Principi di Virologia

Virologia

Introduzione generale sui virus

La microbiologia è una branca della biologia che si occupa dello studio dei microrganismi, organismi microscopici normalmente unicellulari che talvolta possono formare aggregati pluricellulari nei quali però tutte le cellule sono equivalenti, non si ha cioè la formazione di tessuti specializzati (parliamo di batteri, protozoi e miceti microscopici). La microbiologia comprende anche la virologia la quale si occupa dello studio dei virus, organizzazioni biologiche molto piccole e molto semplici capaci di esprimere il proprio potenziale biosintetico solo se inseriti nei circuiti metabolici di una cellula.

Noi siamo circondati dai virus, essi infettano tutto il materiale vivente, li inaliamo respirando regolarmente, li mangiamo ecc… quindi abbiamo incorporato una componente genomica virale come parte del nostro materiale genetico, tanto che si parla di viroma umano. I virus sono per la maggior parte innocui perché si sono evoluti con noi ed interagiscono continuamente con le nostre cellule (tranne in quelle zone chiamate santuario in cui i virus in condizioni di buona salute non ci dovrebbero essere come la cornea o il liquido cefalorachidiano).

Un virus è un parassita intracellulare obbligato che necessita di una cellula ospite per riprodursi e replicarsi, infatti solo sfruttando i meccanismi biosintetici all’interno della cellula riesce a duplicare il suo genoma e produrre le proteine virali; sono in grado di infettare qualsiasi essere vivente sia animale, pianta o battere. I virus sono estremamente semplici e sono costituiti da poche componenti: una o due proteine ripetute che costituiscono l’involucro protettivo, detto capside, e al suo interno il genoma costituito solo da una molecola (DNA nel caso dei deossiribovirus o RNA per i ribovirus,). Contengono una proteina, che prende il nome di antirecettore, legante il recettore per aderire alle cellule infettabili.

Hanno dimensioni piuttosto ridotte che vanno dai 20 ai 400 nm (anche se di recente sono stati scoperti i mimivirus, virus “giganti” in grado di infettare le amebe con una dimensione di 700 nm di diametro ed un genoma di 1,2 Mb). Le dimensioni estremamente ridotte non permettono la visione della particella virale al microscopio ottico (con cui possiamo osservare solo la cellula infetta) ma serve un microscopio elettronico. Hanno una forma variabile non solo a bastoncello o a cocco come i batteri (es. il virus della foglia del tabacco ha una forma a bastoncino, il poxvirus ha una forma a mattoncino, l’HIV è sferico, il virus della stomatite vescicolare è definito “a proiettile”, i batteriofagi hanno una struttura combinata, il virus dell’ebola è filamentoso).

Il motivo per cui un virus necessita di una cellula ospite è dovuto al fatto che manca dell’informazione genetica che codifica l’apparato necessario per la generazione di energia metabolica (ATPasi) o per la sintesi di proteine (ribosomi). Il virus boicotta l’apparato metabolico della cellula bloccando la sintesi proteica e la replicazione del genoma cellulare ed indirizzandolo verso la produzione delle componenti virali. Le particelle virali vengono prodotte dall’assemblaggio di componenti preformate; i virus non crescono e non si dividono ma sono i singoli componenti che si toccano e si autoassemblano perché di una conformazione energetica più stabile, questo è anche il motivo per cui tutti i virus appartenenti a una determinata famiglia presentano la stessa forma.

Le differenze tra batteri e virus

Caratteristiche generali

Si pensa che i virus siano organismi con due fasi ben distinte:

• Una fase extracellulare: il virus è ben assemblato all’esterno di una cellula ospite (si parla di virione);
• Una fase intracellulare: il virus ha infettano una cellula e una volta al suo interno si disassembla per l’espressione genica delle proteine che ne costituiscono l’involucro.

Un virus per poter sopravvivere deve essere in grado di:

• Stabilirsi e replicarsi nella cellula ospite;
• Impacchettare il suo genoma all’interno di una particella che possa mediare la trasmissione del genoma virale da cellula a cellula;
• Essere in grado di infettare una cellula; il genoma virale contiene le informazioni necessarie per iniziare e completare un ciclo infettivo

Quando i virus sono in grado di svolgere queste tre funzioni normalmente sono poco pericolosi; ad esempio per alcuni genotipi di papilloma virus 15-16, nel 99% dei casi di tumore alla cervice uterina, i virus non sono in grado di svolgere queste tre funzioni, l’infezione non si autorisolve, il genoma virale si integra nel genoma della cellula ospite e si ha carcinogenesi con espressione di proteine oncogene.

I virus hanno un’origine molto antica, in qualche modo sono sempre stati presenti fin dall’inizio della formazione della Terra. Nessuno era a conoscenza della loro presenza ma le malattie virali vi erano già. Un primo passo verso quella che sarebbe poi diventata la virologia si ebbe con lo sviluppo del primo vaccino avvenuto nel 1796 grazie ad Edward Jenner con un esperimento che oggi considereremo poco etico. Egli aveva notato che il vaiolo bovino, che veniva preso soprattutto dalle mungitrici, era più lieve del vaiolo umano ed inoltre immunizzava contro quest’ultimo. Jenner allora iniettò il liquido contenuto all’interno di vescicole di una vacca infetta in un bambino di otto anni e osservò appunto che il bambino non veniva infettato da vaiolo.

Le malattie virali hanno giocato un ruolo maggioritario nella storia dell’uomo: negli ultimi mille anni il virus del vaiolo e del morbillo, portati nel Nord e Sud America grazie ai conquistatori/ esploratori europei, hanno molto probabilmente eliminato le popolazioni indigene che non presentavano una parziale immunità contro queste infezioni; negli ultimi 100 anni c’è stata l’influenza spagnola che ha portato alla morte di migliaia di persone; mentre al momento il problema virologico più “importante” è sicuramente l’HIV (un virus a RNA che si modifica continuamente e si trasmette per contatto con fluidi corporei), ancora oggi ci sono all’incirca 40 milioni di persone sieropositive; negli ultimi 10 anni ci sono state epidemie virali più contenute come l’ebola (virus che porta ad emorragie interne) o l’hantavirus (virus prevalentemente dei pipistrelli). Al giorno d’oggi viene costantemente tenuto sotto controllo il virus in quanto ha un’elevata capacità di modificarsi.

L’influenza è un virus a RNA con genoma costituita da otto frammenti, dotato di envelope e caratterizzato dalla presenza di due glicoproteine di superficie, la neuroaminidasi e l’emoagglutinina che permettono l’adesione del virus alla superficie cellulare. Per via della natura segmentata del genoma e del fatto che l’RNA non ha attività di pro-freading cioè non è in grado di correggere eventuali errori il virus si modifica continuamente e a variare sono per l’appunto le glicoproteine di superficie. L’influenza può avere due tipi di variabilità genetica:

• Esiste un tipo di influenza che causa epidemie; si tratta di un virus con una capacità di variare limitata (si parla di antigen drift) in quanto i mutanti emergono per errori della RNA polimerasi durante la replicazione;
• L’influenza che causa pandemie con una variabilità molto maggiore dovuta ad una ricombinazione genetica che avviene per riassortimento tra RNA di diversi ceppi influenzali (si parla di antigen shift); sono virus particolarmente pericolosi che possono diventare più aggressivi o resistenti.

I virus sono stati scoperti nel 1892 da Dimitri Iwanowski, un botanico russo, il quale aveva capito che vi erano delle patologie legate a un qualcosa di non batterico (in Russia vi erano stati dei grossi problemi con le piantagioni di tabacco in cui le foglie cominciavano ad ingiallire prematuramente). Egli scoprì che facendo entrare a contatto una foglia sana con il fluido proveniente da una foglia “malata” anche quella sana ingialliva. Nel 1898 Beijerinick confermò ed estese questi risultati sul virus del mosaico del tabacco e definì questo liquido un “fluido vivo e contagioso” e lo considerò un veleno (virus in latino significa proprio questo). La virologia vera e propria si è sviluppata solo nel 1950.

Origine dei virus

• Teoria regressiva: i virus sono una forma degenerata di parassiti intracellulari;
• Teoria progressiva: i virus derivano da normali componenti degli acidi nucleici cellulari che hanno ottenuto la capacità di replicarsi autonomamente e quindi evolvere. I virus a DNA derivano dai plasmidi o da elementi trasponibili, i virus a RNA da mRNA e i retrovirus da retrosposoni;
• Teoria coevolutiva: i virus si sono coevoluti con la vita.

Composizione chimica dei virus

A differenza di quanto avviene nelle cellule eucariotiche e procariotiche in cui il depositario dell’informazione genetica è sempre il DNA, nei virus il genoma è costituito da DNA o da RNA. L’acido nucleico codifica per tutte le informazioni replicative del virus; Presentano un involucro proteico, costituito da proteine virali strutturali codificate dal genoma virale, che prende il nome di capside. Il genoma virale ed il capside formano un nucleocapside o virus nudo; Vi sono virus che oltre al capside possiedono un involucro lipoproteico (costituito da fosfolipidi) esterno al nucleocapside chiamato pericapside o peplos o envelope (si parla di virus rivestito).

Il capside

Si tratta di un rivestimento fatto solo di proteine con una struttura regolare costituito da unità ripetitive. Le proteine del capside vengono chiamate capsomeri, ciascuno dei quali è formato da subunità strutturali proteiche chiamate protomeri tenute insieme da legami non covalenti. Il capside ha diverse funzioni: protezione del genoma, riconoscimento dei recettori a livello cellulare e serve per veicolare il genoma verso il nucleo della cellula. Vi sono due simmetrie per il capside:

• Elicoidale: come il TMV (virus della pianta del tabacco), rhabdovirus, ebola, stomatite vescicolare. Si trova soprattutto in quei virus che come genoma hanno RNA; i protomeri sono disposti in modo da formare un’elica in cui il genoma è disposto all’interno di solchi formati dalle proteine stesse. Le subunità proteiche si dispongono lungo l’asse dell’acido nucleico formando una struttura tubulare;
• Icosaedrica: come l’adeno-, l’herpes-, il papilloma-, il reo-, il picornavirus, il CMV ed il retrovirus. Si tratta di una struttura chiusa a forma di icosaedro, un poliedro a 20 facce e 12 vertici in cui le subunità si dispongono formando strutture solide regolari in cui i pentoni (capsomeri pentagonali) sono disposti ai vertici, circondati da cinque esoni (capsomeri esagonali).

Esistono dei virus aventi una forma combinata: sono i batteriofagi (T4 in particolari), virus in grado di infettare specificatamente cellule batteriche. Essi sono costituiti da una testa icosaedrica contenente l’acido nucleico e le proteine virali e da una coda elicoidale terminante con dei prolungamenti, detti fibre caudali, che servono per l’ancoraggio del fago alla superficie della cellula ospite. I fagi sono importanti perché permettono scambi genetici tra batteri tramite la trasduzione. Nella trasduzione generalizzata qualunque frammento di DNA derivante dal genoma dell’ospite può diventare la componente di DNA di una particella del virus maturo al posto del genoma del virus. Gli enzimi responsabili dell’impacchettamento del genoma virale talvolta introducono accidentalmente DNA dell’ospite. La particella risultante viene chiamata trasducente ed è difettiva.

Il capside protegge il genoma da:

• Danno chimico: dalle radiazioni ultraviolette che possono indurre delle modificazioni chimiche causando mutazioni;
• Danno fisico: da forze meccaniche;
• Danno enzimatico: dalle nucleasi derivanti dalla morte delle cellule infettate oppure deliberatamente secrete come difesa contro un’infezione.

Funzioni del capside

• Interazione con la cellula ospite: le proteine del capside dei virus nudi mediano l’attacco e l’ingresso del virus nella cellula ospite;
• Assemblamento del genoma virale;
• Stimola il sistema immunitario dell’ospite: le proteine del capside dei virus nudi sono spesso i maggiori antigeni virali.

Il capside virale è in grado di autoassemblarsi quando i vari componenti vengono a contatto all’interno del citoplasma. Questo è stato scoperto con il virus del tabacco grazie all’esperimento di Fraenkel-Conrat & Williams.

Il pericapside

È un guscio lipidico che deriva da membrane cellulari (membrana nucleare o citoplasmatica). Riveste il capside e contiene le glicoproteine virali che mediano l’ingresso e l’uscita del virus nella cellula e l’induzione della risposta immune. Quando il virus si trova all’interno della cellula ospite il genoma virale codifica per glicoproteine che si inseriscono nella membrana cellulare ed il virus, quando lascia la cellula per gemmazione porta con sé sia una parte del doppio strato lipidico che le spicole glicoproteiche (senza queste non avverrebbe nessun tipo di infezione perché mediano il contatto tra virus e superficie cellulare) inserite nella membrana cellulare. I virus rivestiti sono più fragili, resistono molto meno nell’ambiente esterno, sono sensibile all’essicamento, al calore e all’azione di detergenti e acidi questo perché il doppio foglietto lipidico è molto più labile rispetto allo strato proteico dei virus nudi.

Funzioni delle proteine del pericapside

• Attacco, fusione ed ingresso nella cellula ospite;
• Attività enzimatica;
• Sono i maggiori antigeni;
• Proteine canale per il trasporto di ioni.

Il genoma virale

All’interno del capside troviamo il genoma virale strettamente impacchettato. Si possono avere genomi di dimensioni molto diverse da pochi nucleotidi a 300 miliardi di basi. Il genoma può essere o DNA o RNA, singola o doppia elica, lineare o circolare, unico o frammentato. Ci sono poi dei virus che possono utilizzare un intermedio per produrre le loro proteine: virus a RNA (retrovirus come l’HIV) e virus a DNA (Hepadnavirus, virus dell’epatite B). La capacità di codificare le proteine è molto varia da poche proteine fino a più di 200. Quello che bisogna ricordare è che i virus hanno genomi altamente compressi che però contengono tutte le informazioni replicative necessarie alla particella virale per infettare le cellule.

Ogni virus è poi costituito da proteine non strutturali che lo aiutano nella replicazione ma non sono incorporate nel virione:

• Enzimi necessari per la sintesi del DNA e per la replicazione;
• Proteine che influenzano la fisiologia della cellula;
• Proteine che sopprimono le difese della cellula ospite.

Cenni sulla replicazione virale

I virus non si replicano per divisione ma per assemblaggio delle componenti virali preformate. La replicazione avviene all’interno della cellula ospite dove il virus sfrutta l’apparato biochimico dell’ospite per replicarsi. La replicazione virale consta di cinque fasi (che avvengono quasi simultaneamente):

1. Adsorbimento alla superficie della cellula ospite tramite l’interazione tra antirecettore e recettore;
2. Penetrazione all’interno della cellula (per endocitosi o fusione);
3. Scapsidazione cioè perdita del rivestimento esterno usato dal virus per entrare nella cellula;
4. Sintesi di mRNA precoci, di proteine non strutturali (geni per enzimi e proteine leganti acidi nucleici), genoma ed infine proteine strutturali del capside;
5. Maturazione e liberazione dei virioni.

Affinché tutto questo avvenga è necessario che le cellule infettate siano sensibili e permissive.

La classificazione virale

Esistono diversi metodi per classificare i virus: in base alla loro struttura (dimensioni, morfologia e tipo di acido nucleico), alle loro caratteristiche biochimiche (struttura e tipo di replicazione), per il tipo di trasmissione, per la tipologia di malattia che danno, a seconda della cellula ospite o del tessuto/organo bersaglio. La classificazione di Baltimore è quella più utilizzata e si basa sulla tipologia di replicazione del virus quindi la tipologia di genoma e la modalità con cui questo viene replicato. Le classi sono sette:

• I: virus a DNA a doppio filamento (es. Adenovirus, Herpesvirus, Poxvirus);
• II: virus a DNA a singolo filamento sempre a strand positivo (es. Parvovirus);
• III: virus a RNA a doppio filamento (es. Reovirus);
• IV: virus a RNA a singolo filamento a polarità positiva (es. Picornavirus, Togavirus);
• V: virus a RNA a singolo filamento a polarità negativa (es. Orthomyxovirus, Rhabdovirus);
• VI: virus a RNA a singolo filamento che necessitano della trascrittasi inversa per retrotrascrivere un intermedio a DNA (es. Retrovirus);
• VII: virus a DNA a doppio filamento che necessitano di trascrittasi inversa per retrotrascrivere un intermedio a RNA (es. Hepadnavirus).

Qualunque sia il loro genoma o modalità di replicazione i virus devono trascrivere un mRNA leggibile dai ribosomi della cellula. Ovviamente virus diversi hanno elaborato strategie diverse per inibire la replicazione del DNA cellulare e bloccare la sintesi proteica cellulare, in modo da convogliare gli apparati di trascrizione e traduzione per l’espressione dei geni virali.

Oltre ai virus, la virologia si occupa di altri microrganismi che potrebbero essere associati ai virus e di cui si sa molto poco:

Viroidi