Regolazione genica

Il controllo genico

Una molecola di DNA è lunga quasi 2 m e di tutta questa grande molecola sappiamo che solo il 3% circa codifica proteine, il 76% serve, invece, a formare quelli che sono i non-coding RNA e il 21% ha funzione ad oggi ancora sconosciuta. In ogni singolo momento una singola cellula esprime circa il 50% dei suoi geni, che più o meno sono 30.000; di questi 30.000 geni:

• 21.000 codificano per proteine
• 9000 codificano per RNA non codificanti

Un neurone e una cellula epatica, nonostante abbiano lo stesso DNA, hanno struttura, dimensioni e funzioni differenti. Ciò è dovuto al fatto che c'è una regolazione dell'espressione genica diversa fra i due tipi cellulari. Un gene è quella sequenza di DNA che codifica per una proteina (RNA codificante), oppure per un RNA non codificante per proteine.

Conservazione genoma

La prima prova della conservazione del genoma durante il differenziamento cellulare riguarda esperimenti eseguiti sulle rane. Il nucleo della cellula di rana differenziata viene prelevata e iniettata in un uovo enucleato. Il DNA contenuto nel nucleo permette la formazione di un nuovo organismo. Una cellula differenziata non perde dunque le sue caratteristiche.

Figura 1 Conservazione genoma nelle rane

Figura 2 Conservazione genoma nei vegetali

Figura 3 Conservazione genoma nei mammiferi

RNA Seq

L'RNA sequencing (RNA-Seq) è una tecnica per l'analisi e la quantificazione del trascrittoma e permette di differenziare RNA espressi in cellule diverse. Cellule diverse sintetizzano RNA e proteine diverse. Ad esempio, il gene b-actina del citoscheletro, che è un gene house keeping, lo troviamo espresso in quasi tutti i tipi cellulari. Il grafico riporta le reads, ovvero le sequenze che identificano l'ordine in cui si susseguono le basi azotate che compongono il gene. Le read sono dunque la lettura delle singole sequenze ottenute mediante sequenziamento. In corrispondenza degli esoni le read sono presenti a livelli più elevati, mentre in corrispondenza degli introni si hanno livelli più bassi. Il numero di read che mappano su un gene è proporzionale al livello di espressione.

Il gene per la tirosina amminotrasferasi è espresso per lo più a livello delle cellule epatiche e non viene espresso in cellule quali quelle del muscolo e della pelle. Nel processo dell'RNA sequencing si vanno a frammentare gli RNA. L'RNA frammentato viene convertito in cDNA. Questo è importante perché il cDNA, essendo a doppio filamento, è più stabile del singolo filamento di RNA. Si procede poi con amplificazione mediante PCR. Gli amplificati vengono poi sottoposti a sequenziamento.

Anche le proteine sono espresse diversamente nei diversi tessuti. Per dimostrarlo a livello pratico si utilizza l'elettroforesi bi-dimensionale su gel di poliacrilammide che permette di separare le proteine per peso molecolare e punto isoelettrico. La separazione in base alla carica viene utilizzata non solo per separare diverse proteine (avendo amminoacidi diversi e quindi cariche diverse), ma anche per indicare il grado di attività; se infatti la proteina migra in maniera orizzontale vuol dire che ha subito una modificazione.

Figura 4 Differenze tra proteine espresse in due tessuti umani. In rosso sono indicate le proteine presenti in entrambi i tessuti e in blu quelle specifiche per un dato tessuto. Le proteine presenti in entrambi i tessuti sono però presenti in quantità differenti.

Vantaggi

• Possibilità di caricare campioni non purificati
• Risoluzione estremamente alta
• I gel 2 DE sono collettori di frazioni proteiche molto efficienti
• Proteine sono protette all'interno della matrice del gel

Svantaggi

• Gradiente di pH
• Limiti nel determinare proteine poco rappresentate
• Capacità di caricare campione
• Proteine ad alto peso molecolare

Controllo dell'espressione genica nei procarioti

L'operone è caratterizzato da una serie di geni regolati in modo coordinato tra loro, la regione promotore e la regione operatore. Quest'ultima si trova in continuità con il promotore e regola l'espressione dei geni strutturali, in questo caso quelli necessari per la sintesi del triptofano. Questo operone è acceso quando vi è bisogno di sintetizzare triptofano e spento quando è già presente. In questo caso il triptofano si va a legare al repressore che si lega alla zona operatore bloccando il promotore e quindi l'operone.

Figura 5 - L'operone Lac è acceso o spento a seconda della presenza di lattosio.

Controllo dell'espressione genica negli eucarioti

Negli eucarioti l'espressione genica è regolata a diversi livelli. Sembrano infatti esistere sistemi per il controllo della trascrizione, della maturazione degli RNA precursori, del trasporto dell'RNA maturo fuori dal nucleo, della traduzione degli mRNA, della degradazione degli RNA maturi e dei prodotti proteici. L'espressione genica è spesso controllata da proteine regolatrici che si legano a sequenze specifiche del DNA. Fino alla fine degli anni '60 si pensava che le proteine regolatrici interagissero con l'interno del DNA, è invece l'esterno della doppia elica che fornisce maggiori informazioni, che permettono alle proteine regolatrici di riconoscere una determinata sequenza.

Le proteine regolatrici hanno accesso alle basi del DNA nel solco maggiore.

Il riconoscimento delle sequenze specifiche da parte delle proteine regolatrici avviene sulla base di schemi caratteristici che caratterizzano solco maggiore e solco minore. La diversa esposizione dei due solchi individua gruppi funzionali diversi: idrogeno, azoto, ossigeno, gruppi metilici e idrogeno legato a C non disponibile per i legami. I gruppi chimici esposti dalle basi azotate creano un codice riconosciuto dalle proteine regolatrici, che riconosceranno così, direttamente e senza ambiguità, la sequenza di DNA da legare senza bisogno di svolgere la doppia elica.

→SOLCO G-C MAGGIORE C-G →SOLCO MINORE A-T →SOLCO MAGGIORE T-A →SOLCO MINORE

Le informazioni fornite dal solco minore sono poco utilizzabili dalle proteine regolatrici e per tale motivo quest'ultime leggono il solco maggiore.

Un regolatore di trascrizione deve riconoscere sequenze specifiche, di solito un monomero di un regolatore trascrizionale riconosce 6-8 coppie di nucleotidi del DNA. Le proteine però, non legano solo una sequenza ma possono legare diverse sequenze tra loro correlate, quindi vi può essere una certa variabilità nella sequenza riconosciuta.

Nell'immagine sottostante si hanno:

• Una sequenza cis regolatrice da parte di un una proteina Nanog, regolatore importante per le cellule staminali embrionali;
• Le basi riconosciute dalla proteina;

Al primo posto di questa sequenza può esserci una C o una T (le lettere più grandi mostrano una maggiore possibilità di presenza nella sequenza), in seconda e terza posizione ci saranno sicuramente due A e così via. I regolatori agiscono difficilmente come monomeri e più frequentemente come dimeri, che possono essere distinti in omodimeri e in eterodimeri.

Figura 5 GRE: recettore per glucocorticoidi. ERE: recettore per estrogeni.

Figura 6 VDRE: recettore vitamina D. TRE: recettore ormoni tiroidei. RARE: sequenza che lega il recettore dell'acido retinoico.

Legame cooperativo

I regolatori trascrizionali si legano spesso in maniera cooperativa al DNA. Nel legame non cooperativo all'aumentare della concentrazione della proteina aumenta l'occupazione del DNA e si ha una curva di tipo esponenziale. Nel legame cooperativo la frazione di proteina che lega il DNA aumenta all'aumentare della concentrazione della proteina, si ha una curva sigmoide. Il legame cooperativo fa variare l'affinità della proteina per il ligando in base alla concentrazione del ligando già legato, se l'associazione del ligando al primo sito incrementa l'affinità tra gli altri siti ed altre molecole di ligando, si parla di cooperatività positiva, al contrario, se il legame di una molecola ne riduce l'affinità sugli altri siti di legame, si parla di cooperatività negativa. Affinché questo avvenga la macromolecola deve avere più di un sito di legame.

Una volta che il fattore di trascrizione è legato può legarsi anche ad un sito vicino aiutando il legame di un altro fattore di trascrizione o creare una barriera per evitare legami indesiderati. Ad esempio, si ha una sequenza generica di 8 basi, un fattore di trascrizione A lega le basi da 1 a 7 mentre un fattore B da 3 a 5. Se A si lega al DNA, il fattore B sarà impossibilitato a legarsi.

Modificazioni DNA

Per comprendere come i regolatori legano il DNA bisogna considerare la struttura nucleosomica. Se il DNA è legato al core nucleosomico i regolatori fanno fatica a legarsi rispetto al DNA libero. Il rimodellamento della cromatina permette alla proteina di accedere al DNA grazie alla “respirazione”. Questo processo permette di rendere accessibile il DNA per un determinato periodo di tempo. Durante la regolazione trascrizionale il DNA può ripiegarsi e formare delle anse. Le sequenze regolatorie possono infatti trovarsi a grandi distanze dal sito del gene che controllano e per questo motivo si devono formare delle anse che permettono alle sequenze cis di interagire con l'RNA polimerasi. Questo meccanismo avviene normalmente negli eucarioti e rappresenta un’eccezione per i procarioti.

Si possono avere attivatori e inibitori della trascrizione. Gli attivatori modificano la struttura della cromatina per rendere accessibili le sequenze di DNA ai regolatori. Questo può avvenire in diversi modi:

• Il regolatore della trascrizione può reclutare il complesso di rimodellamento della cromatina che permette l'accesso al DNA tramite:
  • Lo spostamento del nucleosoma
  • La rimozione del nucleosoma ad opera di proteine chaperone degli istoni
  • La sostituzione degli istoni classici con delle varianti che permettono un migliore accesso al DNA
• Il regolatore di trascrizione richiama degli enzimi che modificano le code degli istoni in modo da destabilizzare forme compatte di cromatina e rendere il DNA accessibile.

Rimodellamento della cromatina

La regione del promotore è ricca in basi AT, questa condizione è importante perché non favorisce la flessione del DNA intorno al nucleosoma. Nella regione promotore viene richiamato un rimodellatore della cromatina (RSC) che rimuove il nucleosoma e crea una regione priva di nucleosoma (NDR). Questo permette l'azione di altre proteine che rimodellano la cromatina, come SWR che va a rimuovere altri nucleosomi continui della sequenza o ad aggiungere varianti istoniche che rendano più accessibile il DNA. Questo permette l'inizio della trascrizione.

Modificazioni istoniche

Il legame di un attivatore trascrizionale attrae delle proteine, le istone acetiltrasferasi, che vanno ad acetilare le code istoniche, la lisina 9 sull’istone 3, tra le modificazioni più conosciute associate ad attivazione genica. Questo provoca il richiamo di altre proteine, le chinasi, che vanno a fosforilare gli amminoacidi. A questo punto, avvenute queste due modificazioni, interviene il primo fattore di trascrizione, interviene anche il complesso di rimodellamento della cromatina, si assembla il macchinario trascrizionale e inizia la trascrizione.

Attivatori

Gli attivatori trascrizionali possono agire in passaggi diversi. Gli attivatori possono anche lavorare in maniera sinergica. In questo caso il risultato finale è dato dal loro prodotto e non dalla loro somma.

Repressori

Isolatori

Sono delle sequenze di DNA che impediscono ai regolatori di influenzare geni distanti. Sequenza barriera: un particolare tipo di sequenza che blocca l’eterocromatina, impedendole di muoversi verso i geni e di bloccarli.

Gli isolatori svolgono principalmente due funzioni: un esempio della funzione vitale che svolgono gli isolatori è dato dall’isolatore CCCTC-binding factor o CTCF. Questo isolatore è responsabile della trascrizione di geni imprintati, come IGF2 e H19. In questo caso si ha una sequenza espressa per via materna (H19) e una per via paterna (IGF2).

• Sull'allele materno l'ICR del gene H19 non viene metilata e serve come elemento di legame con la proteina CTCF (CCCTC binding factor) che inibisce l'interazione degli enhancers con il promotore di Igf2, portando alla repressione del gene Igf2 e l'espressione di H19.
• Sull'allele paterno, l'impronta di metilazione presente sulla ICR di H19 non permette il legame con la proteina CTCF, questo consente il legame degli enhancers al promotore e l'espressione di Igf2.

Regolazione delle proteine regolatrici

La regolazione può avvenire in diversi modi:

1. Tramite la sintesi quando è richiesta la proteina;
2. Tramite l'attacco di un ligando;
3. Mediante modificazione covalente;
4. Dopo l'aggiunta di una seconda subunità;
5. A seguito della rimozione di un inibitore;
6. Mediante stimolazione dell'ingresso nel nucleo;
7. Con il rilascio dalla membrana;

Esempi

Tramite l'attacco di un ligando

Questo è il caso degli steroidi. Infatti, lo steroide sarà in grado di indurre una dimerizzazione dei recettori a livello membrana plasmatica e si andrà a legare al suo recettore, così il complesso recettore-steroide sarà in grado di entrare nel nucleo e svolgere la sua funzione.

Modificazione covalente-fosforilazione

Il fattore di trascrizione si trova nel nucleo e viene fosforilato dalla proteina chinasi. Solo una volta che viene fosforilato si lega ad una sequenza enhancer/attivante (CRE) e può avvenire la trascrizione.

Importanza elementi di controllo

Il fatto che cellule diverse contengano lo stesso DNA e che i geni vengano accesi in un caso e non in un altro (differenziazione cellulare) è legato alla combinazione degli attivatori trascrizionali, che si trovano ad essere attivi in una cellula e non in un'altra. Quindi questi ricoprono una funzione fondamentale, in quanto in base alla loro attivazione nel tempo e nel tessuto di riferimento possono controllare il differenziamento cellulare.

Un esempio pratico di quanto detto è l'enzima alcool deidrogenasi nel fegato e nei neuroni. Infatti, lo stesso enzima, essendo modulato in maniera diversa dagli attivatori trascrizionali, produce risultati diversi. Nel fegato l'alcool deidrogenasi porta alla detossificazione delle sostanze mentre nei neuroni questo enzima si occupa della produzione di neurotrasmettitori. Un altro esempio dell'importanza che rivestono gli attivatori trascrizionali e la loro modulazione è dato dalla modificazione fenotipica a cui si può assistere in un organismo modello come la Drosophila melanogaster. Ad alte temperature si può indurre l'attivazione di geni che porteranno alla formazione di occhi lì dove invece dovrebbero essere silenziati.

È possibile manipolare i regolatori degli attivatori trascrizionali, basti pensare alle cellule IPS. Il problema di questa tecnica è che viene però persa la memoria epigenetica (cancellamento di tutte quelle modificazioni effettuate sul DNA durante la vita dell'individuo); problema fondamentale se si vogliono fare studi sul condizionamento ambientale di un soggetto. Si è però visto come poter bypassare questo passaggio, ovvero usando dei fattori di trascrizione intermedi che effettuano direttamente questo passaggio da una forma cellulare ad un'altra senza l'intermedio IPS (è qui che la memoria viene cancellata). Tra i meccanismi che rinforzano la memoria cellulare c'è ad esempio la metilazione del DNA che è un meccanismo che oltre alla regolazione di altri meccanismi epigenetici va a rinforzare la memoria cellulare. La metilazione che avviene per lo più a livello della posizione 5 di citosine, soprattutto quando legate a guanine a costituire quelle che vengono chiamate isole CpG.

La metilazione è una modificazione biochimica e coinvolge l'aggiunta di un gruppo metile al livello del carbonio-5 della citosina, quasi esclusivamente nel contesto del di-nucleotide CpG. La connessione tra metilazione del DNA e trascrizione genica è stata intensamente studiata negli ultimi 40 anni; il modello che attualmente gode di consenso trasversale nella comunità scientifica vede la metilazione del DNA associata a repressione della trascrizione. In particolar modo, la metilazione di un promotore a monte di un gene causerebbe la sua repressione, che a sua volta può essere invertita o alleviata tramite demetilazione della stessa sequenza. In altre parole, i diversi pattern di metilazione, dunque, regolano l'accensione e lo spegnimento di alcuni geni. È chiaro che un errore nella metilazione del DNA determina un cambiamento nell'organizzazione spaziale della cromatina e ciò determina, a sua volta, delle 'stonature'; situazioni di ipo- o iper-metilazione, possono portare rispettivamente all'accensione o spegnimento di geni che agiscono come oncosoppressori o nei meccanismi di riparo del DNA. Epimutazioni di questo tipo sono state identificate in molti tipi di tumori. La metilazione del DNA a livello di isole CpG è associata con repressione genica. Tali isole CpG, sono preferenzialmente localizzate al promotore dei molti geni, in particolar modo di geni house-keeping e in alcuni geni tessuto-specifici. Una volta stabilito lo schema di metilazione, questo viene mantenuto ad opera di DNA-metil-transferasi di mantenimento, le quali hanno una particolare affinità per le sequenze emi-metilate, e tendono dunque a metilare il nuovo filamento formatosi su uno stampo già metilato.