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Regolazione genica a livello post trascrizionale

Appunti di Neurobiologia molecolare sulla Regolazione genica a livello post trascrizionale basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni del prof. Presutti dell’università degli Studi La Sapienza - Uniroma1, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Neurobiologia molecolare docente Prof. C. Presutti

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confrontate con sequenze di altri introni nello stesso organismo, trovate delle

omologie? Le estremità degli introni sono conservate, ma non solo: sono conservate

anche delle parti interne, che sono la consensus di conservazione che osservate

confrontando tanti introni diversi.

Vi ho raccontato la volta scorsa che le proteine che riconoscono gli acidi nucleici

tendono ad avere una box di riconoscimento lunga 8-12 bp. Quando voi fate questa

consensus qui in realtà ne trovate 7/8, e ci siamo, cioè le estremità 5’ dell’introne,

questo è l’esone e questo è l’introne, quindi questo è l’esone precedente all’introne e

questo è l’esone successivo e questa è la sequenza dell’introne. Quello che voi trovate

è una sequenza conservata a cavallo delle estremità 5’ e 3’. Se voi mettete a

confronto introni diversi, vedete che la G e la U sono in quantità invarianti, il che vuol

dire in pratica che il 100% degli introni ha come primi due nt G ed U, mentre gli ultimi

due sono A e D. Il significato di questo fatto sta che queste sequenze vengono

riconosciute da altri RNA, cioè il riconoscimento di una molecola di DNA è al 99%

mediato da proteine, quindi da atomi contenuti in domini proteici che stabiliscono

legami deboli con atomi presenti all’interno del DNA. Quanto prendete un RNA, al 60-

70% questo riconoscimento è mediato da altri RNA e questo è ovvio perché il DNA è a

doppia elica, e i legami H specifici che possono fare le basi sono impegnati con le basi

dell’elica complementare mentre un RNA è spesso a singola elica e i legami H che

fanno le basi sono liberi di interagire con un’altra elica complementare. I legami RNA-

RNA sono molto più stabili di quelli DNA-DNA. Quindi quando parlate di RNA e trovate

una consensus di sequenza, 60-70% delle volte lì interviene un altro RNA che ha il

compito di legare quella sequenza e magari di trasportare attraverso questo legame

specifico proteine che poi hanno un’attività enzimatica. Però il riconoscimento e il

trasporto di questi fattori sull’RNA avviene attraverso il riconoscimento di

complementarietà di basi fra molecole di RNA che agiscono in trans. Questo è il

motivo per cui delle volte bastano molte meno basi, perché magari in un complesso di

splicing ben giustapposto bastano due tre basi affinchè un RNA riconosca e stabilizzi

poi il complesso proteico che si deve legare in questa posizione.

Confrontando gli introni vengono fuori anche altre cose, le più evidenti sono una

sequenza di pirimidine, U o C, che è vicino al 3’ dell’introne e poi una A importante

contenuta all’interno di una box più o meno conservata (molto conservata negli

eucarioti semplici, molto meno ben conservata negli eucarioti complessi). La presenza

di questa A affinchè lo splicing possa avvenire è importante perché in un mammifero

(nel lievito c’è praticamente assenza di splicing alternativo) questo introne può servire

delle volte e altre no, se c’è un branch site molto forte quello determina il fatto che

deve sempre essere eliminato.

Quindi quando trovate delle sequenze di splicing molto buone e quindi perfettamente

aderenti alla consensus, vuol dire che quell’introne non andrà incontro a forti fenomeni

di splicing alternativo; se ho una sequenza “bruttina” il macchinario di splicing ci

metterà un po’ più di tempo a riconoscerla e magari questo tempo in più mi permette

di sfuggire e di andare avanti, perché ricordiamo che tutta questa storia avviene

insieme alla trascrizione: se questo introne viene rimosso subito noi non lo troveremo

mai, se questo introne che viene fatto prima ha delle sequenze brutte, i fattori che

devono legare queste sequenze si legheranno male e questo introne rimarrà qui.

Queste sequenze sono molto conservate nei mammiferi e si ritrovano praticamente in

tutti gli introni.

Quindi una consensus alla giunzione 5’ dell’introne, una alla 3’ dell’introne e delle

sequenze consensus all’interno, una box di pirimidine e una A contenuta anch’essa in

una box (sempre a 2/3 o ¾ dell’introne, rivolta verso il 3’).

Queste sequenze sono riconosciute da RNA, in particolare da particelle

ribonucleoproteiche (small nuclear RNP, intorno al centinaio di basi) composte da RNA

(U1, U2, U4, U5, U6) che hanno il compito di portare fattori proteici (10, 12, 15), alcuni

conservati alcuni specifici nel senso che la particella U1 avrà delle proteine in comune

con la particella U2 e altre tutte specifiche per se’. Queste particelle

ribonucleoproteiche arrivano sul pre mRNA attraverso un’interazione RNA-RNA

specifica; l’RNA U1 porta questa particella snRNP U1 sulla giunzione 5’ di splicing. Che

sequenza ha U1 in direzione 5’-3’? E’ una sequenza unica derivante dal gene che la

codifica e che devere riconoscere tutti i 5’, tutti diversi fra loro. Il 62% di 5’ all’interno

di una cellula ha una A in questa posizione; questo vuol dire che l’altro 30% ha una G

e l’altro 8% un’altra base. U1 riconoscerà pochi geni in maniera ottimale, molti in

maniera sub-ottimale e quindi avrà una certa efficienza di splicing. Già analizzando le

sequenze di splicing possiamo definire se quell’introne andrà incontro a splicing

alternativo (tanto è più brutta la sua sequenza sub-ottimale, tanto più andrà incontro a

splicing alternativo).

Ci sono però tanti geni che hanno una sequenza ottimale ma vanno incontro a splicing

alternativo. Come possiamo spiegare ciò? Posso avere dei fattori che legano una

sequenza specifica più lunga bloccando l’arrivo di U1: se U1 non riconosce più la sua

sequenza, l’introne non viene più spliceato. Molte patologie (es. distrofia muscolare)

hanno geni lunghissimi e splicing complessi e se c’è uno splicing alternativo in un

determinato punto questo manda fuori frame l’intera proteina. E quindi la mancanza di

un pezzo anche piccolo può essere più grave della mancanza di un pezzo molto più

lungo nell’mRNA che però non manda fuori frame la proteina. Questo succede nella

distrofia muscolare di Duchenne rispetto a quella di Becker, che hanno due gravità

estremamente differenti; in realtà in una (Becker) manca un pezzo di proteina molto

più lungo però quello che ha la rimanda in frame, nell’altra (Duchenne) il pezzo

mancante è più corto ma è molto più grave perché la manda fuori frame. Si sta

cercando di intervenire mettendo dentro molecole provenienti dall’esterno che

bloccano lo splicing in maniera specifica con un RNA, questo perchè è abbastanza

facile introdurre RNA all’interno di una cellula (opportunamente inserito in vettori)

interferendo in processi come lo splicing alternativo e modificare l’espressione genica.

Tornando U1, esso è uno dei primi attori e ha il compito di legare quella sequenza al 5’

dell’introne; dall’altra parte in corrispondenza della sequenza di pirimidine si lega U2.

Il concetto è che c’è un punto dello splicing in cui al pre-mRNA sono legati U1 e U2, fra

la sequenza di polipirimidine e il branch point (punto di ramificazione). Quando

abbiamo il legame di questi due fattori ribonucleoproteici sul pre-mRNA si ha

l’assemblaggio dello spliceosoma, che è un complesso grosso formato da 5 snRNP (U1,

U2, U4, U5 e U6, ognuno dei quali formato da RNA di 100, 150, 200 nt, ricco in U)

ognuno dei quali ha un corredo proteico di 10/15 elementi. Questo ha il compito di

piegare l’RNA e durante questo piegamento i due esoni vengono portati in prossimità

in modo che poi possano fondersi. Per permettere questo però la molecola deve essere

tagliata: ma sappiamo che una estremità libera dell’RNA è sinonimo di guai perché le

esonucleasi entrano in modo processivo ed efficace. Quindi le estremità, soprattutto le

5’ che si formano in questo processo devono essere bloccate; la cellula adotta delle

strategie, una delle quali è che questa A nel punto di ramificazione va incontro alla

formazione di uno strano legame dove c’è il 5’ legato al nt precedente, il 3’ a quello

successivo mentre il 2’ di questa A che ha un OH, va a legare l’estremità 5’ tagliata.

Quindi il 5’ dell’introne durante il ripiegamento si va a trovare vicino al 3’ dell’introne e

si lega alla A al 2’ OH. Si ha un ponte fosfodiesterico come durante la formazione di un

acido nucleico normale. Questo succede perché durante l’appaiamento di U2 (che è

l’RNA che lega in corrispondenza del branch site) con la consensus riconosciuta, viene

tenuta fuori la A, la quale protrude dalla doppia elica e può essere riconosciuta con

efficienza durante lo splicing.

Il complesso ribonucleoproteico protegge dall’entrata di altri enzimi; l’estremità 5’

viene bloccata in maniera chimica, e non esiste nessun enzima in grado di riconoscere

e processare questo tipo di legame. La 3’ già più stabile di suo è comunque contenuta

all’interno, successivamente a questo taglio la 3’ libera al suo interno trova la 5’

dell’esone successivo e si forma il ponte fosfodiesterico. Questo si ha perché sequenze

dei piccoli RNA U4, U5 e U6 portano queste due giunzioni esoniche , le giustappongono

e poi avviene la saldatura.

E’ chiaro che se questo non succede, l’RNA viene degradato. Questo può avvenire

perché magari la formazione della giunzione 5’-3’ non è efficiente, o perché ci sono

proteine accessorie che danno fastidio o perché ci sono troppo pochi fattori di splicing

(è difficile ma può succedere). In seguito al legame dei due esoni l’introne con tutte le

proteine attaccate esce dal nucleoplasma in forma di cappio; questa struttura deve

essere degradata, e per essere degradata deve essere aperta. Esiste un enzima, il

branching, deputato a ciò. Se modifichiamo tale enzima, la cellula muore perché

l’accumulo di questi introni è tossico. Le ribonucleoproteine, terminato il loro compito,

vengono riciclate per splicing successivi.

Su questo meccanismo di base si possono instaurare diversi altri fenomeni, casi ad

esempio in cui l’esone 1 viene legato direttamente all’esone 3. Quale estremità è

saltata?

(da qui in poi c’è la spiegazione del disegno delle slides, non l’ho riportata perché il

prof dice in continuazione “qui”, “questa”, e non si capisce nulla. Consiglio di vedere

bene i disegni sulle slides e sugli appunti).

Quindi grazie allo splicing noi possiamo legare 3’ a 5’ diversi (o il contrario), possiamo

avere lo splicing grazie al riconoscimento di legami criptici che normalmente non

vengono riconosciuti ma che magari vengono aumentati in seguito all’arrivo di fattori

specifici. Esistono anche dei meccanismi, come per es. la determinazione del sesso in

Drosphila, che avvengono unicamente grazie ad eventi di splicing alternativo.

Qui vediamo un gene classico, come la tropomiosina, che va incontro a splicing

altenativo; nel cervello, in questo caso il 3’ UTR è più lungo: questo per permettere la

regolazione traduzionale a carico di microRNA diversi.

Concludendo quindi, diciamo che la quantità di proteina dipende da quanto mRNA

viene fatto e quanto ne viene tradotto. In più la proteina non è proprio la stessa in

diversi tipi cellulari, esiste un mix di mRNA diversi la cui quantità relativa cambia in

cellule diverse.


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AUTORE

ludide

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5 mesi fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in neurobiologia
SSD:
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher ludide di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Neurobiologia molecolare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università La Sapienza - Uniroma1 o del prof Presutti Carlo.

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