Principi di Virologia

VANTAGGI DEL SISTEMA VACCINIA VIRUS:

L’antigene viene autenticamente espresso in cellule di mammifero;

 Una quantità di antigene viene amplificato durante la replicazione del

 virus vivo;

Una singola somministrazione provvede all’immunità;

 Elimina la necessità di purificare la proteina nello stato nativo;

 Il ciclo vitale del poxvirus consente la sintesi di antigeni vaccinali nel

 citosol e appare particolarmente adatto per la presentazione efficiente

delle molecole MHC-I (geni appartenenti al complesso maggiore di

istocompatibilità che codificano per un’importante categoria di proteine di

espressione quasi ubiquitaria nell’organismo) come prerequisiti nella

risposta CD8 (sistema di recettori tramite i quali i linfociti T riescono a

riconoscere il peptide antigenico, presente in un complesso con le proteine

dell’MHC.

SVANTAGGI DEL SISTEMA VACCINIA VIRUS:

L’ospite è immunizzato contro il vettore virale bene come per l’antigene

 vaccinico (immunità anti- vettore);

Seria infezione virale in individui immunocompromessi (AIDS o individui

 trapiantati);

Bassa frequenza di complicazione nell’uomo.



LO SVILUPPO DI VACCINIA VIRUS MODIFICATI, GLI ANKARA (MVA): è un vaccino

molto attenuato di un poxvirus che è stato sviluppato come vaccino salvifico

contro la campagna di eradicazione del vaiolo. L’MVA contiene multiple delezioni

genetiche le quali bloccano la replicazione negli stadi tardivi in molti tipi di

cellule eccetto le cellule CEF e BHK12. Negli umani questo vaccino rende

difettosa la replicazione. Tuttavia, l’espressione di proteine virali ricombinanti si

verifica in qualsiasi linea cellulare infettabile dal vaccinia virus.

Vettori degli adenovirus.

Hanno una capacità di inserzione di 2- 35 Kb e sono anch’essi vettori transienti,

che non si integrano in modo permanente. Infettano cellule in attiva replicazione

ma soprattutto in quiescenza.

Gli Adenovirus sono virus icosaedrici a doppia elica di DNA di dimensioni di 36

Kb. Il genoma è fiancheggiato da sequenze ITR (inverted terminal repeat)

che servono come origine di replicazione. Oltre a queste sequenze terminali

troviamo i rispettivi geni che trascrivono:

E1A coinvolto nell’attivazione della trascrizione e della promozione

 dell’entrata della cellula ospite nella fase S (induce il rilascio del fattore di

trascrizione E2F);

E1B blocca l’azione della p53 (proteina tumorale, fattore di trascrizione

 che regola il ciclo cellulare), evitando l’entrata della cellula in apoptosi;

E2 codifica per tre proteine coinvolte nella replicazione del DNA e nella

 modulazione della trascrizione;

E3 modula la risposta immunitaria;

 E4 regola la trascrizione, la transizione dell’espressione da early a late, la

 replicazione virale e l’assemblamento dei virioni;

L1-L5 coinvolti nella produzione e nell’assemblaggio delle proteine del

 capside.

In colture di cellule umane può andare incontro a completa replicazione infettiva

(infezione produttiva, non patogenica), in cellule di roditore possono andare

incontro a trasformazione maligna o forme oncogene. Nell’uomo è in grado di

andare in latenza nelle tonsille o comunque nei linfonodi. Gli aspetti positivi degli

Adenovirus sono il fatto che causa infezioni respiratorie benigne e non vi è

associazione con patologie oncogene, ha una buona caratterizzazione ed è facile

da manipolare (i vettori ottenuti sono molto stabili). È un virus che ha la capacità

di infettare un grande range di linee cellulari diverse, incluse cellule in divisione

e non in divisione. Ha un alto livello di espressione ed un’alta capacità di

inserzione. Infine, c’è poco rischio di integrazioni cromosomiche casuali.

SVILUPPO DI VETTORI ADENOVIRALI: per prima cosa si creano i vettori adenovirali

helper- dipendenti o di prima generazione sostituendo i geni E1A, E1B ed

E3 con il transgene di interesse, fino ad un massimo di inserzione di 6,5 Kb; si

ottiene un vettore contenente il transgene, i promotori appropriati e gli elementi

enhancer. L’espressione non dura più di 5- 10 giorni, poi si ha una risposta

immunitaria. Il vettore così ottenuto è replicazione- difettivo e le funzioni

replicative vengono fornite in trans da un virus helper (privato della sequenza

E1). Questo vettore viene

amplificato utilizzando le linee

cellulari d’espressione di E1 (ad

esempio cellule 293A che

presentano una copia del gene

E1 integrata stabilmente). I

vettori possono infettare cellule

in vitro ed in vivo. Quindi per la

prima generazione il gene

estraneo di interesse clonato

viene inserito all’interno di un

vettore di trasfezione; il vettore

viene purificato ed amplificato

e viene effettuata co- trasfezione del vettore ricombinante e dell’adenovirus in

cellule della linea 293°; si selezionano le placche che danno segno di virus

ricombinanti (si procede con PCR, immunoblotting, immunostaining), si

amplificano le placche ed infine si prepara uno stock di virus ricombinanti cui si

infetteranno altre cellule per ottenere l’espressione ad alti livelli della proteina

ricombinante.

Successivamente i vettori di seconda generazione vengono prodotti sostituendo i

geni E1, E2, E3 ed E4 con il gene di interesse.

La sperimentazione ha portato alla costruzione di vettori virali vuoti o ad alta

capacità o gutless, basati sul fatto che tutte le proteine virali possono essere

“aiutate” in trans, queste sequenze che codificano quindi possono essere

eliminate per far più spazio al transgene di interesse. Gli unici elementi in cis

essenziali per la propagazione e l’impacchettamento virale sono le sequenze ITR

e le sequenze segnale psi. Il promotore ed il transgene di interesse del nostro

vettore navetta vengono inseriti all’interno del genoma virale plasmidico

(sprovvisto della sequenza segnale psi) tra la sequenza ITR iniziale ed i geni

successivi ed il genoma subisce una ricombinazione in cellule della linea 293°. Il

genoma ricombinante ottenuto subisce un taglio mediato da Cre (Cre

ricombinasi, enzima in grado di coordinare una ricombinazione genetica), che

riesce a riconoscere il sito Lox (il taglio viene effettuato tra un sito Lox e l’altro).

La replicazione dei vettori gutless avviene in presenza di un costrutto helper. I

vantaggi di questi vettori è che riducono l’immunità durando di più (possono

infettare differente linee cellulari in vitro ed in vivo e l’espressione può andare

avanti fino a 80 giorni) ed aumentano la capacità di espressione.

Vettori degli alphavirus

Hanno capacità di inserzione di circa 5 Kb; sono anch’essi vettori transienti.

Infettano cellule in divisione o quiescenti, hanno un’espressione a lungo termine

però necessitano di complementazione con virus helper. Sono sicuri e hanno una

ridotta immunogenicità (non inducono immunità cellulo mediata) ma sono

citotossici.

STRUTTURA DEGLI ALPHAVIRUS: sono virus rivestiti, dotati di pericapside e di

spicole proteiche di rivestimento; hanno un nucleocapside icosaedrico al cui

genoma all’interno è a singolo filamento di RNA ed ha una grandezza all’incirca

maggiore di 12 Kb. Gli Alphavirus (così come i Flavivirus) fanno parte degli

Arbovirus che possono infettare l’uomo usando come vettori altri organismi: gli

Alphavirus usano volatili o roditori come ospite naturale (ospite serbatoio) e

come vettori le zanzare mentre i Flavivirus possono usare come ospite naturale,

oltre a quelli sopra citati anche i primati od ovini, i vettori sono sempre le

zanzare a parte che nel caso in cui l’ospite serbatoio sia un roditore od un ovino

in cui il vettore è un altro tipo di insetto (Ixodes, zecche). Le malattie causate

sono quasi sempre forme di encefaliti o la febbre Dengue per i primati (Semliki

forest virus SFV).

Per quanto riguarda il genoma abbiamo detto essere a singolo filamento di RNA a

polarità positiva, quindi nella replicazione all’interno di una cellula ospite è

necessario che venga trascritto un filamento di RNA a polarità negativa (l’unico

filamento presentante un promotore per l’RNA polimerasi virale da cui avrà inizio

la sintesi proteica) così da avere una molecola di RNA subgenomico a polarità

positiva. Il filamento di RNA iniziale porta all’estremità 5’ un cappuccio di 7 metil-

guanosina e all’estremità 3’ una coda poliadenilata. Dopo la penetrazione nella

cellula infetta, l’RNA virale scapsidato funziona come RNA messaggero, dirigendo

la sintesi delle proteine virali precoci. Viene sintetizzato dapprima un singolo

lungo polipeptide che successivamente viene tagliato in frammenti per formare

un certo numero di proteine più piccole (questa frammentazione è operata dalla

p2 che induce proteolisi). Si ha prima la traduzione dell’estremità 5’, che codifica

per proteine funzionali; dopo la replicazione del genoma vengono prodotti RNA

messaggeri subgenomici che produrranno le proteine strutturali corrispondenti

all’estremità 3’.

Il ciclo replicativo degli Alphavirus è un ciclo naturalmente difettivo in alcune

situazioni, richiede quindi la complementazione da parte di un virus helper.

VANTAGGI DEI VETTORI DEGLI ALPHAVIRUS:

Abilità nell’infettare un ampio range di tipi cellulari;

 Alto tasso di sintesi di RNA;

 Alto tasso di traduzione di RNA subgenomico:

 Alti livelli di espressione (superiore al 50% del totale di proteine cellulari);

 Replicazione citoplasmatica che non comporta un processamento

 nucleare;

L’espressione non è persistente ma stabile;

 Produzione rapida di proteine ricombinanti ad alto titolo;

 Possono indurre l’apoptosi cellulare (importante per le terapie tumorali).



SVILUPPO DI VETTORI DI ALPHAVIRUS: in generale il vettore di espressione SFV

con il nostro gene di interesse viene inserito, con il vettore helper di SFV, in un

vetrino dove avviene la trascrizione; il filamento di RNA, portante il segnale di

impacchettamento ed il gene di interesse, ed il filamento di RNA del virus helper

insieme vengono sottoposti ad elettroporazione in cellule BHK-21 (consiste

nell’aprire dei pori, tramite impulsi elettrici, nella membrana cellulare per

introdurre in un monostrato di cellule renali di criceto il gene ricombinante) e si

ottengono così le particelle virali di SFV ricombinante, con le quali si infettano le

cellule di un ospite e si ha così l’espressione delle proteine ricombinanti. La

prima generazione così ottenuta (eliminando la sequenza REP) è replicazione

difettiva.

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