Regolazione genica

REVERSE GENETICS

Mediante questo approccio si mira, invece, a conoscere le funzioni di un gene in particolare mediante l'analisidel fenotipo.

Il gene d'interesse viene over-espresso, deleto o parzialmente silenziato, in modo tale che non possa svolgerela propria normale funzione, generando così un organismo knockout. È possibile così effettuare studi clinicie molecolari sull'organismo knockout per comprendere la funzione specifica del gene d'interesse.

La reverse genetics, rispetto alla forward genetics, è molto più veloce e semplice ma bisognanecessariamente conoscere la sequenza del gene che si vuole studiare, per poter effettuare le modificazioniopportune.

Per studiare il trascrittoma si possono utilizzare diverse analisi:

• Microarray
• RNAseq

1. MICROARRAY

I saggi di ibridazione in vitro permettono di identificare la presenza e la quantità di sequenze specifiche(bersaglio) in un campione biologico in esame

Attraverso l'utilizzo di acidi nucleici a sequenza nota, ovvero delle sonde. Le sonde vanno a riconoscere in maniera specifica solo la sequenza complementare e vengono marcate in modo da essere visibili e riconoscibili.

Il microarray è un supporto solido sul quale sono immobilizzate migliaia di sequenze geniche differenti per poter studiare contemporaneamente assetti genetici o pattern di espressione. Vengono utilizzati dei supporti di vetro, di chip a silicone o membrane di nylon. Le sequenze immobilizzate possono essere oligonucleotidi, sequenze di DNA o sequenze di cDNA.

Gli Array sono dunque un insieme ordinato di sequenze genomiche conosciute e marcate, fissate ad un substrato solido secondo uno schema ricostruibile.

Possiamo distinguere due tipi di microarray:

1. cDNA microarrays
2. high density oligonulceotide arrays

FUNZIONAMENTO DEGLI ARRAY

- Preparazione delle sonde: cDNA o oligonucleotidi provenienti da una libreria vengono fissati su una griglia dove sono presenti

degli spot. In ogni spot ci sono centinaia di copie di sonde, diverse per ogni spot.

Preparazione del target: l'RNA delle cellule da esaminare è convertito in cDNA e marcato con nucleotidi fluorescenti in modo da valutare l'intensità del segnale emesso dal fluoroforo quando eccitato da un laser. Come coloranti fluorescenti si usano le cianine Cy5 (emette nel rosso) e Cy3 (emette nel verde), dove i numeri 5 e 3 indicano il numero di gruppi CH presenti tra i due etero-cicli della struttura delle due molecole.

In particolare, dopo aver estratto l'RNA, nel momento della sintesi del cDNA vengono inseriti oltre ai dNTP dei dNTP marcati. Si utilizzano due fluorocromi diversi, uno per il campione ed uno per il controllo.

Deposito dei campioni marcati sulla griglia: si prende una quantità uguale dei due campioni e si mixano con le sonde presenti nella griglia;

Ibridazione e lavaggio;

Lettura della fluorescenza: il chip viene scansionato

punto per punto. La fluorescenza gialla (rosso + verde) indica un’espressione equivalente del gene nei due campioni, il rosso indica una maggiore espressione nel campione in esame e il verde una maggiore espressione nel campione di controllo.

Le tecniche di array sono qualitative e non quantitative.

Quando si utilizzano sonde di oligonucleotidi, il meccanismo di ibridazione è lo stesso ma l’ibridazione viene rilevata da un dispositivo elettronico. Gli oligonucleotidi da analizzare sono però in maggiore quantità (30.000) e sono specifici ognuno per un singolo gene. La tecnica che prevede l’utilizzo di oligonucleotidi è quindi più specifica. Gli oligont sono più complicati da usare per la visualizzazione del segnale perché si devono usare due piastre diverse e fare un rapporto. Il segnale è difficile da interpretare.

GENOTECHE DI DNA è possibile costruire delle genoteche (o librerie) di DNA. Possono essere di due

1. Clonazione in cellule ospite.

RNAseq

Si sequenziano tutte le molecole di RNA e i profili di espressione di un gene vengono valutati contando il numero di volte in cui i suoi trascritti sono sequenziati. Quindi dalle reads viene fuori una sorta di quantificazione non assolta di quanto un gene è espresso in un campione. Il workflow dell'RNAseq è simile al sequenziamento: frammentazione dell'RNA, conversione in cDNA e aggiunta di adattatori, ibridizzazione e sequenziamento. Sulla base delle reads che si ottengono si valuta se e quanto un gene è più o meno espresso.

Perché utilizzare l'RNAseq:

• Per valutare i livelli dei trascritti di organismi sequenziati e non
• Trovare nuovi trascritti e isoforme
• Mappare giunzioni esone/introne
• Analizzare splicing alternativi
• Trovare nuove variazioni (es SNPs)

Limiti:

• Copertura non uniforme del genoma
• Lunghezza dei trascritti non

sempre adeguata− Lettura incerta per errori o elementi ripetitivi o incompletezza della sequenza genomica− Software bioinformatici da migliorare− Molto costosa DELL’EPIGENETICACAPITOLO 7-LE BASI MOLECOLARIEPIGENETICAL’epigenetica è lo studio dei meccanismi che coinvolgono il DNA che possono andare a modularel’espressione genica senza implicare cambiamenti nella sequenza del DNA stesso.Bruce Lipton (esperto di epigenetica) definisce questa disciplina come la scienza che mostra che i geni non siauto-controllano ma sono controllati dall’ambiente. Parla di una portata rivoluzionaria da un punto di vistasociale e ambientale perché questa scoperta permette di comprendere che l’uomo non è vittima dei proprigeni ma creatore della propria esistenza.Punti chiave:− L’espressione genica può venire alterata dall’ambiente, compreso quello sociale.− Le alterazioni dell’espressione genica possono

essere trasmesse alle generazioni successive (senzavariazioni nel DNA).

L'epigenetica può aiutare a comprendere alcune patologie.

Nuovo importante campo nella ricerca medica.

Quindi, nello studio delle basi molecolari dell'epigenetica bisogna considerare non solo il genotipo comeresponsabile di un determinato fenotipo, ma anche l'ambiente e le interazioni tra esso ed i geni.

Questa considerazione ha portato al riconsiderare ciò che Lamarck aveva proposto e che a lungo era statopoco considerato rispetto alla teoria evoluzionistica di Darwin.

Darwin nella teoria della selezione naturale affermava che le mutazioni genetiche casuali sonotrasmesse alle generazioni successive e che i geni necessari per le caratteristiche più utili diventanopiù frequenti nelle generazioni successive contribuendo in misura maggiore al fenotipo.

Lamarck invece affermava che è l'ambiente a influenzare il fenotipo e che si ha una

Ereditarietà di caratteristiche che vengono acquisite sulla base di una risposta ambientale. Secondo Lamarck le giraffe avevano il collo lungo perché lo sviluppo di questo fenotipo era necessario all'alimentazione, mentre secondo Darwin si aveva una sopravvivenza solo delle giraffe con il collo lungo perché geneticamente predisposte (le altre erano evoluzionisticamente svantaggiate).

1. COME SI SPIEGANO LA GRANDE DIFFERENZA FENOTIPICA TRA GLI INDIVIDUI? E LA DIFFERENZIAZIONE CELLULARE?

Le cellule di uno stesso individuo hanno tutte lo stesso genoma ma possono portare a differenti fenotipi e differenti profili di espressione. Tutte le cellule provengono da uno stesso zigote e contengono tutte lo stesso identico DNA, ma solo il 10-20% di geni sono attivi nelle cellule differenziate. Le cellule si differenziano solo quando processi epigenetici cruciali accendono/spengono i giusti geni.

La differenziazione cellulare dipende da variazioni, che si realizzano nello sviluppo.

nell'espressione dei geni, piuttosto che da modificazioni nella sequenza dei nucleotidi. Il mantenimento stabile, attraverso mitosi, è sotto controllo epigenetico. Stimoli esterni, ambiente e fattori di trascrizione vanno a modulare l'epigenoma.

DIFFERENZA GENETICA ED EPIGENETICA

"La differenza tra la genetica e l'epigenetica può essere comparata alla differenza tra scrivere e leggere un libro. Una volta che il libro è stato scritto, il testo (il gene o il DNA) sarà lo stesso in tutte le copie distribuite ai lettori interessati. Tuttavia, ogni lettore interpreterà la storia in maniera diversa, con varie emozioni. In maniera molto simile, l'epigenetica porta differenti interpretazioni di uno stesso templato (libro o codice genetico) e risulta in differenti letture dipendenti dalle condizioni variabili sotto le quali il templato è interrogato" - Thomas Jenuwein.

La base della differenza tra genetica ed epigenetica è

Genetica:

Le mutazioni genetiche spesso alterano il significato. I nucleotidi di un gene formano un modello per una proteina. Una lettera errata o un'altra mutazione possono distorcere la proteina risultante o causarne una sovra/sotto.

Epigenetica:

Cambiamenti epigenetici alterano l'attività. I tag chimici sanno che i marcatori epigenetici si trovano sopra i geni, sia sul DNA stesso che sulle proteine istoniche attorno alle quali il DNA è avvolto. Cambiamenti in questi