Regolazione procarioti 2

Regolazione della trascrizione nei procarioti tramite sigma alternativi

Oltre all'uso di attivatori trascrizionali, la tappa di inizio della trascrizione nei procarioti può essere regolata dall'uso di sigma alternativi. L'espressione dei geni può essere regolata in risposta a determinati stimoli o condizioni fisiologiche da diverse subunità sigma che dirigono l'espressione di specifici set di geni. Oltre al generale sigma 70 (responsabile del metabolismo basale o normale), che riconosce la maggior parte dei promotori di E. coli, esistono sigma utilizzati per funzioni metaboliche specifiche (metabolismi estremi): shock termico, utilizzo di fonti di azoto, la sporulazione, ecc., che agiscono legandosi allo stesso core enzimatico rendendolo competente a riconoscere promotori diversi. Questi sigma alternativi cambiano le condizioni del metabolismo di base.

Sigma 32

Sigma 32 è un fattore inducibile al calore, ovvero, esso rimpiazza sigma 70 da una certa percentuale di RNA pol, portando questi enzimi a trascrivere quei geni il cui prodotto protegge la cellula dagli effetti dello shock termico. Sigma 32 è presente nelle cellule perché è espresso a livello basale e tale proteina è instabile, ma i suoi livelli aumentano dopo lo shock termico per mezzo di due meccanismi:

• Aumento della trascrizione della sequenza genica che codifica per sigma 32
• Stabilizzazione della proteina sigma 32 che in condizioni normali è degradata rapidamente

Questo fattore sigma risponde a stress più generici come la transizione dalla fase di crescita esponenziale a quella stazionaria, la bassa temperatura e l'osmolarità.

Sigma 28

Sigma 28 risponde a stress da calore estremi. In assenza di stress è legato a una proteina di membrana che gli impedisce di interagire con il core enzimatico. Quando si ha lo stress da calore, due proteasi tagliano la porzione intracitoplasmatica della proteina di membrana che trattiene sigma 28 rilasciandolo. A questo punto sigma 28 può andare a interagire con il core enzimatico e svolgere le sue funzioni specifiche sui suoi promotori specifici.

Sigma 54

Sigma 54 permette di utilizzare fonti di azoto alternative quando non ci sono quelle normali, come nitriti e nitrati. Un esempio è il gene glnA che è trascritto dall'oloenzima che contiene sigma 54 che, in assenza dell'attivatore NtrC, lega il promotore formando un complesso chiuso stabile. NtrC è un attivatore trascrizionale che funziona per mezzo dell'allosteria, cioè fa un'interazione di tipo istruttivo con la pol, inducendone un cambio conformazionale che porta la pol ad iniziare la trascrizione. NtrC, come CAP, possiede domini distinti per l'attivazione e per il legame al DNA e lega il DNA solo in presenza di uno specifico segnale, ovvero i bassi livelli di azoto. In queste condizioni viene attivata la chinasi NtrB che fosforila e attiva NtrC. La fosforilazione induce un cambiamento conformazionale in NtrC che espone il suo dominio di legame al DNA. Una volta attivo, NtrC si lega a 4 siti posizionati a circa 150 bp a monte del promotore. Si lega come dimero a ciascun sito e, attraverso interazioni proteina-proteina tra dimeri, si lega a questi 4 siti in modo altamente cooperativo. NtrC interagisce con sigma 54 mediante la formazione di un loop, data la distanza di 150 bp dal promotore dei siti a cui esso si lega. NtrC possiede un'attività ATPasica che fornisce l'energia necessaria per indurre il cambiamento conformazionale nell'RNA pol che stimola la conversione del complesso-chiuso inattivo nel complesso-aperto attivo. L'interazione tra NtrC e l'RNA pol è anche facilitata dalla proteina IHF, la cui funzione è quella di favorire la curvatura del DNA interposto tra il sito di legame di NtrC e il promotore. NtrC è funzionale sia come fattore di inizio, che come fattore di allungamento della trascrizione.

Gene merT

Il gene merT è trascritto, in presenza di mercurio (è l'induttore dell'attivatore), dall'oloenzima contenente sigma 70 per mezzo dell'aiuto dell'attivatore MerR. Il prodotto di questo gene è una proteina che contribuisce alla detossificazione dei metalli pesanti, rendendo quindi le cellule resistenti agli effetti del mercurio. MerR è un attivatore trascrizionale che funziona per allosteria determinando un cambiamento conformazionale del DNA. MerR lega il DNA, in una sequenza localizzata tra la -10 e la -35 del promotore MerT, sulla faccia opposta a quella a cui si lega la pol cosicché la pol può legarsi contemporaneamente al promotore. Gli elementi -35 e -10 di questo promotore distano tra loro 19 bp invece di 15-17 come nelle sequenze consenso riconosciute canonicamente da sigma 70. Ne consegue che non sono ad una distanza ottimale e non sono allineati, infatti si trovano ruotati uno rispetto all'altro esposti su due facce diverse della doppia elica, sono cioè in fase rotazionale diversa. In più il legame di MerR in assenza di mercurio blocca le sequenze in questa conformazione impropria per cui la pol si può legare ma non può iniziare la trascrizione. Quando il mercurio si lega a MerR, ne induce una modifica conformazionale che a sua volta induce una variazione del twist al centro del promotore riportando la sequenza -10 nella corretta posizione, cioè allineata alla sequenza -35, in funzione di un corretto e forte riconoscimento da parte della pol con sigma 70. In questo modo la pol può iniziare efficacemente la trascrizione. Per l'attivatore MerR non vi è una distinzione tra regioni di legame al DNA e regioni per l'attivazione, il legame al DNA è associato al processo di attivazione. MerR non fa interazioni con la RNA pol.

Esempi di utilizzo di cascate di sigma alternativi

Il batteriofago SPO1 infetta il batterio Bacillus subtilis e cresce secondo il ciclo litico a dare progenie fagica. Ciò richiede che il fago esprima i propri geni in modo controllato. La trascrizione dei geni del fago SPO1 dipende da sigma alternativi che agiscono a cascata. Questo fa sì che i geni virali siano espressi esattamente nello stesso ordine in cui sono richiesti. Prima l'oloenzima con sigma 70 riconosce i promotori dei geni precoci (che producono i prodotti immediati che servono per organizzare un metabolismo diverso all'interno del batterio per permettere il passaggio dal metabolismo batterico a quello del batteriofago). La trascrizione porta, tra i prodotti, alla produzione di un altro fattore sigma che sostituisce sigma 70 nell'oloenzima, il quale riconosce i promotori dei geni intermedi (che codificano per le proteine della replicazione del DNA). Ciò determina la produzione di un ulteriore fattore sigma che sostituisce il precedente nell'oloenzima che a questo punto riconosce i promotori dei geni tardivi del fago (che producono le proteine di rivestimento).

Nel batterio B. subtilis, una cascata di sigma alternativi controlla la sporulazione. La sporulazione in realtà mette assieme tre diversi meccanismi di regolazione: il primo meccanismo è il fosforelè, ovvero un interruttore che viene chiuso o attivato da una cascata di segnalamento in cui sono coinvolte delle chinasi; vengono attivati in maniera differenziale due sigma diversi che mettono in moto due cascate consecutive di sigma alternativi (secondo meccanismo) che vengono prodotti inizialmente in forma non funzionale e vengono maturate in maniera crociata mediante una comunicazione tra il compartimento materno e quello della prespora, attraverso un meccanismo detto criss-cross (terzo meccanismo). E. coli non va incontro a sporulazione.

La sporulazione è un processo che implica il differenziamento di una cellula batterica dalla vita vegetativa alla formazione di una spora con contemporanea lisi della cellula madre. Ciò avviene mediante una serie ordinata di eventi in cui il DNA si replica nel batterio vegetativo, si forma il setto, una molecola figlia di DNA trasloca nel polo della cellula che costituisce il compartimento della prespora attraverso un meccanismo di trasporto attivo che implica delle funzioni di chaperon, la spora viene inglobata, si forma il rivestimento della spora, la cellula madre viene lisata e la spora viene rilasciata. Tutto ciò può essere paragonato a un meccanismo di differenziamento. La sporulazione dipende dalle condizioni ambientali che attivano una via di trasduzione a cascata che culmina nella fosforilazione e quindi attivazione di uno specifico attivatore trascrizionale che induce la via della sporulazione. Ciò può essere mimato in laboratorio. Ad esempio, se nella coltura vengono sottratti i nutrienti, il batterio può andare in sporulazione. La mancanza di nutrienti attiva una via di trasduzione del segnale in cui vengono attivate una serie di chinasi (fosforelè) che vanno ad attivare un fattore di trascrizione.

Nel caso del Bacillus, l'attivatore trascrizionale è SpoOA (che è un attivatore come CAP, AraC che aiuta la pol a riconoscere un promotore non canonico), che una volta fosforilato “aiuta” i due sigma già presenti sigma 43 (il principale o generalizzato per Bacillus, che provvede al metabolismo basale) e sigma H (minoritario, che normalmente non viene utilizzato) a trascrivere due diversi operoni che codificano per sigma alternativi che, mentre si forma il setto, sono implicati a loro volta nell'attivazione dei prodotti specifici della cellula madre e della spora. Questo meccanismo è complicato da eventi di maturazione sequenziali dei vari regolatori e da un colloquio, detto criss-cross, che si instaura tra la prespora e il compartimento materno residuo. I sigma alternativi vengono infatti rilasciati come precursori inattivi e vengono maturati mediante proteolisi da proteasi di membrana che si localizzano nel setto, le quali si adoperano a tagliare le porzioni che li modulano negativamente così da permettere l'attivazione a cascata.

I fattori sigma cambiano in entrambi i compartimenti durante la sporulazione. Nel compartimento materno viene sintetizzato il pro-sigma E (precursore inattivo che necessita di maturazione) dall'oloenzima contenente sigma H. Nel compartimento della prespora l'oloenzima contenente sigma 43 sintetizza sigma F che è una proteina matura (non è un precursore), questa però inizialmente è tenuta in forma inattiva da un anti-sigma (SpoIIAB). A questo punto comincia a formarsi il setto. Successivamente una fosfatasi integrale del setto (SpoIIE) si va a localizzare nel polo del setto in cui si forma la spora, concentrandosi nella prespora, e defosforila attivando un anti-anti-sigma (SpoIIAA) che una volta attivato lega l'anti-sigma determinando il rilascio sigma F che adesso non è più inibito e può funzionare legandosi al core enzimatico. A questo punto l'oloenzima con sigma F trascrive i geni precoci della sporulazione, infatti determina a cascata la produzione di sigma G nel compartimento della prespora, e determina anche la produzione di un attivatore (SpoIIR) di una proteasi presente nel setto (SpoIIGA) che matura pro-sigma E nel compartimento materno. Sigma E materno a sua volta è necessario, attraverso l'attivazione di un'altra proteasi del setto (SpoIIIA), per l'attivazione di sigma G nella prespora, così come sigma G della prespora è necessario per attivare sigma K materno. Quest'ultimo viene anche regolato, prima del criss-cross, da eventi di ricombinazione che giustappongono le sequenze codificanti per sigma K, che mette assieme delle sequenze preesistenti in un corretto ORF. In questo modo viene prodotto il precursore sigma K che successivamente viene attivato dal meccanismo del criss-cross. Alla fine, nella cellula madre sigma K si lega alla pol e promuove la trascrizione dei geni tardivi, mentre ciò nella prespora è promosso da sigma G.

Esempio di regolazione genica in passaggi successivi all'inizio della trascrizione

L'attenuazione è un altro meccanismo regolativo dell'espressione genica che interviene dopo il meccanismo primario della repressione. È applicabile a tutti gli operoni biosintetici (come l'operone triptofano), e consiste nell'attenuazione della terminazione della trascrizione (cioè la trascrizione non termina), agendo da meccanismo di conferma della mancanza dell'aminoacido. Mentre determina la prematura terminazione con il rilascio di piccoli trascritti, in risposta a un repentino aumento dell'aminoacido, andando a bloccare le pol evase dal promotore che non avevano subito il controllo negativo da parte del repressore. In questo modo agisce da meccanismo di adattamento alle condizioni ambientali, agendo quando il repressore non può fare più nulla per quelle pol che hanno già superato il sito operatore che non presentava il repressore perché prima l'aminoacido non era presente. Questo meccanismo di regolazione è possibile solo perché nei procarioti trascrizione e traduzione sono accoppiati. Infatti, dipende da un arresto del ribosoma che non permette la formazione di una struttura secondaria di terminazione della trascrizione sull'RNA in assenza dell'aminoacido, ma determina la formazione di strutture secondarie alternative che attenuano la terminazione; mentre in presenza dell'aminoacido il ribosoma non va in stallo e determina la formazione della forcina di terminazione. (La trascrizione produce il trascritto della regione leader; un ribosoma inizia la traduzione, l'RNA pol prima del sito di terminazione fa pausa; il ribosoma a livello dei due codoni specifici di quel determinato operone, cioè che codificano per lo stesso aminoacido che viene sintetizzato da quello specifico operone, va in stallo (in mancanza del tRNA caricato di quello specifico aminoacido) oppure (in presenza) traduce).

Operone triptofano (trp)

È un operone attivo di default, ciò implica che in presenza di alte concentrazioni di triptofano l'espressione dei geni viene inibita e non viene prodotto altro trp; se invece la concentrazione del trp scende al di sotto di un certo livello l'espressione viene indotta. È la concentrazione di trp che controlla la trascrizione di questo operone, perché controlla la posizione del ribosoma, la quale a sua volta determina quale struttura secondaria si forma sull'RNA in modo che la terminazione sia attenuata soltanto in assenza di trp. Ciò rappresenta un meccanismo di rapido adattamento a variazioni nutritive e ambientali. L'operone trp consiste di cinque geni strutturali contigui (trpE, D, C, B, A) preceduti da una regione di controllo che comprende un promotore, un operatore, una sequenza leader e un sito attenuatore che si trova all'interno della sequenza leader ma prima del primo gene strutturale.

A monte del promotore c'è la sequenza del gene regolatore che codifica per il repressore trp. Questo operone (come gli altri operoni biosintetici) adotta un doppio meccanismo di controllo:

• È controllato primariamente e negativamente da una proteina regolatrice, cioè un repressore Trp che è attivo solo in presenza di triptofano che funziona da co-repressore. Infatti, inizialmente il repressore Trp è un aporepressore in forma inattiva che non può legare l'operatore (viene prodotto in questa forma inattiva dal gene regolatore trpR e agisce in trans, cioè diffonde dal sito di origine fino alla sequenza target dell'operatore dell'operone trp). È attivato dal legame con il corepressore trp che ne induce una modifica conformazionale che lo rende capace di legare il sito operatore per impedire la trascrizione dei geni che codificano per gli enzimi della via del trp (lo fa impedendo il legame della pol al promotore).