Regolazione dell'espressione genica

Introduzione

La regolazione genica è quel succedersi di eventi che permettono a un gene di esprimere o reprimere un prodotto finale, in modo regolato, in risposta a degli stimoli interni o esterni. Un'espressione genica selettiva permette alle cellule procariotiche ed eucariotiche di:

• Risparmiare energia, infatti, esprimendo solamente i geni utili in quel momento, si evita il grande dispendio energetico necessario all’espressione dei geni sovrannumerari
• Garantire la sopravvivenza, perché se venissero espressi tutti i geni in un momento il citoplasma verrebbe ostruito da tutte le proteine tradotte

La regolazione dell’espressione genica permette inoltre alle cellule eucariotiche di svolgere ruoli specializzati. Nei procarioti la regolazione dell’espressione genica avviene soprattutto a livello trascrizionale, infatti, nel momento in cui la cellula procariotica si approccia a trascrivere, vengono solamente trascritti geni che sono necessari.

Procarioti

Esistono due tipologie di geni:

• Geni costitutivi (housekeeping): sono costantemente attivi e non regolati, in quanto codificano per proteine che sono sempre necessarie alla cellula. Per questo motivo, il gene è sempre accessibile all’RNA polimerasi. Alcuni esempi di geni housekeeping sono i geni che codificano per la glicolisi
• Geni espressi in modalità regolata: consentono l’adattamento della cellula alle modificazioni dell’ambiente esterno e rientrano solitamente in catene metaboliche. Ad esempio, se un determinato batterio crescesse in un terreno di coltura ricco di glucosio e poi venisse spostato in un altro terreno in cui è presente solo lattosio, questi dovrà adattarsi cambiando il proprio corredo enzimatico, al fine di poter ricavare nutrimento dal lattosio.

La regolazione dei geni espressi in modalità regolata si basa su due meccanismi:

1. Tramite l’utilizzo della subunità sigma della polimerasi adeguata
2. Tramite la conformazione dei geni in operoni regolati

Regolazione trascrizionale mediante l’uso di varianti delle subunità σ

La subunità sigma aiuta l'RNA polimerasi a riconoscere il promotore, e quindi a trascrivere i geni. Questo meccanismo di regolazione avviene su più livelli:

1. Capacità da parte di tutti i tipi di geni di reclutare l’RNA polimerasi sui promotori. Questo oloenzima dell’RNA polimerasi, grazie alla sua subunità σ₇₀, è reclutato nei box -10 e -35, a monte dell’unità trascrizionale. La subunità σ₇₀ è detta costitutiva, perché funziona per la maggior parte dei geni batterici
2. Diverse subunità σ intervengono nell’attivazione di classi geniche differenti

Una fonte di regolazione è proprio il cambiamento della subunità σ₇₀ che, per riconoscere le basi specifiche dei box -35 e -10 e attivare la trascrizione, deve essere prodotta all’interno della cellula. I geni regolati codificano per enzimi, che si organizzano a formare le catene metaboliche. Queste catene si suddividono in:

• Cataboliche: vie indotte dal substrato. Ad esempio, la cellula è posta in un ambiente ricco di lattosio, lo percepisce e di conseguenza induce la sintesi degli enzimi necessari per l‘utilizzo del lattosio
• Anaboliche: sono vie che vengono indotte dal prodotto finale. Ad esempio, la cellula ha il gene per sintetizzare il triptofano e lo sintetizzerà fin quando il triptofano stesso agirà da inibitore per la sua sintesi

Gli enzimi dunque cooperano in delle catene metaboliche che, partendo da un substrato, lo modificano in vari passaggi. In tali catene vige la regola del “tutto o nulla”, per cui gli enzimi saranno tutti utili o tutti inutili e analogamente i geni che codificano per questi enzimi saranno tutti utili, e quindi attivati, o tutti inutili, e quindi inibiti.

Operone

L’operone è un’unità trascrizionale contenente diversi geni, la cui regolazione avviene in modo coordinato (o tutti attivati o tutti inibiti). Per cui codificano per enzimi appartenenti ad una stessa catena metabolica e di conseguenza saranno regolati in un modo strettamente coordinato. Un operone è costituito da:

• Geni strutturali, che codificano per prodotti che hanno un ruolo nella via anabolica o catabolica e vengono regolati in modo coordinato
• Due regioni regolatorie, con funzione di promotore e operatore.

Inoltre, l’attività dell’operone è associata ad un gene regolatore a monte, costituito anch’esso da un promotore e una sequenza codificante. Tale porzione regolatrice interagisce con il promotore in modo positivo o negativo, per cui può favorire o inibire la trascrizione.

Nel DNA dei procarioti è possibile distinguere diverse sequenze:

• Trans-agenti, i cui prodotti vengono codificati in un locus ed agiscono o in un altro locus o in altri distretti cellulari, come il tRNA o l’rRNA
• Cis-agenti, siti di DNA, che agiscono dove sono state prodotte, che non vengono convertite in nulla, e la cui funzione è di essere riconosciute e stimolare l’attivazione o la repressione. Un esempio di tali sequenze è offerto dal promotore e dall’operatore nell’operone.

Inoltre, sono definite sequenze cis agenti quelle porzioni di DNA, che codificano per molecole di RNA, la cui funzione è quella di permanere a livello del cromosoma così da permettere la sua regolazione.

Il modello di regolazione più semplice prevede:

1. Presenza di un gene regolatore, che produce un mRNA cui corrisponde una proteina regolatrice (molecola trans agente)
2. Riconoscimento di un sito bersaglio, ovvero di una sequenza cis rispetto al gene strutturale nell’operone, da parte della proteina regolatrice
3. Interazione positiva o negativa con lo stesso.

Tendenzialmente una regolazione positiva si attua nei confronti di proteine che non sono sempre espresse nel genoma, mentre una regolazione negativa si ha nei confronti di geni normalmente espressi e che, in determinate condizioni, devono essere repressi. Nei batteri circa la metà dei geni regolati avrà controllo positivo e l’altra metà controllo negativo, mentre negli eucarioti la regolazione positiva è più frequente.

Nel caso di controllo negativo, un repressore proteico inibisce l’espressione, legandosi all’operatore e impedendo così lo scorrimento dell’RNA polimerasi sul gene, bloccando quindi la trascrizione a livello del promotore. Nel caso di controllo positivo possono invece verificarsi due situazioni:

1. Presenza di un repressore costitutivamente legato all’operatore, il cui distacco, garantito da un induttore, permette la trascrizione
2. Presenza di un attivatore, la cui presenza è necessaria per permettere il legame solido della RNA polimerasi al promotore

Operone lac

L’operone lac è un operone inducibile, perché in assenza dell’induttore lattosio esso è inattivo. È costituito da un promotore e da un operatore. I tre geni strutturali codificano per:

• Beta-galattosidasi
• Permeasi
• Transacetilasi

Tutte e tre le proteine servono per metabolizzare il lattosio e la loro espressione dev’essere sincrona. A monte dell’operone il gene regolatore è normalmente attivo e sintetizza un repressore, che lega l’operatore nell’operone lac e ne impedisce la trascrizione. Quando il lattosio viene posto in coltura lo stesso interagisce con il repressore, determinando un cambiamento nella sua struttura e il distacco dall’operatore. Il distacco dello stesso permette alla polimerasi di dare avvio alla trascrizione. Pertanto, il lattosio agisce nei confronti del repressore come un cofattore nei confronti di un enzima allosterico. Il lattosio ha la possibilità di interagire con il repressore anche senza la presenza della permeasi, perché si ha comunque un suo parziale ingresso, seppur minimo. Inoltre, il repressore è in realtà, nello specifico, un monomero che lega l’operatore sotto forma di tetramero.

È bene sottolineare come la risposta della cellula alla presenza dell’induttore avviene con un certo ritardo. Del resto, anche quando un gene non è attivato, qualche RNA polimerasi può comunque riuscire a riconoscere la sequenza e ad avviare la trascrizione. Questa trascrizione è comunque molto bassa e insufficiente per l’utilizzo ottimale del lattosio da parte della cellula. La regolazione della sintesi dei tre enzimi per il metabolismo del lattosio non è tuttavia dovuta solo alla presenza di lattosio. Il glucosio attua, infatti, un controllo positivo sull’operone lac.

Questo meccanismo di controllo è ancora una volta reso possibile dalla presenza di una proteina allosterica e dal suo effettore. La proteina allosterica è la Catabolite Activator Protein (CAP) o anche Proteina recettore del cAMP (CRP), mentre la molecola effettrice è l’AMP ciclico (cAMP). Il glucosio controlla l’espressione di lac, poiché da esso dipende la concentrazione di cAMP. Esso inibisce l’adenilato-ciclasi, l’enzima che converte l’ATP in AMP ciclico. Il complesso CRP-cAMP attua un controllo positivo nei confronti di lac, poiché incrementa notevolmente l’efficienza della polimerasi.

È possibile rispondere a tre possibili situazioni:

1. Presente glucosio, ma non lattosio: La presenza del glucosio inibisce la formazione del cAMP, la bassa concentrazione di cAMP non permette l’attivazione dell’induttore, l’RNA polimerasi non si lega alla sequenza, oppure si lega, ma con bassissima efficienza. L’assenza del lattosio inoltre fa anche sì che il repressore sia legato all’operatore, e questo implica che anche se si legasse la polimerasi, la presenza del repressore ne impedirebbe comunque lo scorrimento. In questo caso la trascrizione dei tre geni strutturali non avviene
2. Presenti lattosio e glucosio: La presenza del glucosio fa sì che il cAMP sia basso, ma la presenza del lattosio fa sì che il repressore sia inattivo. Tuttavia, poiché la cellula utilizza preferibilmente come substrato energetico il glucosio, la bassa concentrazione di AMP ciclico prevale come segnale ed impedisce la formazione del complesso di attivazione. Da ciò consegue un inefficiente livello di trascrizione dei tre geni
3. Presente lattosio, ma non glucosio: La cellula in tale situazione è obbligata ad utilizzare il lattosio per sopravvivere. La presenza del lattosio inibisce il repressore e l’assenza del glucosio incrementa la concentrazione di cAMP, permettendo una trascrizione efficiente da parte della polimerasi.

Operone triptofano (TRP)

L’operone triptofano è un operone reprimibile. È costituito da un tratto di DNA, che comprende cinque geni strutturali contigui: triptofano E, triptofano D, triptofano C, triptofano B e triptofano A, con a monte un promotore e un operatore. Tra il promotore, l'operatore e il primo gene strutturale c'è la sequenza leader. In un'altra regione genomica c'è poi il gene regolatore dell'operone stesso. L’espressione del gene regolatore determina la produzione di un repressore sintetizzato nella sua forma inattiva. Ciò che attiva il repressore è la presenza del triptofano.

Il repressore nella forma attiva è così in grado di legare all'operatore, impedendo di conseguenza lo scorrimento della RNA polimerasi e la sintesi dei cinque enzimi atti alla formazione del triptofano stesso. Il triptofano agisce quindi come co-repressore, poiché legarsi al repressore lo attiva. Questo va ad agire sull’operatore, inibendo la sintesi degli enzimi legati alla produzione del triptofano stesso. Subito a valle dell’operatore c’è una sequenza, chiamata trpL, che produce un peptide leader, ed è una sentinella traduzionale. TrpL contiene quattro regioni (numerate da 1 a 4) di cui solo la prima contiene le codifica per la sequenza leader; le altre sono dette regioni attenuatrici.

Il meccanismo di attenuazione si verifica grazie alla formazione di due possibili strutture a forcine (STEM). La regione 3 lega la regione 4 formando una struttura a forcina, che induce la terminazione della trascrizione, mentre la regione 2 può appaiarsi con la regione 3, così da non permettere la formazione della forcina di terminazione. Se nella cellula il triptofano non è presente o è presente in basse concentrazioni, la traduzione della sequenza leader si arresta in corrispondenza di uno dei due codoni per il triptofano presenti nella regione 1, a causa della bassa concentrazione delle molecole di tRNA che trasportano l’amminoacido. Tale arresto della traduzione permette l’appaiamento delle regioni 2 e 3, che prevengono la formazione della forcina di terminazione derivante dal legame delle regioni 3 e 4. In queste condizioni, può procedere la trascrizione dell’intero operone trp per sintetizzare triptofano. In presenza di triptofano, la traduzione, procedendo oltre i codoni per il triptofano, permette l’appaiamento delle regioni 3 e 4 e la conseguente formazione della forcina di terminazione della trascrizione.

Eucarioti

Negli eucarioti la cellula deve adeguarsi a condizioni tra le più disparate e critiche, quali lo sviluppo e il differenziamento cellulare. Di fatto, gli eucarioti superiori partono da una singola cellula che si deve differenziare in diversi tessuti. Il contenuto dell’informazione rimane lo stesso, a cambiare saranno le modalità con cui tali informazioni vengono impiegate. Una regolazione molto fine si può osservare nel ciclo cellulare, le cui fasi sono estremamente regolate. In più, esiste un’attivazione cellulare attuata da mediatori esterni alla cellula, ma interni all’organismo, quali ormoni e fattori di crescita, per i quali le risposte devono essere reversibili e rapide.

Per parlare della regolazione genica negli eucarioti, risulta necessario introdurre il concetto di modulo e di protocollo. I moduli non sono altro che le informazioni genetiche. Se si analizzano quante informazioni genetiche sono contenute nei vari organismi, si osserva che gli eucarioti superiori hanno un maggior numero di informazioni. Nonostante ciò, il numero di moduli e di informazioni è abbastanza simile e non corrisponde alla reale differenza esistente tra vari organismi, quindi, la diversità deve risiedere nelle capacità di usare tali informazioni. I protocolli, di fatto, corrispondono al modo in cui l’informazione genica viene impiegata e regolata.

Negli eucarioti esistono diversi tipi di geni:

• Geni housekeeping: essere espressi in qualsiasi tipo cellulare, come ad esempio le proteine per la trascrizione, gli istoni o le proteine per la riparazione del DNA
• Geni tessuto-specifici: specifici per un certo stadio di sviluppo embrionale oppure specifici di un particolare tessuto, come i recettori di membrana o le immunoglobuline
• Geni inducibili: vengono trascritti sempre di base, ma in caso di necessità vengono espressi maggiormente, come i fattori di trascrizione, gli enzimi o gli ormoni. Possono essere anche tessuto-specifici o housekeeping.

Nella cellula eucariotica esistono diversi livelli di regolazione dell’espressione genica:

• Regolazione a livello trascrizionale o nucleare, il maggiore livello di controllo
• Regolazione a livello del processamento, infatti il processamento del trascritto non è detto che percorra sempre una stessa via. Tali meccanismi possono anche aumentare l’informatività di un particolare gene che può dare vita a proteine lievemente differenti
• Meccanismi di controllo nel citoplasma

Ne esistono così tanti livelli, perché la trascrizione di alcuni geni può richiedere molto tempo, ed è invece necessario talvolta che alcune classi di proteine vengano prodotte in maniera rapida. Per altre proteine, invece, non esiste una necessità così urgente, ma una regolazione così fine permette di soddisfare i bisogni della cellula anche in tempi molto brevi e di intervenire con le giuste tempistiche.

Si introduce così il concetto di epigenetica, ovvero le modificazioni ereditabili del DNA e delle proteine istoniche, che cambiano il significato del gene, senza modificarne la sequenza nucleotidica.

Metilazione del DNA

È una modificazione epigenetica post replicativa, tra le più impiegate dalla cellula, che consiste nella modificazione di alcuni nucleotidi. Nei mammiferi l’unica base che può essere metilata è la citosina, che diventa 5-metil-citosina. Si parla per lo più delle citosine che sono