Regolazione procarioti 2

ESEMPIO DI REGOLAZIONE GENICA IN PASSAGGI SUCCESSIVI ALL'INIZIO DELLA

TRASCRIZIONE.

L'ATTENUAZIONE è un altro meccanismo regolativo dell'espressione genica che interviene dopo il

meccanismo primario della repressione. E' applicabile a tutti gli operoni biosintetici (come l'operone

triptofano), consiste nell'attenuazione della terminazione della trascrizione (cioè la trascrizione non

termina), agendo da meccanismo di conferma della mancanza dell'aa. Mentre determina la

prematura terminazione con il rilascio di piccoli trascritti, in risposta ad un repentino aumento

dell'aa, andando a bloccare le pol evase dal promotore che non avevano subito il controllo negativo

da parte del repressore. In questo modo agisce da meccanismo di adattamento alle condizioni

ambientali, agendo quando il repressore non può fare più nulla per quelle pol che hanno già

superato il sito operatore che non presentava il repressore perché prima l'aa non era presente.

Questo meccanismo di regolazione è possibile solo perché nei procarioti in cui trascrizione e

traduzione sono accoppiati. Infatti dipende da un arresto del ribosoma che non permette la

formazione di una struttura secondaria di terminazione della trascrizione sull'RNA in assenza

dell'aa, ma determina la formazione di strutture secondarie alternative che attenuano la

terminazione; mentre in presenza dell'aa il ribosoma non va in stallo e determina la formazione

della forcina di terminazione. (La trascrizione produce il trascritto della regione leader; un ribosoma

inizia la traduzione, l'RNA pol prima del sito di terminazione fa pausa; il ribosoma a livello dei due

codoni specifici di quel determinato operone, cioè che codificano per lo stesso aa che viene

sintetizzato da quello specifico operone, va in stallo (in mancanza del tRNA caricato di quello

specifico aa) oppure (in presenza) traduce).

OPERONE TRIPTOFANO (trp)

E' un operone attivo di default ciò implica che in presenza di alte concentrazione di triptofano

l'espressione dei geni viene inibita e non viene prodotto altro trp, se invece la concentrazione del trp

scende al di sotto di un certo livello l'espressione viene indotta. E' la concentrazione di trp che

controlla la trascrizione di questo operone, perché controlla la posizione del ribosoma, la quale a

sua volta determina quale struttura secondaria si forma sull'RNA in modo che la terminazione sia

attenuata soltanto in assenza di trp.

Ciò rappresenta un meccanismo di rapido adattamento a variazioni nutritive e ambientali.

L'operone trp consiste di 5 geni strutturali contigui (trpE, D, C, B, A) preceduti da una regione di

controllo che comprende un promotore, un operatore, una sequenza leader e un sito attenuatore che

si trova all'interno della sequenza leader ma prima del primo gene strutturale.

A monte del promotore c'è la sequenza del gene regolatore che codifica per il repressore trp.

Questo operone (come gli altri operoni biosintetici) adotta un doppio meccanismo di controllo:

-E' controllato primariamente e negativamente da una proteina regolatrice, cioè un repressore Trp

che è attivo solo in presenza di triptofano che funziona da co-repressore. Infatti, inizialmente il

repressore Trp è un aporepressore in forma inattiva che non può legare l'operatore (viene prodotto

in questa forma inattiva dal gene regolatore trpR e agisce in trans, cioè diffonde dal sito di origine

fino alla sequenza target dell'operatore dell'operone trp). E' attivato dal legame con il corepressore

trp che ne induce una modifica conformazionale che lo rende capace di legare il sito operatore per

impedire la trascrizione dei geni che codificano per gli enzimi della via del trp (lo fa impedendo il

legame della pol al promotore). Il repressore si lega al sito operatore in forma dimerica a due solchi

maggiori contigui del DNA, mediante il motivo di legame elix-turn-elix. Nella forma inattiva

(aporeressore) ha una conformazione che non gli permette di legare il DNA, perché le eliche di

riconoscimento del repressore sono posizionate in maniera non ottimale rispetto ai due solchi

maggiori. La modifica conformazionale indotta dal legame del trp riposiziona le due eliche di

riconoscimento (che sono quelle che andranno a fare le interazioni all'interno dei due solchi

maggiori) distanziandole 8 A l'una dall'altra, in modo che esse possano legare il DNA dell'operatore

con la massima affinità. Quindi quando non c'è il trp, l'aporepressore, che è prodotto

costitutivamente, è presente ma non funziona. Perciò la trascrizione procede, vengono trascritti tutti

i geni strutturali e viene sintetizzato il triptofano. Quando è presente il trp, esso si lega

all'aporepressore che a questo punto blocca la trascrizione e non c'è sintesi di triptofano.

-L'operone è regolato secondariamente dall'azione di un meccanismo di attenuazione della

terminazione della trascrizione operato dalla sequenza leader dell'mRNA e regolato dalla

concentrazione di trp. Questo è un meccanismo di conferma della presenza del trp. E' un

meccanismo di rapido adattamento alle condizioni ambientali, perché può succedere che non c'è il

triptofano e la trascrizione parte dal promotore superando il sito operatore libero (ovviamente

perché non c'è nessun repressore legato), ma che le condizioni cambiano repentinamente (ad es in

coltura aggiungendo molto trp) portando ad una altissima concentrazione di trp a cui il meccanismo

del repressore non è in grado di rispondere immediatamente. Allora le RNA pol che hanno fatto la

fuga dal promotore possono essere fermate solo dal meccanismo dell'attenuazione. Questo

meccanismo è quello che determina se la trascrizione possa continuare o meno. Ciò avviene

fondamentalmente perché traduzione e trascrizione sono accoppiate. (Questo es di attenuazione

dimostra che la trascrizione di un gene può essere modulata senza l'uso di una proteina regolativa).

Per capire in dettaglio in che modo la presenza o meno del trp può determinare l'attenuazione

bisogna esaminare la struttura della regione leader dell'mRNA.

In questa regione ci sono 4 regioni che possono appaiarsi ciascuna con la successiva, formando

diverse strutture secondarie, dando luogo ad eventi diversi.

La regione 1 può appaiarsi con la 2 (formando una struttura di pausa che precede sempre la

terminazione); la 3 con la 4 (formando una struttura di terminazione) e in alternativa la 2 può

appaiarsi con la 3 (formando una struttura di attenuazione che fa andare in pausa la pol permettendo

un recupero della trascrizione).

La regione leader codifica per un corto peptide leader di 14 aa (dato che questa porzione della

regione leader presenta un codice di lettura aperto, cioè una serie di 14 codoni continui che vengono

tradotti in 14 aa) che termina a livello di un codone di stop UGA che si trova tra le regioni 1 e 2.

(Il peptide leader di per se non ha alcuna funzione e infatti viene degradato dalle proteasi cellulari).

La regione 1 contiene una coppia contigua di codoni trp, i quali sono responsabili dell'arresto o

della traduzione da parte del ribosoma. La traduzione dell'mRNA leader avviene immediatamente a

monte della sua trascrizione grazie al fenomeno della pausa che permette di coordinare i due

processi. L'RNA pol va in pausa prima del sito di terminazione per un tempo sufficientemente lungo

da permettere l'inizio della traduzione, permettendo al ribosoma di tradurre il peptide leader nel

caso in cui c'è il trp (a livello della forcina 1-2); o va in pausa per poi riprendere a trascrivere in

caso di assenza di trp (a livello della forcina 2-3).

*Quando il trp è presente in grande quantità si ha la prematura terminazione della trascrizione da

parte della RNA pol a livello del leader, dovuta alla formazione di una forcina di terminazione tra le

regioni 3 e 4 della sequenza leader che rappresenta un sito di terminazione intrinseco (struttura

secondaria a stem/loop seguita da una serie di residui di Uridina) detto sito attenuatore (posto prima

del primo gene del gruppo dei geni strutturali del gruppo trp). In questo caso il ribosoma che

traduce l'mRNA nascente che fuoriesce dalla pol, prosegue oltre i codoni trp presenti nella regione

1, permettendo la formazione della forcina di pausa 1-2 e di conseguenza di quella di terminazione

3-4. Quindi la maggior parte delle RNA pol che sfuggono al promotore (per il mancato controllo da

parte del repressore) vanno in pausa a livello della forcina 1-2 e terminano la trascrizione a livello

di questo sito attenuatore (forcina 3-4) determinando la trascrizione del solo RNA leader lungo 139

nucleotidi (RNA incompleto, detto attenuato).

*Se c'è carenza di triptofano, il ribosoma che comincia a tradurre l'mRNA nascente si arresta (va in

stallo) in corrispondenza della coppia contigua di codoni trp della regione 1, a causa della mancanza

del tRNA caricato di trp; quindi questa regione rimane sequestrata all'interno del ribosoma e non

può appaiarsi con la regione 2 che forma la forcina di pausa. Intanto la RNA pol va avanti

trascrivendo le regioni 2 e 3. Ciò comporta l'appaiamento delle regioni 2 e 3, che formano una

struttura secondaria alternativa (forcina di attenuazione) che da un segnale di antiterminazione

perché queste regioni si appaiano tra loro subito dopo essere state trascritte dalla pol, prima che

venga trascritta la regione 4, non permettendo l'appaiamento delle regioni 3 e 4, che formano la

struttura di terminazione a livello dell'attenuatore, costringendo la regione 4 una volta trascritta a

rimanere a singolo filamento. In questo caso la pol continua a trascrivere, oltre la sequenza

dell'attenuatore, l'intero operone, producendo un mRNA policistronico codificante per tutti gli

enzimi implicati nella sintesi del trp.

Se non c'è l'aa non c'è il repressore (Ovviamente ci riferiamo ad un valore soglia che non deve

essere superato. Perché una certa quantità di trp è sempre espressa a livello basale, ma non è certo

questa che fa scattare il meccanismo del repressone. Il valore soglia viene superato quando le

molecole di aporepressore superano quelle del repressore), allora parte la trascrizione dal promotore

e viene trascritto l'RNA leader. All'interno del trascritto leader ci sono le sequenze dell'attenuatore.

Se queste vengono riconosciute come sequenze di attenuazione si passa oltre, cioè la pol trascrive

oltre queste sequenze l'intero operone e viene sintetizzato l'mRNA policistronico codificante il trp.

Se non vengono riconosciute come sequenze di attenuazione ma come sito di terminazione la

trascrizione termina all'interno di questo trascritto leader e viene sintetizzato solo il peptide