Regolazione genica a livello post trascrizionale

La coda CTD è fosforilata; la fosforilazione della coda CTD e la contemporanea

presenza del 5’ reclutano gli enzimi che modificano chimicamente il 5’, e voi sapete

che il 5’ degli RNA viene modificato soprattutto attraverso metilazione. Ci sono delle

metilazioni sia sull’anello carbonioso (lo zucchero), sia sugli anelli delle basi; diciamo

che comunque si può andare incontro ad una metilazione più o meno estesa a

seconda dei momenti o a seconda del tipo di geni che sono trascritti. Ma

fondamentalmente si ha una serie di reazioni chimiche che modificano il CAP…ma non

solo! A una metilazione più o meno estesa è associato il legame di un nucleotide al

contrario: cioè si forma una “struttura” in cui una G si attacca al contrario al primo

nucleotide trascritto (che è una A in larga maggioranza) attraverso un ponte trifosfato.

A questo 5’ è attaccato un gruppo fosfato con un altro gruppo fosfato, e questo

nucleotide non si attacca col suo 3’ a questo 5’, ma si attacca rovesciato. Quindi

abbiamo una catena che solo in questo punto è 5’-5’-e poi la giusta polarità. Quindi

abbiamo in realtà qui un 3’ libero che è quello di questa G che viene aggiunta, al quale

però non segue una giusta polarità della catena; le esonucleasi tendono a riconoscere

molto male questo tipo di conformazione.

Quindi il concetto è: a seguito del blocco della polimerasi e all’arrivo di fattori specifici

(reclutati dalla polimerasi) la catena di RNA nascente viene modificata chimicamente.

L’ultimo di questi enzimi che viene reclutato dalla polimerasi, che ha affinità per il DNA

metilato e per proteine specifiche che hanno effettuato questa modifica al 5’, in realtà

è una chinasi che fosforila sia la coda CTD che alcune delle proteine coinvolte in questi

processi. Questa iperfosforilazione provoca il distacco di questi fattori e a questo punto

la polimerasi è libera di scorrere di nuovo.

Esiste un controllo di stabilità e controllo del messaggero nei primissimi momenti di

trascrizione: a questo punto l’RNA viene fatto e cominciano a venir fuori tutte le

sequenze importanti per il processamento successivo che come sapete è quello dello

splicing.

Nel nostro genoma la gran parte delle sequenze presenti non sono codificanti; una

parte è composta da promotori (sequenze regolatrici della trascrizione), la grandissima

parte è costituita da introni. Che ci stanno a fare tutti questi introni? Sicuramente un

motivo è per lo splicing alternativo. Se andiamo a fare uno studio di omologia di

sequenza, vediamo che gli introni sono estremamente conservati fino ai batteri; a loro

volta, all’interno degli introni ci sono un sacco di geni, il che non sarebbe pensabile

visto il tasso di mutazione che c’è a ogni duplicazione del DNA. Questo perché

all’interno degli introni ci sono sia zone importanti per la trascrizione (abbiamo detto

che nel primo introne di solito c’è una sequenza enhancer per lo splicing), sia zone di

ancoraggio per altri fattori che fanno splicing o processamento post trascrizionale.

Evolutivamente avere DNA in più ci permette di avere mutazioni e per far sì che quella

parte di DNA non sia più un introne ma diventi parte di una proteina attraverso

splincing alternativo. In più c’è il fatto che ci servono sequenze da scambiare durante

la meiosi per permettere l’evoluzione attraverso il rimescolamento del DNA. Tuttavia,

tutti questi motivi non sono sufficienti per spiegare perché di introni ce ne sono così

tanti: se voi prendete un gene di lievito tipo Cerevisiae trovate circa 250 introni,

mentre già in lieviti più complessi dal punto di vista genomico praticamente tutti i geni

presentano introni.

Nei mammiferi questo potrebbe essere un gene tipo, dove l’mRNA di fronte a un

trascritto primario o di fronte a un gene è molto più piccolo.

Quest’altro gene presenta un’organizzazione tipo, dove oltre a un 5’ cappato c’è un

introne a monte del codone AUG: questa è una caratteristica di moltissimi geni, ossia

la presenza di una regione trascritta ma non tradotta. Questa parte a monte è il 5’

UTR, che di solito è di piccole dimensioni (un paio di centinaia di coppie di basi). Questi

sono gli esoni, qui c’è il codone di stop, e all’interno di questa zona esiste poi una

larga zona 3’ UTR che serve per la regolazione traduzionale del gene e che può essere

lunga anche parecchie migliaia di nucleotidi. A volte nei trascritti neuronali i 3’ UTR

sono estremamente lunghi perché c’è una regolazione traduzionale molto sviluppata,

addirittura più lunghi della parte codificante dell’mRNA.

Cioè quando voi avete uno splicing alternativo che dà 3’ UTR diversi, per esempio in

cellule muscolari, in cellule del sistema immunitario e in cellule neuronali (vi ricordo

che il DNA per tutti questi tipi di cellule è uguale) 90 volte su 100 lo splicing

alternativo che dà il 3’ UTR più lungo è quello dei neuroni. Quindi i neuroni tendono ad

avere, generalizzando statisticamente, i trascritti con un 3’ UTR più lungo di quelli che

codificano per la stessa proteina in cellule diverse. Questo perché ci permette una

regolazione traduzionale più sviluppata e sofisticata.

Gli introni vengono rimossi all’interno del nucleo; se prendete un introne tipo e lo

confrontate con lo stesso introne dello stesso gene in tante specie diverse, o lo

confrontate con sequenze di altri introni nello stesso organismo, trovate delle

omologie? Le estremità degli introni sono conservate, ma non solo: sono conservate

anche delle parti interne, che sono la consensus di conservazione che osservate

confrontando tanti introni diversi.

Vi ho raccontato la volta scorsa che le proteine che riconoscono gli acidi nucleici

tendono ad avere una box di riconoscimento lunga 8-12 bp. Quando voi fate questa

consensus qui in realtà ne trovate 7/8, e ci siamo, cioè le estremità 5’ dell’introne,

questo è l’esone e questo è l’introne, quindi questo è l’esone precedente all’introne e

questo è l’esone successivo e questa è la sequenza dell’introne. Quello che voi trovate

è una sequenza conservata a cavallo delle estremità 5’ e 3’. Se voi mettete a

confronto introni diversi, vedete che la G e la U sono in quantità invarianti, il che vuol

dire in pratica che il 100% degli introni ha come primi due nt G ed U, mentre gli ultimi

due sono A e D. Il significato di questo fatto sta che queste sequenze vengono

riconosciute da altri RNA, cioè il riconoscimento di una molecola di DNA è al 99%

mediato da proteine, quindi da atomi contenuti in domini proteici che stabiliscono

legami deboli con atomi presenti all’interno del DNA. Quanto prendete un RNA, al 60-

70% questo riconoscimento è mediato da altri RNA e questo è ovvio perché il DNA è a

doppia elica, e i legami H specifici che possono fare le basi sono impegnati con le basi

dell’elica complementare mentre un RNA è spesso a singola elica e i legami H che

fanno le basi sono liberi di interagire con un’altra elica complementare. I legami RNA-

RNA sono molto più stabili di quelli DNA-DNA. Quindi quando parlate di RNA e trovate

una consensus di sequenza, 60-70% delle volte lì interviene un altro RNA che ha il

compito di legare quella sequenza e magari di trasportare attraverso questo legame

specifico proteine che poi hanno un’attività enzimatica. Però il riconoscimento e il

trasporto di questi fattori sull’RNA avviene attraverso il riconoscimento di

complementarietà di basi fra molecole di RNA che agiscono in trans. Questo è il

motivo per cui delle volte bastano molte meno basi, perché magari in un complesso di

splicing ben giustapposto bastano due tre basi affinchè un RNA riconosca e stabilizzi

poi il complesso proteico che si deve legare in questa posizione.

Confrontando gli introni vengono fuori anche altre cose, le più evidenti sono una

sequenza di pirimidine, U o C, che è vicino al 3’ dell’introne e poi una A importante

contenuta all’interno di una box più o meno conservata (molto conservata negli

eucarioti semplici, molto meno ben conservata negli eucarioti complessi). La presenza

di questa A affinchè lo splicing possa avvenire è importante perché in un mammifero

(nel lievito c’è praticamente assenza di splicing alternativo) questo introne può servire

delle volte e altre no, se c’è un branch site molto forte quello determina il fatto che

deve sempre essere eliminato.

Quindi quando trovate delle sequenze di splicing molto buone e quindi perfettamente

aderenti alla consensus, vuol dire che quell’introne non andrà incontro a forti fenomeni

di splicing alternativo; se ho una sequenza “bruttina” il macchinario di splicing ci

metterà un po’ più di tempo a riconoscerla e magari questo tempo in più mi permette

di sfuggire e di andare avanti, perché ricordiamo che tutta questa storia avviene

insieme alla trascrizione: se questo introne viene rimosso subito noi non lo troveremo

mai, se questo introne che viene fatto prima ha delle sequenze brutte, i fattori che

devono legare queste sequenze si legheranno male e questo introne rimarrà qui.

Queste sequenze sono molto conservate nei mammiferi e si ritrovano praticamente in

tutti gli introni.

Quindi una consensus alla giunzione 5’ dell’introne, una alla 3’ dell’introne e delle

sequenze consensus all’interno, una box di pirimidine e una A contenuta anch’essa in

una box (sempre a 2/3 o ¾ dell’introne, rivolta verso il 3’).

Queste sequenze sono riconosciute da RNA, in particolare da particelle

ribonucleoproteiche (small nuclear RNP, intorno al centinaio di basi) composte da RNA

(U1, U2, U4, U5, U6) che hanno il compito di portare fattori proteici (10, 12, 15), alcuni

conservati alcuni specifici nel senso che la particella U1 avrà delle proteine in comune

con la particella U2 e altre tutte specifiche per se’. Queste particelle

ribonucleoproteiche arrivano sul pre mRNA attraverso un’interazione RNA-RNA

specifica; l’RNA U1 porta questa particella snRNP U1 sulla giunzione 5’ di splicing. Che

sequenza ha U1 in direzione 5’-3’? E’ una sequenza unica derivante dal gene che la

codifica e che devere riconoscere tutti i 5’, tutti diversi fra loro. Il 62% di 5’ all’interno

di una cellula ha una A in questa posizione; questo vuol