si ripete in tandem nei telomeri è la stessa negli individui della stessa specie e differisce per specie differenti (nell’uomo TTAGGG). Il numero di ripetizioni della sequenza varia da specie a specie, ma anche all'interno della stessa specie può variare da cromosoma a cromosoma e da cellula a cellula. Nei cromosomi umani la sequenza TTAGGG è ripetuta da 500 a 3000 volte. Alle estremità dei telomeri il DNA è a singolo filamento e questa regione viene chiamata 3’ protundente.

Si è visto che il DNA telomerico forma delle strutture dette anse T, in cui la regione 3’ protundente si piega all’indietro andando ad invadere le sequenze telomeriche a doppio filamento e appaiandosi con la regione complementare. Vi sono poi una serie di proteine come la proteina POT-1 che protegge il filamento che è stato allontanato e poi altri complessi proteici come TRF-1 e TRF-2 che si associano alle anse T, stabilizzando l’intera struttura.

La replicazione del DNA

Importanza della replicazione precisa

Sappiamo che l’informazione genetica contenuta nel DNA deve essere copiata fedelmente ogni volta che una cellula si divide. Ma come si replica il DNA nelle cellule? Innanzitutto, prima di vedere come avviene la replicazione, cominciamo con il dire che il processo deve essere assolutamente preciso così che si ottengano due doppie eliche di DNA identiche tra loro e alla doppia elica parentale. Inoltre, il processo deve essere anche estremamente rapido considerato l’elevato numero di nucleotidi che formano il genoma dei diversi organismi. Ad esempio, in Escherichia coli si è stimato che la replicazione avvenga con una velocità di circa 1000 nucleotidi al secondo.

Modello semiconservativo di replicazione

La struttura della doppia elica del DNA ha immediatamente suggerito un meccanismo di replicazione del DNA in cui ciascuno dei due filamenti parentali potesse servire da stampo per la sintesi di un nuovo filamento complementare. Questo tipo di modello di replicazione è detto semiconservativo per il fatto che ciascuna delle due doppie eliche di nuova sintesi conserva uno solo dei due filamenti parentali. All’epoca di Watson e Crick erano stati proposti anche altri modelli di replicazione ovvero quello conservativo e dispersivo.

Per quanto riguarda quello conservativo, tale modello prevedeva che i due filamenti parentali, dopo aver funzionato da stampo, si riassociassero tra di loro per cui al termine della replicazione una doppia elica era formata da entrambe i filamenti parentali mentre l’altra tutta da materiale nuovo.

Esperimento di Meselson e Stahl

La prova sperimentale che dimostrò la validità del modello semiconservativo si è avuta con l’esperimento di Meselson e Stahl. Questi due ricercatori hanno pensato di distinguere il DNA parentale da quello neosintetizzato utilizzando due isotopi dell’azoto (l’azoto 14 che è la forma più comune e l’azoto 15 che è la forma più rara e pesante in quanto contiene un neutrone in più). Si è poi utilizzata la tecnica della centrifugazione in gradiente di densità su Cloruro di Cesio con la quale è possibile separare il materiale di interesse (DNA) in base alla propria densità. Quindi il DNA più pesante si sedimenta nel fondo della provetta mentre quello più leggero rimane più in alto.

Fecero quindi crescere il batterio Escherichia coli, per numerose generazioni, in un terreno di coltura contenente l’azoto 15 come unica fonte di azoto. In questo modo, tutte le cellule del batterio avevano incorporato l’azoto pesante al proprio DNA e se il DNA estratto da un campione di questa coltura batterica veniva poi centrifugato in gradiente, si poteva osservare un’unica barra di DNA pesante. Spostarono poi i batteri in un terreno di coltura con azoto 14 (per una sola generazione), prelevarono poi un campione dei batteri da cui estrarre il DNA e analizzarlo su gradiente (in queste condizioni il nuovo DNA che si forma verrà assemblato con l’azoto 14 e sarà quindi più leggero).

Dopo una generazione di crescita, si osservava una banda di DNA che corrispondeva ad un DNA ibrido formato cioè da un filamento di DNA leggero e uno pesante come atteso in base al modello semiconservativo (costituito quindi da metà della vecchia molecola pesante e metà della nuova molecola leggera, dando così un peso intermedio). Se la replicazione fosse avvenuta invece secondo il modello conservativo, avrebbero trovato due bande in seguito alla crescita in azoto 14, una corrispondente al DNA a doppia elica pesante e una a doppia elica leggera (quindi una banda faceva riferimento al DNA “vecchio” tutto pesante e l’altra banda al DNA “nuovo” tutto leggero). La stessa logica di ragionamento a supporto del modello semiconservativo la si può osservare, in figura, dopo due generazioni di crescita in azoto 14 leggero.

Origine della replicazione

La replicazione del DNA inizia a partire da punti specifici della molecola detti origine di replicazione.

La replicazione nei batteri

Nel genoma circolare dei batteri si ha un singolo punto di inizio di replicazione e in Escherichia Coli questa è detta oriC formata da una sequenza consenso (= sequenza di DNA formata dalle basi che compaiono con maggior frequenza) di 13 coppie di basi ricche in adenina e timina ripetute in tandem e sempre da una sequenza consenso di 9 paia di basi anch’essa ripetuta ma interspersa con altre sequenze. Da notare che le coppie adenina-timina sono unite da un doppio legame H che è più facile da rompere rispetto al triplo legame H di citosina-guanina. Non è quindi un caso che, in corrispondenza del punto di origine della replicazione, la sequenza sia ricca di copie A-T in quanto la replicazione prevede la separazione dei due filamenti di DNA.

La replicazione ha inizio quando una proteina iniziatrice detta Dna-A riconosce la regione formata dalla ripetizione delle 9 coppie di basi e induce la separazione dei due filamenti di DNA che vanno a formare la bolla di replicazione. Si legano poi le DNA elicasi (Dna-B) ovvero altri enzimi che srotolano la doppia elica in entrambe le direzioni dando origine (su entrambi i lati della bolla) a strutture a forma di Y dette forcelle replicative. Si legano poi le DNA primasi che, insieme alle elicasi, vanno a formare il primosoma (DNA primasi + DNA elicasi). Le primasi sintetizzano un corto filamento di RNA (in media lungo da 5 a 10 basi) detto primer. Inoltre, la replicazione è bidirezionale ovvero avviene in entrambe le direzioni a partire dall’origine.

La replicazione nei cromosomi eucariotici

Per quanto riguarda gli eucarioti, la replicazione inizia a partire dai diversi punti di origine che si trovano lungo ciascun cromosoma. Anche in questo caso la replicazione è bidirezionale e le diverse bolle di replicazione che si formano, poi, si fondono tra di loro. Ciascun modulo di replicazione lungo i cromosomi è detto replicone. Un singolo replicone, nei cromosomi dei mammiferi, si estende per circa 30-300 kilobasi (1 kgbase=1000 coppie di basi).

In generale, nel processo di replicazione, gli enzimi chiave sono le DNA polimerasi, le quali catalizzano la formazione del legame fosfodiesterico tra il 3’ OH ad una estremità della catena e il 5’ fosfato del desossiribonucleotide che viene aggiunto. Dal momento che le DNA polimerasi possono aggiungere nucleotidi solo all’estremità 3’ del filamento in fase di sintesi, questo implica che la direzione di crescita del nuovo filamento di DNA sia sempre e solo in direzione 5’-3’.

Quindi le DNA polimerasi hanno bisogno di un’estremità 3’ OH libera detta primer, di un filamento di DNA stampo e dei desossiribonucleotidi trifosfato da incorporare nella catena (questo avviene poi con il rilascio di pirofosfato). Una caratteristica delle DNA polimerasi è l’incapacità di iniziare la sintesi di un nuovo filamento senza avere a disposizione un’estremità 3’ OH a cui legare il primo desossiribonucleotide. Nel processo di sintesi del DNA interviene, quindi, l’enzima DNA primasi che sintetizza un breve filamento di RNA detto primer (o innesco di RNA) complementare al filamento stampo. A questo punto, la DNA polimerasi può legarsi e iniziare a sintetizzare il filamento di DNA.

Dal momento che le DNA polimerasi catalizzano la sintesi del filamento di DNA solo in direzione 5’-3’ e poiché i filamenti di DNA stampo sono antiparalleli, è evidente che la sintesi dei nuovi filamenti deve avvenire in direzioni opposte. Il nuovo filamento sintetizzato nella stessa direzione di movimento della forcella replicativa è detto filamento principale o guida mentre il filamento sintetizzato in direzione opposta è detto filamento lento.

Ovviamente quando i due filamenti si separano, la sintesi del DNA sul filamento guida può continuare indisturbata nella stessa direzione di movimento della forcella di replicazione mentre sul filamento lento è necessario un nuovo inizio di sintesi mano a mano che la forcella replicativa avanza, chiamando in azione le primasi che sintetizzano i primer di RNA necessari alla DNA polimerasi per aggiungere i desossiribonucleotidi. Sul filamento lento, la sintesi avviene in maniera discontinua e vede la formazione di frammenti di DNA preceduti da un primer di RNA detti frammenti di Okazaki.

Nel momento in cui la DNA polimerasi III, sul filamento lento, raggiunge il primer di RNA del frammento di Okazaki sintetizzato in precedenza, si allontana e si lega alla DNA polimerasi I, la quale, mediante la sua attività esonucleasica si lega e (contemporaneamente) rimuove l’RNA sostituendolo con DNA. Parliamo di DNA polimerasi I e III che sono tipiche dei batteri ma negli eucarioti il meccanismo è simile ma catalizzato da altri enzimi. Una volta rimosso il primer di RNA resta un’interruzione che viene saldata dalle DNA ligasi.

La DNA polimerasi possiede anche attività esonucleasica in direzione 3’-5’ quindi opposta a quella di sintesi e questa attività è fondamentale nella rimozione di nucleotidi erroneamente incorporati. Si tratta della cosiddetta attività proofreading (correttore di bozze, la DNA polimerasi arretra di una base sul filamento di DNA stampo) della DNA polimerasi. Poiché la replicazione sia un processo molto accurato con una frequenza di errore molto bassa, ogni volta che viene incorporato nella catena nascente un nucleotide sbagliato (con una base non complementare a quella del filamento stampo), l’attività esonucleasica della stessa DNA polimerasi rimuove il nucleotide dall’estremità 3’ (eliminando quindi l’errore) che verrà sostituito con quello corretto.

Nell’immagine sono indicate alcune attività enzimatiche che vengono svolte durante la replicazione da parte di alcuni enzimi. Abbiamo le DNA elicasi che si muovono lungo la forcella replicativa srotolando la doppia elica di DNA parentale. Poiché lo svolgimento della doppia elica genera dei super avvolgimenti a monte della forcella di replicazione, allora, intervengono gli enzimi topoisomerasi che introducono dei tagli transitori a singolo o a doppio filamento che hanno la funzione di rimuovere questi super avvolgimenti. Infine, quando i due filamenti della doppia elica sono separati, tendono ad appaiarsi per complementarietà delle basi andando a bloccare l’attività della DNA polimerasi. Per evitare tutto ciò, vi sono delle proteine dette SSB che si legano al singolo filamento e lo mantengono in una forma distesa. Nell’immagine vi è un riassunto del processo di replicazione in cui sono mostrati gli enzimi che intervengono nel processo sia negli eucarioti che nei procarioti. Come già detto, il meccanismo di replicazione è identico, cambiano solo gli enzimi che sono coinvolti nei diversi passaggi.

Link da utilizzare per visionare un video sulla replicazione: https://www.youtube.com/watch?v=VpmT7Lw_4v0

Replicazione dei telomeri

Una considerazione particolare merita la replicazione dell’estremità dei cromosomi eucariotici. Abbiamo studiato il meccanismo con cui i primer di RNA vengono rimossi nel filamento lento e i frammenti di Okazaki uniti dalla ligasi. All’estremità 5’ delle molecole di DNA lineari (in corrispondenza dei telomeri), la rimozione dei primer di RNA nei filamenti neo sintetizzati genera delle interruzioni che non possono essere in questo caso riempite dalla DNA polimerasi in quanto non vi è un’estremità 3’ OH a cui l’enzima può attaccarsi. Queste interruzioni portano pertanto, ad ogni ciclo di replicazione, ad un progressivo accorciamento dei telomeri e quindi ad una perdita del materiale ereditario.

L’accorciamento dei telomeri è un processo che avviene normalmente nelle cellule ed è legato alla senescenza. I telomeri sembrano agire come una sorta di orologio biologico legato cioè al numero massimo di replicazioni di DNA a cui una cellula può andare incontro. Sembra che, raggiunto un certo livello di accorciamento dei telomeri, si attivino degli specifici pathway che portano alla morte della cellula in quanto considerata troppo vecchia.

Tuttavia in alcuni tipi cellulari, come quelle staminali e embrionali, l’accorciamento dei telomeri può essere evitato grazie all’azione della telomerasi che sintetizza delle sequenze ripetute di DNA con le quali il telomero viene riallungato. Sfortunatamente le telomerasi si riattivano anche nelle cellule tumorali. Le telomerasi sono dei complessi ribonucleoproteici formati da un enzima cioè la trascrittasi inversa e da una molecola di RNA che ha una sequenza nucleotidica complementare alla sequenza ripetuta dei telomeri. La trascrittasi inversa è quindi un’enzima che sintetizza un filamento di DNA usando come stampo un filamento di RNA. Le telomerasi si legano specificatamente alla sequenza ripetuta (lasciata dalla rimozione del primer di RNA) e aggiungono i nucleotidi al 3’ del filamento di DNA. Il complesso della telomerasi si muove (trasloca) quindi in avanti in modo che la tripletta AAU, al 3’ dell’RNA stampo, si vada ad appaiare con la sequenza TTA neosintetizzata sul DNA parentale e poi catalizza la sintesi della ripetizione telomerica GGGTTA restante. Il processo viene ripetuto più volte, in questo modo, l’estremità 3’ del filamento di DNA viene allungata mediante l’aggiunta di queste ripetizioni telomeriche. Utilizzando poi la normale DNA polimerasi, l’interruzione viene riempita e il nuovo DNA cromosomico viene allungato. Dopo la rimozione del primer resta un’interruzione all’estremità 5’ ma è stato chiaramente evitato un netto accorciamento del cromosoma.

Link da utilizzare per vedere un video sulla replicazione dei telomeri: https://www.youtube.com/watch?v=2NS0jBPurWQ

La trascrizione

La replicazione del DNA, che accompagna sempre la divisione cellulare, consente di trasferire l’informazione genetica da una generazione alla successiva. Mediante i processi di trascrizione e traduzione che andiamo a studiare, le istruzioni contenute nel DNA sono decodificate per la produzione di proteine dalle quali, in definitiva, dipende il fenotipo di una cellula o di un organismo ovvero le sue caratteristiche morfologiche e funzionali. Quindi, mediante i processi di trascrizione e traduzione, l’informazione genetica contenuta nel DNA codificante viene convertita in proteine.

Definiamo la trascrizione come quel processo attraverso il quale le sequenze di DNA sono copiate in sequenze di RNA. Innanzitutto, ad essere trascritte sono solo alcune regioni del genoma ovvero i geni. Questi sono sequenze di DNA che codificano l’informazione necessaria alla sintesi di una proteina o di un RNA. I geni sono trascritti ma non tutti gli RNA vengono poi tradotti in proteina.

Da ricordare che, in un certo momento, non tutti i geni presenti nel genoma di una cellula o organismo vengono trascritti contemporaneamente. Ad esempio, se consideriamo una cellula procariote, in determinate condizioni ambientali nei