Quaderno di laboratorio di Biochimica funzionale

ESPERIENZA ONLINE N°2: ENZYME PURIFICATION

La purificazione di un enzima è un esperimento che richiede numerosi passaggi (non sempre uguali in quanto ogni enzima ha proprietà diverse) e serve a isolare un determinato enzima da altre sostanze e altri enzimi; ad esempio si potrebbe isolare il lisozima dal contenuto di un uovo.

Il programma online utilizzato suggerisce 5 passaggi (ogni volta che si effettua un cambiamento di parametri vengono generati 11 campioni) che ora verranno descritti e a ogni avvio del programma verrà usato un diverso enzima:

Frazionamento con ammonio solfato: l'enzima è solubile in acqua perciò ha una parte esterna che gli consente di legare l'acqua e stare in soluzione; se si inserisce una certa quantità di sale (solubile in acqua) più se ne inserisce più l'acqua è impegnata a sciogliere il sale e meno si lega all'enzima, si cerca quindi una concentrazione ottimale di ammonio.

separano le proteine in base alle dimensioni, le proteine piccole viaggiano lentamente perché entrano nei pori delle sferementre quelle più grandi non riescono ad entrare ed escono direttamente (quelle medie avolte escono e a volte si infilano nei pori); è quindi un metodo di separazione nondenaturante

Sds page: tramite l'uso di un denaturante forte come il beta-mercapto-etanolo-riducente oppure il sodio-dodecil-solfato si denatura la proteina la quale diventa una catenalineare con carica negativa che corre verso il polo positivo (elettroforesi) e grazie adalcuni standard si può vedere quali dimensioni ha la proteina 10

L'enzima che verrà purificato è casuale e il programma consente di variare i parametri di ognunodei 5 passaggi necessari per trovare le quantità più efficaci per la purificazione, generando per ognipassaggio 11 campioni:

1. Percentuale di ammonio solfato: si può variare questa percentuale

(iniziale e finale) da 0 a 90% (range massimo) e come risultato si trova una schermata che indica il volume iniziale di sostanza da cui estrarre l'enzima, la quantità di enzima prodotta ogni minuto per ogni ml di volume e la quantità di proteine all'interno della sostanza che stiamo purificando; con il range massimo inserito (dopo dialisi) il volume aumenta leggermente ma si vede che la quantità di proteine è pressoché la stessa con però una diminuzione della quantità di enzima quindi dobbiamo cambiare il range fino ad ottenere una maggior purezza dell'enzima calcolando il rapporto tra attività enzimatica e quantità di proteine nella fase iniziale e finale. Quindi ripetendo l'esperimento e variando il range di saturazione di ammonio solfato si cerca di migliorare la purezza dell'enzima (se si mette troppo ammonio solfato l'enzima viene ucciso). Nel caso di questo enzima il range ottimale è 50-80%.

Poiché vediamo che il volume rimane simile ma la purezza dell'enzima passa da 0,62777778 a 1,27941176 umol mg/min.

Dati ottenuti inserendo come range di ammoniosolfato 0 - 90%

Purezza1 = 113/180 = 0,62777778 umol mg/min

Purezza2 = 87/206 = 0,4223301 umol mg/min

Dati ottenuti inserendo come range di ammoniosolfato 50 - 80%

Purezza1 = 113/180 = 0,62777778 umol mg/min

Purezza2 = 87/68 = 1,27941176 umol mg/min

112. Cromatografia a scambio ionico: dato che la carica delle proteine dipende dal pH il programma chiede a quale pH si vuole lavorare e dato che solitamente lavorano bene a pH neutri, si può inserire come valore 7 ma risulta che l'enzima a quel valore non si lega alla colonna perciò si può provare a renderlo più acido (4) ma ancora non si lega quindi lo si rende più basico (9.5) e dal grafico risultante si nota che è stato utilizzato un pH che ha permesso all'enzima, tramite la sua carica di legarsi alla colonna. Dati ottenuti con pH a 9,53.

Cromatografia per affinità: con i dati ottenuti si effettua la cromatografia senza dover impostare altri dati nel programma. Si ottiene un enzima molto attivo con poche proteine contaminanti. Dati ottenuti con ammonio solfato 50 - 80% e pH 9,5 124. Gel filtrazione: il programma non chiede altri parametri da inserire per questa fase. Facendo fare la gel filtrazione come risultato si ottiene un grafico con una serie di standard (in blu) che sono proteine di cui conosciamo le dimensioni (esce prima quella con massa maggiore) e una linea rossa che indica le dimensioni dell'enzima che doveva essere purificato. Dal grafico ottenuto si capisce che l'enzima purificato è un singolo complesso proteico (una sola cresta rossa) e che la sua massa è compresa tra 75 e 100 kDa (si capisce grazie a standard in blu). SDS PAGE: il programma non richiede di inserire altri dati. Facendo l'elettroforesi si ottiene uno schema con una colonna che indica gli standard di peso.

conosciuti e una colonna con unabanda che indica l'enzima purificato. Dallo schema si nota che l'enzima è una singola catena polipeptidica e che pesa tra 25 e 50 kDa. La differenza di peso tra la gel filtrazione e l'SDSPAGE è che la gel filtrazione non è un saggio denaturante quindi le proteine sono nella loro conformazione mentre l'SDS PAGE è un saggio denaturante che rompe il legami non covalenti; tutto ciò significa che probabilmente l'enzima purificato era un dimero che si è separato dopo la rottura dei legami non covalenti al suo interno.

ESPERIENZA ONLINE N°3: RADIO-IMMUNOASSAY

La tecnica del dosaggio radioimmunologico è utilizzata per dosare qualsiasi composto immunogenico disponibile in forma pura e marcabile radioattivamente. Viene utilizzata per valutare i livelli di ormoni, di sostanze stupefacenti nel sangue e dell'insulina.

La tecnica consiste nel mettere in contatto un antigene marcato

radiattivamente e uno nonmarcato con un anticorpo specifico, aumentando la concentrazione dell'antigene nonmarcato si favorisce la competizione con l'antigene marcato per i siti di legame sull'anticorpo. Per questa esperienza il programma propone un saggio radioimmunologico dell'estradiolo, un ormone sessuale femminile prodotto dalle ovaie che può essere somministrato contro la menopausa. I passaggi che occorrono sono: 1. Screening di antisieri: in commercio si trovano diversi antisieri, per scegliere quello migliore da utilizzare si producono due campioni uno con solo il tracciante radioattivo (segnale alto) e un altro con anche estradiolo saturante (molta competizione, segnale basso). Entrambi vengono incubati e dal grafico risultante si trova la curva della percentuale di legame dei due campioni. Si deve rifare il procedimento per ogni antisiero che abbiamo e confrontare i risultati; maggiore è la differenza tra le due curve migliore sarà.

quell'antisiero per l'esperimento. La curva cala in base alla sensibilità: se si diluisce troppo si rischia di avere risultati meno accurati.

Specificità dell'antisiero: scelto l'antisiero bisogna valutare se questo distingue bene tra molecole che possono "assomigliare" a quella contro cui si voleva che l'antisiero fosse diretto; nel caso dell'estradiolo le altre molecole sono l'estrone, l'estriolo, l'etanilestradiolo e l'equolo. Per valutare ciò si testa l'antisiero in presenza di tutte queste sostanze e dal grafico risultante si nota se la curva dell'estradiolo è nettamente diversa dalle altre curve in presenza delle altre sostanze oppure se sono tutte simili; più si differenziano migliore è l'antisiero per l'esperimento.

Sensibilità dell'antisiero: due fattori importanti da valutare per l'esperimento sono la concentrazione dei

di legame del ligando e l'affinità dell'antisiero per il ligando; due valori vengono calcolati e linearizzati in un grafico per valutare la sensibilità dell'antisiero (retta di taratura). dell'estradiolo: usando la retta di taratura e sapendo quanto è il segnale si può calcolare la quantità di estradiolo. <141.>Screening di antisieri: il programma chiede di scegliere a piacimento un antisiero, scelto l'antisiero 8 viene sviluppato un grafico dal quale si nota che esso ha un'ottima risposta fino a 1:800 di diluizione. <2.>Specificità dell'antisiero: scelto l'antisiero 8 e la diluizione a 1:800 si procede con il verificare la risposta all'estradiolo e alle altre sostanze che gli "assomigliano" e si nota che risponde bene all'estradiolo, quasi per nulla all'estrione, all'estriolo e all'etanilestradiolo, mentre risponde leggermente all'equolo.ma in minima parte quindi può essere accettato. 153. Sensibilità dell'antisiero: dopo aver riselezionato antisiero e diluizione il programma produce un diagramma di Scatchard ovvero un grafico con riportata in ascisse la concentrazione del ligando legato e in ordinate il rapporto tra le concentrazioni del ligando legato e non legato; il grafico dovrebbe essere il più lineare possibile, in questo caso alcuni dati trovati si discostano leggermente. In questo passaggio viene prodotta anche una curva di taratura con la quantità in moli di estradiolo in misure standard e la percentuale di legami creati. 4. Saggio dell'estradiolo: a questo punto si può inserire il volume di ogni campione che si vuole produrre per misurare la quantità di estradiolo nel campione, in questo caso si è scelto 1 mL e si ottiene una tabella con le radioattività dei campioni prodotti; questi dati ottenuti possono poi essere confrontati con la curva di.taratura standard che è stata ottenuta p