Biologia molecolare - regolazione genica nei procarioti

Regolazione genica nei procarioti

Operone = è un circuito regolativo unico comprendente geni multipli. Infatti, risulta essere costituito da:

Sequenze cis-agenti

Le sequenze cis-agenti sono quelle sequenze capaci di influenzare i meccanismi di espressione del segmento di DNA a cui sono fisicamente legati. In particolare, le sequenze cis-agenti sono: il promotore e l’operatore, che si trovano a monte rispetto ai geni strutturali, ma anche le sequenze di legame per gli attivatori trascrizionali. In particolare, vediamo che il promotore, situato a monte dei geni, è la sequenza di DNA che, legandosi all'RNA polimerasi, permette l'inizio della trascrizione, perché infatti l'RNA polimerasi ha bisogno di riconoscere la sequenza del promotore per iniziare il processo. Mentre l'operatore, situato subito dopo il promotore, regola l'espressione dei geni strutturali. Infatti, l'operatore svolge questa funzione interagendo con una specifica proteina chiamata "proteina repressore o proteina attivatore" a seconda che, appunto, impedisca o stimoli l'espressione dei geni.

Sequenze codificanti

Le sequenze codificanti corrispondono ai geni strutturali, che sono una serie di geni che devono essere regolati insieme e codificano per enzimi o proteine necessarie alla cellula. Oppure, codificano per prodotti regolatori trans-agenti (diffusibili), che possono anche essere dei regolatori di qualche altro gene. In particolare, visto che l’operone è un circuito regolativo, che presenta sequenze cis-agenti, è ovvio che per funzionare vi devono essere delle proteine regolatrici dette appunto trans-agente. Ed è proprio il fatto che queste proteine sono trans-agenti, ovvero prodotti diffusibili, che non è strettamente necessario che i geni codificanti per queste proteine regolatrici siano fisicamente legati alle sequenze dell’operone.

Tipi di regolazione

In particolare, i circuiti di regolazione dell’espressione genica dei procarioti, sono fondamentalmente di due tipi:

• Circuito negativo: prevede un meccanismo di repressione dell’attività costitutiva del gene, ovvero si parte da una condizione in cui vi è un gene di default ATTIVO, che può essere REPRESSO. In particolare, il circuito negativo può operare questa repressione, sull’operone attivo di default in due modi, ovvero attraverso un:
  • Controllo negativo che utilizza un co-repressore, che si va a legare al repressore inattivo, detto apoproteina, rendendolo attivo e capace di andare a legarsi all’operatore e quindi operare la repressione di questo operone attivo di default.
  • Controllo positivo ovvero rendendo inattivo l’attivatore della trascrizione, attraverso l’uso di un co-repressore che legandosi all’attivatore lo inattiva.
  Tuttavia, nessuno vieta che questi controlli, ovvero sia quello negativo che quello positivo, possano funzionare entrambi a livello degli operoni.
• Circuito positivo: è il meccanismo elettivo dei procarioti, che prevede un meccanismo di ATTIVAZIONE del gene che è REPRESSO, ovvero il gene nella sua condizione di default è represso e quindi deve subire un processo di attivazione, ovvero di induzione. In particolare, il circuito positivo può operare questo meccanismo di induzione in due modi, ovvero attraverso un:
  • Controllo negativo ovvero attraverso l’inattivazione di un repressore, cioè attraverso l’uso di un induttore (inattivatore del repressore), che andandosi a legare al repressore lo inattiva, facendolo staccare, in modo tale che il repressore, divenuto inattivo, non induca più repressione.
  • Controllo positivo ovvero attraverso l’uso di un attivatore, che però deve prima passare nella sua conformazione attiva, grazie al legame con un induttore, che appunto attiva l’attivatore. Quindi in questo caso abbiamo un attivatore inattivo, che attraverso un induttore dell’attivatore (può essere una fosforilazione), passa dalla sua forma inattiva a quella attiva, potendo così andare ad aiutare la polimerasi nella sua funzione.
  Tuttavia, anche in questo caso, nessuno vieta di pensare che questi due meccanismi possano avvenire contestualmente durante la regolazione positiva di un operone.

Meccanismo di attivazione

Il meccanismo di attivazione è fondamentalmente il meccanismo attraverso cui si innesca il reclutamento, il meccanismo di attivazione della trascrizione. Viene chiamato reclutamento regolato, perché è basato sul concetto di legame cooperativo tra proteine, che sono legate su siti adiacenti, o addirittura anche tra proteine i cui siti di legame sono distanti. Infatti, in questo caso si presume che il DNA interposto tra questi due siti debba essere un DNA curvo/curvabile, cioè in grado di formare una ansa in modo tale da favorire il legame di queste due proteine distanti. In particolare, vediamo che questo tipo di meccanismo cooperativo viene sfruttato dagli attivatori trascrizionali, in modo tale da aumentare l’affinità di legame di una RNA pol verso un promotore non forte. Questo aiuta quindi la polimerasi a potersi legare stabilmente ad un promotore non forte, che in caso contrario non verrebbe mai legato, o quantomeno verrebbe solamente legato con bassa affinità, cosa che non permette né la formazione di un complesso chiuso né tantomeno la transizione da complesso chiuso a complesso aperto.

Quindi, tutto questo può avvenire perché, come abbiamo detto, queste proteine attivatrici della trascrizione si possono andare a legare al DNA in siti vicini al promotore (dove si lega l’RNA pol) e quindi facendo interazioni dirette con l’RNA pol, oppure anche in siti lontani, perché tanto in questo caso si presuppone l’esistenza di una sequenza curva/curvabile, tra il sito di legame dell’attivatore e il sito di legame dell’RNA pol (promotore), che permette la formazione di un ansa capace di avvicinare questi due siti, e quindi di permettere il tetering (interazione) tra la proteina attivatrice e l’RNA pol. In particolare, le interazioni tra la proteina attivatrice e l’RNA pol possono essere di due tipi: ovvero:

• Interazioni appiccicose: sono un tipo di interazioni che agiscono solo modificando il grado di affinità dell’RNA pol nei confronti di quei promotori non forti. In particolare, queste interazioni conducono solo al reclutamento dell’RNA pol su un promotore non forte (sequenze non canoniche), che in genere da sola non è in grado di legare. Ovviamente, questo avverrà solo dopo che è stata rilevata la repressione, operata da un repressore costitutivamente espresso, da parte di un induttore (inattivatore del repressore). Quindi, una volta avvenuto ciò, avverrà questo reclutamento regolato, che porterà l’RNA pol a livello del promotore, dove avverrà l’isomerizzazione spontanea da complesso aperto a complesso chiuso che porterà all’attivazione della trascrizione. Ovviamente, questo avviene perché di suo la polimerasi è già istruita a fare trascrizione, perché sa che nel minuto in cui viene captata a livello del promotore, qualunque sia il meccanismo di captamento, lei sarà di suo già organizzata in maniera tale da andare incontro a quelle modifiche conformazionali, ovvero procedere verso il processo di isomerizzazione spontanea.
• Interazioni istruttive: sono un tipo di interazioni che agiscono, non solo modificando il grado di affinità dell’RNA pol nei confronti di quei promotori non forti, ma anche provocando modifiche conformazionali a livello dell’RNA pol che la “istruiscono” a poter fare isomerizzazione da complesso chiuso a complesso aperto e quindi iniziare la trascrizione. Infatti, in questo caso si parla di allosteria. In particolare, queste interazioni conducono all’attivazione allosterica di un RNA pol incapace di isomerizzare spontaneamente, ovvero sono interazioni che istruiscono l’RNA pol, attraverso cambiamenti conformazionali, a poter fare isomerizzazione. Quindi, in questo caso, questi attivatori trascrizionali non reclutano l’RNA pol a livello del promotore, come nel caso delle interazioni appiccicose, perché essa è già legata in questa posizione (per diversi motivi), ma non è capace di andare avanti, cioè di isomerizzare.

Tuttavia, risulta evidente che nel minuto in cui il sito di legame dell’attivatore trascrizionale è posto lontano dal sito di legame dell’RNA pol (promotore), deve intervenire qualcosa che faciliti, o meglio faccia avvenire questa interazione istruttiva. In particolare, se esiste nel mezzo tra questi due siti, un sito di legame per una proteina capace di curvare il DNA, detta proteina architetto (tipo la proteina FIS), ovviamente questo può senza dubbio facilitare le interazioni cooperative, poiché organizza una topologia del promotore utile per attivazione (o anche per la repressione), ovvero provoca una curvatura in grado di formare un ansa che avvicina queste due proteine, che in questo modo possono fare interazione. Ovviamente, questo sito di legame per la proteina architetto deve essere su questa faccia del DNA (vedi fig), in modo tale che questa curvatura, permetta un’interazione ottimale tra le due proteine, perché se invece di trovarsi su questa faccia, si trova sulla faccia opposta, allora in questo caso questa interazione non potrà avvenire, perché la proteina attivatrice non è in grado di legarsi con qualunque parte dell’RNA pol, ma si lega attraverso il proprio motivo di legame con dei target specifici presenti sull’oloenzima, di cui gli unici sono σ e ωCTD, mentre le altre porzioni non sono state identificate come target di attivatori trascrizionali. Quindi, non solo è importante che vi sia questo sito di legame per la proteina architetto, ma è altrettanto importante su quale faccia questi siti si trovino, perché in questo modo faciliteranno o meno l’interazione tra l’attivatore e l’RNA pol. Ovviamente, tutto questo avviene solo in presenza di un promotore non forte, perché se invece fossimo in presenza di un promotore forte (canonico), in questo caso vi sarebbe l’elemento UP, curva curvabile, che faciliterebbe questo avvenimento.

Operone lattosio

È stato il primo operone studiato nella storia ed è presente in E. coli, che è un batterio capace di utilizzare come fonte di carbonio sia il glucosio che il lattosio. Tuttavia, lo zucchero più adatto al suo metabolismo è il glucosio, tanto che se il batterio cresce in un substrato che presenta entrambi gli zuccheri, utilizza unicamente il glucosio. Tuttavia, se il batterio si trova a crescere in un ambiente in cui è presente unicamente il lattosio, immediatamente sintetizza gli enzimi necessari a metabolizzarlo e questo può farlo solo attraverso l’induzione dell’operone lattosio. L’operone si trova in uno stato di default REPRESSO e viene attivato per INDUZIONE.

In particolare, questo viene identificato come un operone catabolico, ovvero un operone che produce enzimi necessari per l’utilizzazione del lattosio, come fonte alternativa al glucosio, per produrre energia necessaria alla vita del batterio. In particolare, questi enzimi vengono codificati da tre geni strutturali adiacenti, ovvero:

• Lac Z  codifica per la β-galattosidasi, che produce i beta-galattosidi.
• Lac Y  codifica per la permeasi, che serve per il trasporto all’interno della cellula dei galattosidi.
• Lac A  codifica per transacetilasi.

In particolare, questi geni sono adiacenti all'interno dell'operone e vengono trascritti in un solo trascritto policistronico, che verrà poi, appunto, tradotto nei tre enzimi. Ovviamente, questa organizzazione in operone non è solo un concetto strutturale, ma anche funzionale, poiché l’espressione di questi geni strutturali viene controllata in maniera coordinata da un unico promotore (P), posto sempre a monte delle sequenze codificanti, in cui si sovrappone parzialmente un sito operatore (lac o), che è il sito di legame per il repressore. Promotore ed operatore sono sequenze IN CIS.

Infatti, la situazione iniziale (assenza di lattosio) data da questo operone represso in partenza, subisce una repressione costitutiva di default. In particolare, questa repressione costitutiva avviene perché, a livello di questo operone è presente, cioè è legato fisicamente (in cis) il gene regolatore LAC I, ovvero il gene che codifica per il REPRESSORE LAC I che andandosi a legare al sito operatore (dei geni strutturali) blocca la trascrizione di questo operone. In particolare, questo gene regolatore LAC I, non viene regolato dal promotore canonico Plac dei geni strutturali, ma viene regolato dal suo promotore, che è un promotore forte, ma cosa più importante, è che non presenta un suo sito operatore. Per cui, non essendoci un sito operatore dove si potrebbe andare a legare un repressore (induttore negativo) di questa proteina (repressore) lac I, ovviamente questa sarà sempre espressa, ovvero verrà prodotta sempre in maniera costitutiva, per cui andrà sempre a legare l’operatore Lac O (dei geni strutturali), per cui verrà repressa sempre costitutivamente l’espressione di questi geni strutturali.

Quindi l’operone LAC, è un operone represso in partenza che quindi deve essere attivato, inducendo il repressore lac I a staccarsi, attraverso l’utilizzo di un induttore del repressore, che vedremo essere i betagalattosidi, che legandosi al repressore, lo modificano e lo inducono a staccarsi, ma anche attraverso l’utilizzo di un attivatore trascrizionale CAP (reso attivo dalla presenza dell’cAMP), che è l’attivatore dei geni catabolici che segnala alla cellula l’assenza del glucosio reclutando o istruendo la pol a fare trascrizione. Quindi l’induzione dell’operone LAC avviene attraverso l’arrivo di due input, che tuttavia vengono controllati dalla presenza/assenza del glucosio.

Infatti, come abbiamo detto, il lattosio è una fonte alternativa al glucosio, quindi viene utilizzato nel momento in cui il glucosio è assente nel mezzo di coltura, perché se questo fosse presente verrebbe utilizzato preferenzialmente, anche perché l’operone del glucosio è un operone costitutivamente espresso. Quindi, se è presente glucosio, l’operone lac è represso, mentre se è assente il glucosio, ma presente lattosio, l’operone lac viene indotto, ovvero viene attivato. Tuttavia, anche se sono presenti entrambi, la cellula utilizzerà sempre preferenzialmente il glucosio e l’operone lac potrà essere attivo solo basalmente.

Quindi possiamo dire che l’induzione dell’operone lac viene controllata negativamente dalla presenza del glucosio con due diverse modalità:

• Esclusione dell’induttore: questo avviene perché il glucosio blocca il trasporto attivo, favorito dalla permeasi dei β-galattosidi all’interno della cellula, che sono quelle molecole che convertono il lattosio in allolattosio, che una volta trasformato funziona da induttore del repressore. In particolare, questo avviene perché il canale di trasporto del glucosio è formato da un sistema chiamato PTS che è quello fosfoenolpiruvato-glucosio-fosfotransferasi che è un sistema che non serve solo per il trasporto del glucosio, ma anche per il catabolismo degli zuccheri. Infatti, è un complesso della membrana plasmatica deputato al trasporto e alla fosforilazione del glucosio. In particolare, all’interno di questo complesso, esiste una proteina fondamentale che è la glcIIA (glicerol-kinasi), che rientra nel catabolismo del glucosio per due aspetti: perché viene implicata nel ciclo dei pentosi e anche nella formazione dei trigliceridi. In particolare, nel momento in cui viene trasportato il glucosio all’interno della cellula, succede che questa proteina IIA viene defosforilata, e in questa forma va a legare e inibire la permeasi (c’è sempre una quantità minima di permeasi, perché l’operone lac può essere espresso basalmente) che quindi non può più permettere l’entrata del lattosio e quindi dei betagalattosidi. Quindi in presenza di glucosio, la proteina IIA viene defosforilata, si lega alla permeasi, impedendo l’importazione del lattosio.
• Basse concentrazioni di cAMP: noi sappiamo che CAP funziona solo in presenza del cAMP, che è un metabolita delle cellule prodotto grazie all'enzima adenilato ciclasi a partire dall'ATP, che viene stimolata a produrre cAMP, dalla proteina IIA solamente quando questa è nella sua forma fosforilata. Quindi, quando è presente il glucosio, la proteina IIA sarà defosforilata e non potrà stimolare l’adenilato ciclasi e quindi non si arriverà alla produzione del cAMP, che quindi non potrà andare ad attivare l’attivatore trascrizionale CAP, che sarà presente nella sua forma inattiva, e quindi non potrà essere indotta l’espressione dell’operone lac, poiché questo secondo input dato da CAP, non arriverà.

Quindi, come abbiamo visto, per l’utilizzazione di fonti alternative al glucosio, in questo caso lattosio, c’è bisogno dell’integrazione di più segnali, ovvero non basta solo indurre il repressore a staccarsi, ma è anche necessaria l’assenza del glucosio, affinché venga innescata la trascrizione.