Potenziali di membrana, canali e recettori

CANALI ATTIVI

Le membrane eccitabili dei neuroni, delle cellule muscolari e delle cellule neuroendocrine non

rispondono solo passivamente a stimoli elettrici, ma possiedono canali attivi che generano risposte

chiamate potenziali d’azione.

Canali voltaggio-dipendenti: POTENZIALE D’AZIONE

I canali voltaggio-dipendenti sono aperti o chiusi a seconda del potenziale di membrana. Ogni

canale ha un su potenziale di soglia, cioè un certo valore di potenziale che permette l’apertura del

canale. Ci sono tantissimi canali voltaggio-dipendenti e ognuno ha una sua soglia di apertura. In

generale il cambiamento del potenziale di membrana fa passare il canale dallo stato chiuso allo stato

aperto. La maggior parte di questi canali si apre in seguito ad una depolarizzazione, cioè il

passaggio del potenziale di membrana da un valore negativo a un valore positivo, ma vi sono anche

canali aperti da una iperpolarizzazione, cioè il passaggio del potenziale dal valore negativo di

riposo ad uno ancora più negativo. Se la membrana riceve impulsi elettrici deboli risponde

passivamente, poiché non viene raggiunto il potenziale di soglia e i canali voltaggio-dipendenti non

si aprono; se l’impulso è sufficientemente elevato da spostare il potenziale di membrana fino al

valore soglia, tali canali iniziano ad aprirsi e far passare gli ioni, portando rapidamente il potenziale

verso valori positivi (eccedenza). Il processo è autoregolato: l’apertura dei primi canali induce una

depolarizzazione (si innalza il potenziale) che determina l’apertura di altri canali voltaggio-

dipendenti. La fase di depolarizzazione procede fino al raggiungimento di un valore massimo di

circa a +60 mV (spike), dopo il quale si ha la fase di ripolarizzazione, che consiste in una rapida

discesa del potenziale fino a valori più negativi di quello di riposo, per poi tornare alle condizioni

iniziali. Il canale per il sodio raggiunge il valore di soglia a -55 mV e si apre, lasciando passare

dentro la cellula molti Na+ spinti dal loro gradiente elettrochimico. In questo modo la membrana si

depolarizza rapidamente, cioè il potenziale di membrana tende verso il potenziale di equilibrio del

sodio (+55 mV), ma non lo raggiunge perché ad un certo punto i canali si inattivano (pur restando

aperti) e la permeabilità al sodio diminuisce. Per riattivarsi i canali devono prima tornare allo stato

chiuso. Durante la depolarizzazione succede anche che si aprono i canali per il potassio voltaggio-

dipendenti, che fanno fuoriuscire ioni K+, quindi la membrana si ripolarizza (il potenziale torna

verso valori negativi). Addirittura, poiché la membrana diventa estremamente permeabile al

potassio, una volta chiusi i canali per il sodio, il potenziale raggiunge quasi quello di equilibrio del

potassio, arrivando a circa -80 mV (potenziale postumo). Quando si chiudono anche i canali per il K

l’iperpolarizzazione postuma si arresta e il potenziale torna al valore di risposo di -70 mV.

I canali per il sodio e quelli per il potassio si aprono quindi in tempi diversi: quelli per Na+ si

aprono per primi, ma sono transitori perché si inattivano rapidamente e sono responsabili del

potenziale d’azione; i canali per K+ si aprono in ritardo rispetto a quelli per il sodio, restano aperti

più a lungo e sono responsabili del potenziale postumo (iperpolarizzazione).

Dopo un potenziale d’azione si può generare un secondo potenziale se tra i due eventi intercorre un

periodo sufficientemente lungo, detto periodo refrattario. L’inattivazione dei canali rende, infatti, la

membrana refrattaria a rispondere ad un secondo stimolo. In una prima fase, detta periodo

refrattario assoluto, il canale non si può aprire neanche se arriva uno stimolo molto intenso, quindi

non è possibile evocare alcun potenziale d’azione. Nella fase immediatamente seguente, detta

periodo refrattario relativo, il canale può aprirsi se arriva uno stimolo molto forte e causare una

depolarizzazione minore rispetto alla prima (in questa fase alcuni canali sono già tornati allo stato

attivo chiuso). Solo quando tutti i canali si sono chiusi si può generare un nuovo potenziale d’azione

di ampiezza uguale al precedente.

Esistono canali voltaggio-dipendenti per diversi ioni. Le caratteristiche che differenziano i vari

canali sono:

- la struttura

- la selettività ionica

- la conduttanza, cioè l’ampiezza della corrente che il canale lascia passare

- la soglia di apertura

- le cinetiche di attivazione e inattivazione (ci sono canali ad apertura rapida e altri ad

apertura lenta, stessa cosa per l’inattivazione)

- sensibilità a sostanze (tossine velenose) che agiscono da bloccanti specifici per i vari canali

(per es. la tetrodotossina per i canali del Na+) e che sono state utilizzate per studiarli.

Le diversità tra i vari canali sono state studiate con tecniche di biologia molecolare, che hanno

permesso di identificarne la struttura, e con tecniche di elettrofisiologia, che hanno permesso di

studiare le caratteristiche cinetiche del singolo canale ionico, cioè con quale velocità e a quale

potenziale esso si apre, si inattiva e si chiude. La tecnica che ha permesso di caratterizzare i canali

dal punto di vista del comportamento elettrofisiologico si chiama patch-clamp e si basa sul

principio del blocco del voltaggio. E’ importante notare che quando una corrente ionica attraversa i

canali, il potenziale di membrana cambia e ciò si ripercuote sulle conduttanze di altri canali, che a

loro volta si aprono creando altre correnti che complicano lo studio di questi fenomeni. Un modo

efficace per capire come variano le conduttanze dei diversi canali ai vari potenziali, consiste nel

bloccare il potenziale di membrana ad un valore costante nel tempo e misurare la corrente di

membrana a quel potenziale. Il voltage-clump (blocco del voltaggio), già utilizzato duranti i primi

studi sull’assone gigante di calamaro, si basa su uno strumento che permette di bloccare il voltaggio

della cellula che si sta studiando ad un valore fisso, inviando delle correnti di segno opposto a

quelle che attraversano la membrana. In questo modo si possono registrare le correnti di membrana.

Prima si facevano registrazioni intracellulari con elettrodi sottilissimi; nella tecnica del patch-clamp

si usano, invece, elettrodi meno sottili che riescono a isolare un frammento di membrana abbastanza

largo da cui si registrano le correnti. Tale tecnica è stata messa a punto negli anni ‘80 dai tedeschi

Neher e Sakmann, che hanno vinto il premio Nobel per questa scoperta, e costituisce un

perfezionamento del voltage-clamp. Si avvicina alla membrana di un neurone una micropipetta di

vetro rifinita alla fiamma, la cui punta ha diametro di circa 1 micrometro. La pipetta è riempita di

una soluzione salina simile a quella dei liquidi extracellulari (soluzione conduttrice), in cui è

immerso un elettrodo metallico, ed è collegata ad un sistema di registrazione e ad una siringa di

aspirazione. Effettuando un’aspirazione la membrana del neurone è attirata dall’elettrodo e si crea

una forte aderenza tra le pareti della pipetta e il frammento di membrana. In questa configurazione a

“cellula attaccata” si misura la corrente che passa attraverso i singoli canali presenti in quel pezzo di

membrana che è stato sigillato. Si vede che i canali si aprono in maniera “tutto o nulla”: quando il

canale è aperto passa una corrente che ha sempre la stessa ampiezza, ciò che cambia è il numero di

aperture del canale e il tempo di apertura (tempo che il canale passa nello stato aperto), per questo

la corrente registrata ha un andamento discontinuo. Su questa base si calcola la probabilità di

apertura del canale al di sopra del potenziale di soglia: superata la soglia, infatti, il canale non è

costantemente aperto, ma ha molta più probabilità di trovarsi allo stato aperto che chiuso, cioè

aumentano il numero di aperture e il tempo di apertura.

Si può realizzare un’altra configurazione “a cellula intera” che permette di registrare le correnti

passanti attraverso i canali di tutta la cellula: si aspira ulteriormente dalla siringa, il frammento di

membrana viene rotto e il contenuto della pipetta si mette in comunicazione col contenuto della

cellula. Le correnti registrate in questo caso non hanno tutte la stessa ampiezza come nel caso

precedente, ma sono correnti macroscopiche con un andamento continuo perchè non risentono delle

aperture e delle chiusure dei singoli canali (durante la chiusura di alcuni canali altri restano aperti,

quindi il numero di aperture e i tempi dei singoli canali non vengono registrati). Le correnti

macroscopiche sono date dalla somma delle correnti che attraversano i singoli canali.

La postazione per il patch-clamp ha: un tavolo anti-vibrazioni, una postazione per il microscopio,

dei manipolatori per mettere gli elettrodi, una telecamera per vedere il preparato su un monitor, un

amplificatore che permette di bloccare il voltaggio, uno stimolatore per inviare degli stimoli e un

computer per acquisire i dati. Il patch-clamp si può fare o su cellule isolate in coltura o su fettine di

tessuto cerebrale, nelle quali le sinapsi rimangono integre e possono essere studiate.

Le cellule, durante la registrazione delle correnti, vanno tenute in vita, quindi devono essere perfuse

con un liquido che ha una composizione simile a quella del liquido cerebro-spinale e facendo

gorgogliare ossigeno.

Alcuni canali voltaggio-dipendenti hanno una struttura omomerica, ovvero sono formati da varie

subunità uguali fra di loro (per es. molti canali per K+); altri hanno una struttura eteromerica (canali

per Na+ e Ca2+), cioè sono formati da subunità diverse tra loro.

Il canale per il sodio ha una subunità α formata da 4 domini e poi può avere più subunità β (per

esempio nelle cellule muscolari scheletriche il canale per il sodio ha solo le subunità alfa e beta1,

invece negli altri tipi di muscolo anche beta2 e beta3). La subunità α è la principale perché forma il

poro del canale e presenta una zona che funge da sensore del voltaggio (sente il cambiamento del

potenziale e quando si raggiunge la soglia cambia conformazione aprendo il poro), un’altra zona

responsabile dell’inattivazione del canale, il filtro di selettività e il sito extracellulare che lega la

tetrodotossina (TTX). Ognuno dei 4 domini della subunità α è formato da 6 segmenti

transmembrana ad alfa-elica:sul segmento S4 si trova il sensore, mentre nell’ansa tra S5 ed S6 il

filtro di selettività.

Le subunità β hanno funzione regolatrice delle cinetiche di apertura e chiusura del canale.

Sono stati trovati finora 9 tipi di canali voltaggio-dipendenti per il sodio espressi in diverse cellule e

quasi tutti hanno caratteris