Principi di biochimica delle macromolecole e metabolismo

Amminoacidi e legame peptidico

Le proteine sono gli agenti indispensabili alle funzioni biologiche e gli amminoacidi sono i mattoni che costituiscono le proteine. La diversità tra le varie proteine dipende esclusivamente dalle proprietà intrinseche dei 20 amminoacidi costituenti le proteine. Queste proprietà includono:

• La capacità di polimerizzare
• Proprietà acido base
• Variabilità strutturale
• Chiralità

Quali sono le strutture e le proprietà degli amminoacidi?

Gli amminoacidi, tipicamente, contengono un atomo centrale di carbonio tetraedrico che prende il nome di carbonio alfa, legato covalentemente sia al gruppo amminico che a quello carbossilico. Per questo motivo, gli amminoacidi proteici sono tutti alfa-amminoacidi. Legati al carbonio alfa, inoltre, vi sono un idrogeno e una catena laterale variabile, responsabile delle proprietà dell'amminoacido. La catena laterale prende il nome di catena R, o gruppo R.

In una soluzione neutra, a pH 7, il gruppo carbossilico di un amminoacido esiste come -COO^- ed il gruppo amminico come -NH₃⁺. L'amminoacido risultante contiene una carica positiva ed una negativa e prenderà il nome di zwitterione.

Gli amminoacidi presentano, inoltre, un'ulteriore proprietà: sono composti chirali, con quattro gruppi differenti legati al carbonio alfa, che risulterà conseguentemente un carbonio asimmetrico. Le due possibili configurazioni per il carbonio alfa costituiscono due enantiomeri, ovvero due isomeri speculari non identici. Ciò implica, per gli amminoacidi, la possibile esistenza di due forme stereoisomeriche: L (levo) e D (destro). Gli amminoacidi proteici appartengono tutti alla serie sterica L, chiamata anche serie naturale.

Gli amminoacidi possono legarsi tramite legami peptidici

La caratteristica essenziale degli amminoacidi, che permette la formazione dei peptidi e delle proteine, è l'esistenza di due diversi gruppi chimici, chiamati gruppi funzionali: -NH₃⁺ e -COO^-. Questi due gruppi possono reagire, testa coda, eliminando una molecola di acqua e formando un legame covalente ammidico, che nel caso delle proteine prenderà il nome di legame peptidico. Il ripetersi di tale reazione produce polipeptidi e proteine. Quando gli amminoacidi prendono parte alla formazione di una proteina, si perde una molecola di acqua e il gruppo carbossilico di un amminoacido reagirà con il gruppo amminico di quello successivo, formando un legame covalente chiamato legame ammidico o peptidico, che presenta una particolarità: essere stabilizzato per risonanza.

Gli amminoacidi comuni sono venti

Tutti gli amminoacidi comuni, ad eccezione della prolina, presentano un gruppo alfa-amminico e un gruppo alfa-carbossilico liberi. La classificazione più utile degli amminoacidi è basata sulla polarità della catena laterale, permettendo di classificare gli amminoacidi come:

• Amminoacidi non polari o idrofobici
• Amminoacidi polari neutri
• Amminoacidi acidi
• Amminoacidi basici

Una classificazione alternativa è quella basata sulle proprietà chimiche del gruppo R:

• Alifatica
• Ossidrilica
• Ecc.

Amminoacidi proteici postsintetici

A sintesi completata, nella fase postsintetica, in alcune proteine, i residui di amminoacidi possono essere modificati, generando nella proteina nuovi amminoacidi chiamati postsintetici o derivati. Ad esempio, la idrossiprolina e la idrossilisina che derivano per idrossilazione di residui di prolina e lisina; così come la trimetillisina che si forma per metilazione di residui di lisina. Quando gli amminoacidi sono inseriti nelle proteine, vengono considerati come residui amminoacidici e sono proprio questi a poter subire modificazione che vengono classificate in:

• Co-traduzionali
• Post-traduzionali

Quando si parla di modificazioni Co-Traduzionali ci si riferisce a modificazioni che gli amminoacidi subiscono prima di sintetizzare le proteine. Quando si parla di modificazioni post-traduzionali, come si può dedurre dal nome stesso, le modificazioni avvengono quando la proteina è già stata sintetizzata. Le modificazioni che gli amminoacidi subiscono possono essere più o meno evidenti: molti amminoacidi possono subire reazioni di idrossilazione sulla catena laterale, come ad esempio il collagene; il glutammato può essere ulteriormente carbossilato; alla lisina può essere attaccato un ulteriore gruppo metilico; altri amminoacidi possono essere fosforilati sui gruppi ossidrilici.

Amminoacidi non proteici

Allo stadio libero, esistono in natura alcuni amminoacidi che non si riscontrano mai nelle proteine. Vengono denominati amminoacidi non proteici. Ad esempio:

• Ornitina → intermedio del ciclo dell'urea
• Citrullina → intermedio del ciclo dell'urea
• Omocisteina → omologo della cisteina da cui deriva la metionina
• Acido gamma-amminobutirrico (GABA) → presente nel sistema nervoso
• Beta-alanina → componente dell'acido pantotenico

Gli amminoacidi non sono solamente i costituenti delle proteine ma hanno un ruolo molto più ampio: molti neurotrasmettitori derivano da amminoacidi, come ad esempio noradrenalina, adrenalina, GABA, citrullina; questi neurotrasmettitori derivanti da amminoacidi hanno un ruolo metabolico molto importante e non sono costituenti delle proteine. Esistono casi in cui 2 amminoacidi, condensati tra loro, vengano considerati come un solo amminoacido: è il caso della cistina che viene a formarsi attraverso l'ossidazione di un ponte disolfuro creatosi quando il gruppo sulfidrilico della cisteina reagisce con un'altra cisteina.

Proprietà elettriche degli amminoacidi

Essendo anfoliti, ovvero che danno dissociazione elettrochimica in quanto dotati di un gruppo acido e di un gruppo basico, gli amminoacidi allo stato libero possono associare o dissociare protoni, a seconda del pH della soluzione. A pH basso, quindi in una soluzione ricca di protoni, gli amminoacidi sono protonati (cationi); a pH elevato, in soluzione povera di protoni, gli amminoacidi sono deprotonati (anioni). Quindi gli amminoacidi sono acidi deboli poliprotici che in una soluzione hanno un comportamento che condiziona il loro stato di carica in relazione al pH. Il pH, in corrispondenza del quale l'amminoacido si trova in forma dipolare, come anfoione, ovvero con il gruppo amminico protonato e il gruppo carbossilico deprotonato, viene definito punto isoelettrico, indicato con la sigla pI. L'amminoacido, nel suo punto isoelettrico, possedendo una carica positiva ed una negativa, risulterà ovviamente neutro, prendendo il nome di zwitterione.

Titolando un amminoacido come l'alanina, con una base o con un acido si ottiene una curva di titolazione in cui il pH non si modificherà linearmente, ma secondo due bracci di curva simmetrici a doppio flesso. I punti di mezzo di questi, corrispondenti ai due pK, rappresentano i valori di pH in corrispondenza dei quali le due specie ioniche in equilibrio sono equimolecolari. Gli amminoacidi sono considerati poliprotici perché presentano due valori di pKa e tutti presentano una curva di titolazione abbastanza simile. Un valore di pKa corrisponde al valore di pH al quale si troveranno in equilibrio la specie carica positivamente e quella zwitterionica; l'altro valore di pKa corrisponde all'equilibrio tra la specie carica negativamente e quella zwitterionica.

Quando due amminoacidi sono legati tra loro nelle catene polipeptidiche, i gruppi amminici e carbossilici sono impegnati nei legami ammidici quindi i gruppi ionizzabili, sono quelli eventualmente presenti nelle catene laterali R. In quel caso i valori di pKa saranno 3 e non più due e di conseguenza cambierà anche la curva di titolazione, in cui saranno indicati 3 valori di pH e non 2. Per questo motivo, i pK dei vari gruppi ionizzati dei residui sono notevolmente differenti dai corrispondenti valori negli amminoacidi liberi. La glicina è un amminoacido che presenta due gruppi ionizzabili (non presentando residui ionizzabili), quindi presenterà due valori di pk.

Invece, prendendo in considerazione l'amminoacido istidina, questo presenta un gruppo R ionizzabile, quindi il suo grado di dissociazione sarà regolato da 3 pK e non 2.

Elettroforesi

Un amminoacido sottoposto ad un campo elettrico migrerà verso il catodo o verso l'anodo a seconda della sua natura e la quantità delle sue cariche: su questo principio si basa la tecnica di separazione chiamata elettroforesi. Ad esempio, partendo da una miscela di alanina, aspartato e lisina, e ponendo il pH della soluzione al valore del pI di uno degli amminoacidi, ad esempio 6, il pI dell'alanina, quest'ultimo amminoacido, avendo carica nulla, non migrerà in nessuno dei due poli. Migrerà verso il catodo l'amminoacido con carica negativa e verso l'anodo l'amminoacido con carica positiva. Da questo esempio si può dedurre, quindi, che la carica elettrica di un amminoacido e quindi la sua mobilità in un campo elettrico dipenderanno dal pH del mezzo. Utilizzando un pH inferiore al pI degli amminoacidi, questi migreranno verso il catodo. Utilizzando un pH superiore al pI degli amminoacidi, questi migreranno verso l'anodo. L'elettroforesi degli amminoacidi o delle proteine viene eseguita immobilizzando la soluzione tampone contenente gli amminoacidi su un adatto supporto come ad esempio della carta da filtro. Le estremità di quest'ultima vengono poste in apposite vaschette, contenenti lo stesso tampone, nelle quali sono immersi due elettrodi. Si applica un potenziale elettrico a potenziale elevato per un certo arco di tempo e, finita l'operazione, si noteranno gli amminoacidi mediante l'utilizzo di appositi reagenti come ad esempio la ninidrina (colore blu-viola) oppure la fluorescamina che, reagendo con l'amminoacido, genera un derivato fluorescente.

I peptidi: il legame carboammidico

Gli amminoacidi possono legarsi tra loro per formare delle strutture più complesse come ad esempio peptidi e proteine. Il legame che unisce gli amminoacidi in tali strutture, si forma per eliminazione di una molecola di acqua tra il gruppo carbossilico di un amminoacido e il gruppo amminico di un altro. Tale legame viene denominato legame peptidico o, a significare la sua natura di ammide sostituita, carboammidico. Il dipeptide che si forma presenterà un gruppo amminico ed un gruppo carbossilico liberi e ciò permetterà a tale dipeptide di legarsi con altri amminoacidi a formare tripeptidi, tetrapeptidi e così via fino ad arrivare ad una catena polipeptidica. Il legame ammidico è un legame stabile, non consente alcuna libertà di rotazione ai gruppi atomici che collega (CO – NH); questi giacciono su un medesimo piano, quindi tale composto sarà costituito da una struttura planare. Tale rigidità è data dall'elevato grado di risonanza che gli conferisce un carattere intermedio tra legame semplice e doppio legame.

Proteine

In tutti gli organismi viventi le proteine costituiscono la classe di molecole più abbondanti: negli animali, ad esempio, più del 50% del peso secco è rappresentato dalle proteine. Come già detto, le proteine sono costituite dai 20 amminoacidi descritti. Ogni proteina si differenzia dalle altre per la proporzione relativa degli amminoacidi nelle catene polipeptidiche, per la sequenza di amminoacidi oltre che per il peso molecolare. Le proteine, in base alla loro composizione, si distinguono in:

• Semplici → costituite da soli amminoacidi
• Complesse → contenenti molecole diverse come lipidi, glucidi, eme ecc. oltre agli amminoacidi

Dal punto di vista strutturale si distinguono in:

• Fibrose → collagene, actina, miosina
• Globulari → la maggior parte delle proteine

Dal punto di vista funzionale, le proteine sono assai versatili:

• Catalisi enzimatica → tutti gli enzimi sono circa proteine più o meno complesse
• Trasporto → la maggior parte delle sostanze sono trasportate da un tessuto ad un altro, da cellule ad altre cellule ecc. e questa funzione è svolta da proteine adibite quasi solo al trasporto di queste sostanze; ad esempio l'ossigeno è trasportato dall'emoglobina, trigliceridi e altri lipidi dalle lipoproteine ematiche, gli acidi grassi dalla albumina. Altre proteine specifiche di membrana, chiamate carriers, sono adibite al trasporto di varie sostanze inorganiche ed organiche attraverso le membrane cellulari ed intercellulari
• Deposito → alcune proteine svolgono funzione di deposito specifico o aspecifico come ad esempio la ferritina: adibita al deposito del ferro; la caseina : adibita alla riserva di amminoacidi nel latte
• Protezione → Anticorpi, agenti responsabili della difesa dell'organismo, come la risposta immunitaria, contro batteri, virus e così via. Di natura proteica è anche il fibrinogeno, principale responsabile della coagulazione del sangue
• Contrazione → le proteine contrattili del muscolo, come la miosina, actina ecc. sono proteine fibrose che si allungano e si accorciano durante il ciclo di contrazione e rilassamento delle fibre muscolari
• Regolazione ormonale → numerosi ormoni, come l'insulina, glucagone, paratormone ecc. sono tutti di natura proteica
• Funzione strutturale → collagene ed elastina, ovvero i tipici componenti del tessuto connettivo. Sono anch'esse proteine
• Regolazione genica → i fattori che controllano i processi di trascrizione e traduzione, come istoni, repressori, induttori, proteine ribosomiali ecc. sono proteine
• Recezione e trasduzione di segnali → segnali o stimoli esterni sono recepiti da specifici recettori di natura proteica e sempre da proteine vengono trasdotti in risposte interne

Solubilità e precipitabilità

La solubilità di una proteina, in acqua, dipende dal rapporto tra i gruppi polari e non polari dei residui amminoacidici che la costituiscono. Più tale rapporto è in favore dei residui polari più la proteina sarà solubile in acqua. In genere, comunque, le proteine globulari sono solubili in acqua; quelle fibrose sono insolubili o scarsamente solubili e le scleroproteine sono decisamente insolubili. La solubilità è inoltre influenzata da diversi fattori:

• Azione dei sali inorganici → la solubilità di alcune proteine in acqua è influenzata dal pH e dalla presenza di elettroliti. I sali neutri, in particolare cationi bivalenti (es MgCl₂), hanno la capacità di modificare sostanzialmente la solubilità delle proteine. In genere, basse concentrazioni di un sale, incrementano la solubilità di una proteina: questo effetto prende il nome di "salting in". Un'elevata concentrazione salina fa diminuire, fino a precipitare, la solubilità delle proteine in acqua: tale effetto prende il nome di "salting out"
• pH → la solubilità minima di una proteina viene raggiunta al pH corrispondente al punto isoelettrico, cioè al pH in corrispondenza del quale la molecola proteica possiede carica elettrica nulla. In tale condizione, le repulsioni intermolecolari diventano minime, le molecole si aggregano e precipitano: precipitazione isoelettrica

Idrolisi delle proteine

Le proteine, attraverso un processo denominato idrolisi, possono essere risolute nei loro amminoacidi costituenti. Tale processo implica la rottura di tutti i legami carboammidici che legano tra loro gli amminoacidi costituenti. Si differenziano due tipologie di idrolisi:

• Idrolisi chimica → effettuata con acidi o con basi. Per l'idrolisi acida si impiega un acido forte e concentrato ad una temperatura compresa tra 110°C e 115°C, in una fiala sigillata per evitare la degradazione degli amminoacidi. Il processo dura in media 18-24 ore e consente il recupero di glutammina ed acido glutammico. Per l'idrolisi basica si opera allo stesso modo ed è utile per il recupero del triptofano ma comporta la distruzione degli altri amminoacidi
• Idrolisi enzimatica → Alcuni enzimi proteolitici, di origine batterica, sono capaci di idrolizzare aspecificamente qualsiasi legame ammidico e quindi consentono di idrolizzare completamente le proteine negli amminoacidi costituenti

Organizzazione strutturale delle proteine

Tutte le proteine presentano una struttura primaria, da una struttura secondaria e terziaria di tipo conformazionale, ed alcune anche da una struttura quaternaria. La conoscenza della struttura della proteina è fondamentale per la comprensione del rapporto “struttura-funzione” della proteina stessa.

Struttura primaria

Per struttura primaria o covalente, si intende la semplice sequenza lineare degli amminoacidi, ovvero l'ordine con il quale essi si concatenano nella catena polipeptidica costituente. Poiché ogni catena polipeptidica possiede alle due estremità un amminoacido N-terminale e un amminoacido C-terminale, è possibile sapere il numero delle catene costituenti una proteina dal numero degli amminoacidi terminali.