Regolazione procarioti. Introduzione e operoni catabolici 1

CO-REPRESSORE

repressore inattivo lo attiva, se si lega ad un attivatore attivo lo inattiva. I co-repressori sono molecole che

impediscono la produzione degli enzimi capaci di sintetizzarle;

*CIRCUITO DI REGOLAZIONE POSITIVO: in cui un gene o un operone represso di default può essere

attivato. E' il caso dell'attivazione della trascrizione a partire da un promotore “non forte”, a livello del quale

l'RNA pol da sola non è in grado di iniziare la trascrizione, perciò è necessaria una proteina regolatrice attiva

che interagisce con il DNA e la Pol per facilitare l'evento di inizio. Questo circuito può essere instaurato per

INDUZIONE. Un se si lega ad un attivatore inattivo lo attiva, se si lega ad un repressore attivo

INDUTTORE

lo inattiva. Gli induttori sono molecole che determinano la produzione degli enzimi capaci di metabolizzarle.

►IL RECLUTAMENTO REGOLATO e L'ALLOSTERIA sono entrambi dei meccanismi di attivazione della

trascrizione basati sul LEGAME COOPERATIVO.

*Nel caso del Reclutamento regolato il legame cooperativo avviene tra proteine capaci di legare siti adiacenti

inducendo aumento di affinità, quindi le interazioni che si instaurano tra queste proteine sono di tipo

. Di solito le proteine che si legano così interagiscono tra di loro con una forza di

“APPICCICOSE/ADESIVE”

legame che aumenta con l'aumentare del numero delle molecole presenti, permettono di stabilizzare

l'interazione con il DNA. In questo modo queste proteine si aiutano a vicenda nel legare un gene che

regolano tutti insieme. (Il legame cooperativo può servire ad integrare dei segnali permettendo ad un gene di

passare rapidamente da spento ad acceso in seguito a piccole variazioni delle condizioni ambientali.)

Un es. è l'attivazione per mezzo del reclutamento dell'RNA pol su un promotore non-forte (chiaramente dopo

che sia stata rilevata la repressione operata da un repressore costitutivamente attivo). L'attivatore interagisce

contemporaneamente, mediante superfici diverse, con il DNA e la pol portando l'enzima sul promotore.

Le interazioni che l'attivatore fa con il DNA e la pol sono solo adesive perché la pol è attiva e l'attivatore

svolge la sola funzione di portarla sul promotore vicino. Una volta posizionata, la pol isomerizza

spontaneamente nel complesso aperto e la trascrizione inizia.

*Nel caso dell' Allosteria il legame cooperativo avviene tra proteine i cui siti di legame sono distanti, quindi

in questo caso il DNA interposto deve essere un DNA curvo/curvabile in grado di formare un ansa. La

curvatura del DNA è intrinseca quando la sequenza del DNA si curva da sola, o indotta quando è dovuta

all'azione di altre proteine come le proteine architetto CAP o Fis. La proteina architetto si lega tra il sito di

legame di un attivatore ed il promotore inducendo una curvatura sul DNA, che organizza una topologia del

promotore utile all'attivazione (o alla repressione), aiutando l'attivatore ad interagire cooperativamente con la

pol. Le interazioni che si instaurano tra queste proteine sono di tipo perché inducono

“ISTRUTTIVE”

modifiche conformazionali. Infatti l'attivatore interagisce con una pol già legata al promotore in un

complesso inattivo e, inducendo un cambiamento conformazionale sull'enzima o sulla sequenza del

promotore, determina l'attivazione della trascrizione (elevati livelli di trascrizione). Un es. è quello di un

RNA pol che si può legare efficacemente al promotore senza bisogno di alcun aiuto formando un complesso

stabile chiuso, ma che non è in grado di isomerizzare spontaneamente nel complesso aperto. Per farlo

necessita di una modifica conformazionale che viene indotta in essa dall'interazione con l'attivatore.

Es. di attivatori trascrizionali che funzionano per allosteria sono Ntrc e MerR. Per l'Allosteria l'attività delle

proteine regolatrici (attivatori/repressori) è controllata da molecole segnale il cui legame alla proteina ne

induce una modifica conformazionale: in una conformazione è capace di legare il DNA, mentre nell'altra no.

→ In assenza sia di attivatori che di repressori, occasionalmente l'RNA pol si lega spontaneamente e

debolmente al promotore ed inizia un basso livello di trascrizione (livello basale).

→ Se l'attivatore e il repressore sono entrambi presenti e funzionali, in genere l'azione del repressore

sovrasta quella dell'attivatore (Es. Lac).

→ I batteri possono crescere in un mezzo minimo o in un mezzo arricchito. Nel mezzo minimo devono

costruirsi tutte le sostanze di cui hanno bisogno, come gli aa necessari per la formazione delle proteine che

vengono sintetizzati mediante gli operoni biosintetici (anabolici). L'arricchimento del mezzo minimo con

l'aggiunta di aa evita ai batteri di sintetizzarli. I batteri invece per ottenere l'energia di cui hanno bisogno

utilizzano gli zuccheri mediante gli operoni catabolici che funzionano in modo opposto agli operoni

biosintetici. L'adattamento dei batteri ai diversi mezzi (minimo/arricchito) e alla presenza di diversi zuccheri

(glucosio, lattosio, arabinosio) è un meccanismo regolato. Fluttuazioni nel rifornimento di sostanze nutrienti

possono verificarsi in ogni momento e la sopravvivenza dei batteri dipende dalla capacità di passare dal

metabolismo di un substrato a quello di un altro. L' è un meccanismo che consente rapidi

INDUCIBILITA'

adattamenti del batterio alle varie disponibilità energetiche. Un batterio evita di sintetizzare gli enzimi di una

via in assenza del substrato, ma è pronto a produrli non appena questo compare. La è un

REPRESSIONE

fenomeno che permette al batterio di evitare di sprecare risorse in attività sintetiche non necessarie.

► GLI OPERONI

*Operone del Glucosio è un operone sempre attivo, perché essendo il glucosio la fonte energetica

preferenziale è sempre presente, per cui il batterio evita di sprecare energia per attivare sempre l'operone.

*Operone Lac, Gal e Ara sono perché permettono il metabolismo di Lattosio,

OPERONI CATABOLICI

Galattosio e Arabinosio quando è assente il glucosio. Sono operoni repressi nello stato di default e possono

essere attivati mediante un meccanismo di induzione del repressore.

*Operone trp è un perché permette la sintesi di triptofano. E' attivo nello stato di

OPERONE BIOSINTETICO

default e viene inattivato dallo stesso triptofano, quando è presente, che funge da corepressore.

►● OPERONE LAC

Operone represso nello stato di default che viene attivato mediante l'induzione del repressore. Comprende

elementi regolativi cis-agenti e geni strutturali che codificano per enzimi coinvolti nel catabolismo del

lattosio. E' costituito da 3 geni lac adiacenti uno all'altro nel genoma di E.coli: lacZ, lacY e lacA.

Il promotore lac è posizionato all'estremità 5' di lacZ e ad esso si sovrappone un sito operatore a cui si lega il

repressone. Questo promotore dirige la trascrizione di tutti e 3 i geni lac in un unico mRNA policistronico

che viene tradotto in una poliproteina che in seguito a maturazione produce 3 prodotti proteici.

-lacZ codifica per l'enzima β-galattosidasi che scinde il lattosio in galattosio e glucosio.

-lacY codifica per la Permeasi del lattosio che si inserisce nella membr. cell. e trasporta il lattosio nella cellul

-lacA codifica per la Tiogalattoside transacetilasi che libera la cellula dai tiogalattosidi tossici.

Questi geni sono espressi ad un alto livello solo quando il lattosio è disponibile, mentre non è presente il

glucosio. La loro espressione è controllata da un attivatore e da un repressore:

*il repressore Lac è codificato dal gene lacI, posizionato vicino agli altri geni lac (a monte del promotore

Lac), ma è trascritto a partire da un proprio promotore forte a cui non si sovrappone l'operatore. In questo

modo nessun regolatore si può legare e reprimere il gene e il gene risulta sempre espresso;

*l' attivatore Cap è la proteina attivatrice del catabolismo del lattosio, nota anche come proteina reattrice del

cAMP. E' codificata da un gene che si trova non associato ai geni lac.

L'attività di queste proteine regolatrici è controllata allostericamente da un diverso segnale ambientale che

essi poi comunicano ai geni lac: -CAP trasmette la presenza del glucosio e può legare il DNA e attivare i geni

lac solo in assenza del glucosio; -il repressore lac trasmette la presenza del lattosio e può legare il DNA e

reprimere la trascrizione solo in assenza del lattosio.

La presenza del glucosio regola negativamente l'induzione dell'operone lac in 2 modi:

-l'esclusione dell'induttore, cioè il lattosio necessario per reprimere il repressore lac;

-riduzione della concentrazione di cAMP che funge da induttore per CAP.

Il sistema pts (fosfoenolpiruvato: glucosio fosfotrasferasi) è un complesso della membrana batterica deputato

al trasporto e alla fosforilazione del glucosio. Una proteina di questo complesso, la Glicerol chinasi IIA,viene

defosforilata in seguito al trasporto del glucosio e si lega alla Permeasi del lattosio impedendo l'ingresso del

lattosio nella cellula. In assenza di lattosio, il repressore lac è attivo e legato all'operatore. Inoltre la

produzione di adenilato ciclasi non può essere stimolata perché essa viene stimolata dalla Glicerol chinasi

IIA fosforilata. Siccome è l'adenilato ciclasi che stimola la produzione di cAMP (l'induttore per CAP), CAP

non può essere attivato. CAP lega il DNA e attiva i geni lac solo quando i livelli di glucosio sono bassi

perché di conseguenza viene prodotta l'adenilato ciclasi e aumentano i livelli di cAMP. Infatti CAP adotta

una conformazione in grado di legare il DNA solo quando è complessata con cAMP, interagendo con esso e

con il DNA mediante superfici di legame diverse. In assenza di glucosio, l'RNA pol, che è in grado di fare

trascrizione basale è stimolata da CAP ad innalzare i livelli di trascrizione. In assenza di glucosio il lattosio

entra nella cellula e viene convertito in dalla β-galattosidasi (Anche la β-galattosidasi è

ALLOLATTOSIO

codificata da uno dei geni lac. Ciò è possibile perché si ha sempre una trascrizione a livello basale che

comporta una bassa espressione dei geni lac, in quanto l'RNA pol, anche durante lo stato represso, ogni tanto

riesce a legarsi al promotore al posto del repressore lac).

L'allolattosio è l'induttore che legandosi al repressore lac lo reprime, mediante l'induzione di una modifica

conformazionale che gli impedisce di legare il DNA. Quindi i geni lac non sono più repressi.

ESPERIMENTI DI JACOB E MONOD SULLA REGOLAZIONE GENICA

Costruirono delle ce