Quaderno di laboratorio di Biochimica funzionale

Viana Ilaria

Matricola 20027823

Corso di laurea in Biotecnologie

QUADERNO DI LABORATORIO

INDICE

Esperienza online numero 1: enzyme assay...................................................................pag.1

Esperienza online numero 2: enzyme purification.........................................................pag.10

Esperienza online numero 3: radio-immunoassay.........................................................pag.14

Esperienza in laboratorio numero 1: spettrofotometro..................................................pag.17

Esperienza in laboratorio numero 2: cromatografia a colonna....................................pag.20

Esperienza in laboratorio numero 3: biochimica clinica...............................................pag.23

Esperienza online numero 1: calcolo concentrazione proteica.....................................pag.25

Esperienza online numero 2: diluizioni, concentrazioni e buffer..................................pag.26

ESPERIENZA ONLINE

ESPERIENZA N°1: ENZYME ASSAY

L’enzyme assay è un saggio enzimatico che analizza la cinetica di un enzima, ovvero una

proteina che funge da catalizzatore biologico. La cinetica enzimatica è definita come lo

studio della velocità e di come varia la reazione in funzione della variazione di parametri

esterni, quindi la capacità dell’enzima di legarsi ad un substrato e aumentare la velocità di

formazione del prodotto (misurabile attraverso l’analisi di un prodotto fluorescente o

radioattivo). I parametri fondamentali da valutare per conoscere il funzionamento ottimale

di un enzima sono:

pH: gli enzimi sono sensibili al pH perché esso, più ci si allontana dal range ottimale,

 più altera la forma tridimensionale dell’enzima rompendo i suoi legami ionici e a

idrogeno e lo rende quindi inefficace; la curva della velocità di una reazione catalizzata

in funzione della variazione del pH si presenta con un andamento a campana.

tempo di incubazione: è importate valutare quanto tempo lasciar agire l’enzima perché

 dopo una certa soglia (tempo ottimale) comincia ad accumularsi prodotto con

conseguente consumo di substrato e la velocità di reazione diminuisce; il grafico della

velocità si può approssimare ad una retta fino al tempo ottimale, dopo il quale la

velocità si assesta.

quantità di enzima utilizzato: il grafico è lineare fino alla quantità ottimale poi a

 quantità troppo elevate tende a cadere.

temperatura di incubazione: la temperatura è fondamentale che sia non troppo elevata

 perché l’enzima in questo caso verrebbe denaturato e quindi reso inattivo, ma è anche

necessario che non sia troppo bassa poiché l’enzima lavorerebbe molto lentamente; è

consigliabile tenere una temperatura leggermente inferiore rispetto a quella massima.

quantità di substrato utilizzato: la velocità massima si raggiunge nel momento in cui

 l’enzima è saturato dal substrato; il grafico rappresenta la curva di Michaelis-Menten

ovvero la rappresentazione della velocità di reazione in funzione della concentrazione

di substrato (ramo di iperbole).

presenza di inibitori: gli inibitori sono molecole che si legano all’enzima diminuendo la

 velocità di reazione; possono essere competitivi quando non vanno ad intaccare la

Vmax ma alzano il valore della Km, non competitivi quando diminuiscono la Vmax

senza variare la Km oppure acompetitivi se intaccano entrambi diminuendoli di uno

stesso fattore.

Questo saggio quindi permette di valutare la Km (quantità di substrato che mi fornisce la

metà della velocità massima) e la Vmax dell’enzima; dal grafico di Michaelis-Menten

possiamo ottenere la Vmax e la Km ricavando i valori della velocità e dalla concentrazione

di substrato e facendone i reciproci ottenendo così una relazione lineare. 1

L’enzima in considerazione per questa esperienza è l’enzima numero 3 tra i cinque proposti. Si

possono variare i parametri uno alla volta (generando per ogni parametro variato sempre 11

campioni):

pH

1. Il range di pH tra cui scegliere va da 1 a 14, selezionando questo intervallo vengono prodotti 11

campioni che vengono incubati a parametri fissi (tempo di incubazione 10 minuti, temperatura di

incubazione 30°C, quantità di enzima utilizzato 100 µL, quantità di substrato utilizzato 100

mmol/L per un volume totale di 1 ml, inibitori assenti). Il risultato dell’esperimento evidenzia che

a pH molto acidi (sotto 5) e a pH molto basici (sopra 9) l’enzima viene denaturato e quindi reso

inefficace, mentre tra 6 e 8 l’efficacia dell’enzima cresce fino ad un punto massimo e poi

diminuisce fino a zero. Ripetendo l’esperimento riducendo l’intervallo di pH a 6-8 notiamo che la

velocità di reazione dell’enzima è massima a 6,5. Grafico della variazione

del prodotto in funzione

del pH nell’ intervallo

1 - 14

Grafico della variazione del

prodotto in funzione del pH

nell’intervallo 5 - 9 2

2. Tempo di incubazione

Dopo aver fissato il pH ottimale a 6,5 si può variare il tempo di incubazione per capire dopo

quanto tempo la curva inizia ad assestarsi: come primo intervallo il programma fornisce un

suggerimento di 0 - 60 minuti come tempo minimo e massimo quindi stabilito questo come range

e gli altri parametri (temperatura di incubazione 30°C, quantità di enzima utilizzato 100 µL,

quantità di substrato utilizzato 100 mmol/L per un volume totale di 1 ml, inibitori assenti) si può

notare che la la curva è approssimativamente lineare fino a circa 25 minuti. Ripetendo

l’esperimento ponendo come range 10 - 30 minuti si può confermare che il tempo di incubazione

ottimale per questo enzima è 18 minuti. Grafico della variazione del

prodotto in funzione del

tempo di incubazione

nell’intervallo 0 - 60 minuti

Grafico della variazione del

prodotto in funzione del

tempo di incubazione

nell’intervallo 10 - 30

minuti 3

3. Quantità di enzima utilizzato

Dopo aver impostato il tempo di incubazione a 18 minuti, si imposta la quantità di enzima che

vogliamo introdurre nell’esperimento e come intervallo massimo viene posto 0 - 250 µL con i

parametri esterni precedentemente scelti (temperatura di incubazione 30°C, pH 6.5, quantità di

substrato utilizzato 100 mmol/L per un volume totale di 1 ml, inibitori assenti);

dall’esperimento emerge che fino a 200 µL di enzima la curva è approssimativamente lineare,

perciò restringendo ancora l’intervallo fino a 200 si può vedere dal grafico che la quantità

ottimale di enzima è circa 180 µL. Grafico della variazione

del prodotto in funzione

della quantità di enzima

nell’intervallo 0 - 250 µL

Grafico della variazione

del prodotto in funzione

della quantità di enzima

nell’intervallo 0 - 200 µL

4

4. Temperatura di incubazione

Dopo aver scelto come quantità di enzima da utilizzare 180 µL, è necessario valutare la corretta

temperatura a cui incubare perciò poste come condizioni esterne quelle precedentemente scelte

(pH 6.5, tempo di incubazione 20 minuti, quantità di substrato utilizzato 100 mmol/L per un

volume totale di 1 ml, inibitori assenti) impostiamo come range di temperatura 0 - 100 °C.

Dall’esperimento si può vedere che dopo i 50 °C l’enzima viene inattivato progressivamente;

riducendo l’intervallo a 0 - 60 °C si può vedere che la temperatura a cui l’enzima funziona

correttamente è 40 °C. Grafico della variazione

del prodotto in funzione

della temperatura

nell’intervallo 0 - 100 °C

Grafico della variazione

del prodotto in funzione

della temperatura

nell’intervallo 0 - 60 °C

5

5. Quantità di substrato utilizzato

Dopo aver scelto come temperatura di incubazione 40 °C bisogna inserire la quantità di substrato

che vogliamo introdurre nel campione; si inserisce l’intervallo 0 - 250 µL di substrato e i

parametri trovati finora (pH 6.5, tempo di incubazione 18 minuti, quantità di enzima utilizzato

180 µL per un volume totale di 1 ml, inibitori assenti). Si ricava quindi la curva di

Michaelis-Menten da cui possiamo ricavare il valore della Km e della Vmax tramite il grafico dei

reciproci (1/S e 1/V). Grafico di

Michaelis-Menten per

l’enzima numero 3

Vmax = 1/q = 1/0,0511 =

19,5694716 umol/min

Km=m/q=16,585/0,0511

= 324,559687 umol

La Km è alta perciò

l’affinità tra substrato e

enzima è bassa, ovvero

serve un’elevata quantità

di substrato per arrivare a

metà della velocità

massima. 6

6. Inibitore A

Dopo aver valutato l’attività dell’enzima si può provare a inserire un inibitore. Si inserisce

l’inibitore alle condizioni esterne trovate precedentemente (pH 6.5, tempo di incubazione 18

minuti, temperatura di incubazione 40 °C, quantità di enzima utilizzato 180 µL, per un volume

totale di 1 mL) dai grafici che vengono prodotti dal programma vediamo che a quantità di

inibitore basse (0,125 - 1 mmol/L) l’attività dell’enzima non viene modificata in modo rilevante;

aggiungendo più i