Patologie del metabolismo

Patologie del metabolismo

Esistono più di 200 patologie del metabolismo note. Lo studio di queste patologie ha avuto inizio nel 1902 con il medico inglese Garrod che per primo coniò il termine "errori innati del metabolismo" descrivendo quattro malattie: cistinuria, alcaptonuria, albinismo e pentosuria. Sono malattie legate a mutazioni in particolari geni che si trovano soprattutto sugli autosomi (trasmissione recessiva) o sul cromosoma X (trasmissione sessuale, colpiti soprattutto i maschi). Esistono anche delle malattie dovute a mutazioni a livello del DNA mitocondriale (eredità matrilineare).

Siccome nella maggioranza dei casi si tratta di patologie autosomico recessive, normalmente gli eterozigoti sono asintomatici, ma esistono delle eccezioni (la malattia di Fabry ha pazienti eterozigoti con sintomatologia più lieve). Sono malattie rare, di solito i pazienti nascono da genitori eterozigoti sani.

Classificazione delle malattie metaboliche

• Malattie del metabolismo degli amminoacidi e degli acidi organici
• Malattie del metabolismo del piruvato e dei trasportatori della catena respiratoria mitocondriale
• Malattie del metabolismo degli acidi grassi
• Malattie del metabolismo dei carboidrati
• Malattie da accumulo lisosomiale
• Malattie perossisomiali
• Malattie del metabolismo delle lipoproteine e dei lipidi
• Malattie del metabolismo delle purine e delle pirimidine
• Malattie del metabolismo delle porfirine e dell’eme
• Malattie del metabolismo dei minerali

Possono avvenire anche delle mutazioni talmente dannose che non sfociano in una patologia perché provocano letalità embrionale. Alcune patologie possono essere letali nei primi giorni di vita. Esempio: mucolipidosi di tipo II o I-cell disease, le proteine da mandare al lisosoma non vengono opportunamente taggate (devono avere dei residui di mannosio 6-fosfato), le proteine lisosomiali vengono sintetizzate ma non riescono a raggiungere i lisosomi che restano vuoti.

Diagnosi

La prima diagnosi si basa sull'osservazione del paziente. Esistono alcune patologie, come le mucopolisaccaridosi, che danno un aspetto particolare al paziente.

Analisi dei metaboliti

In casi di difetti a livello delle vie degradative, avviene un accumulo del metabolita che non viene degradato. L'analisi avviene mediante HPLC, spettroscopia in RMN (permette di vedere la struttura, si basa sull'esistenza di atomi paramagnetici che si orientano in un campo magnetico e danno un segnale), spettrometria di massa tandem (piccoli, molto precisa).

Saggi enzimatici

Se un metabolita si accumula, significa che c'è un enzima che funziona meno o non funziona. Permettono di vedere se un enzima è meno attivo. È possibile anche determinare parametri cinetici come la km e la V_max, è possibile capire se l'enzima lavora di meno perché ha perso affinità per il substrato, oppure se è legato alla V_max perché c'è qualche problema a livello del sito catalitico.

Analisi molecolare

Analisi genetica, i primi test risalgono agli anni '80. È un approccio meno invasivo (basta un prelievo ematico) e permette la diagnosi prenatale. Consente di riconoscere le mutazioni presenti nel paziente, si aspira a fare una correlazione genotipo-fenotipo, in base alla mutazione si vorrebbe predire quale sarà la qualità di vita del paziente e per cercare di fare una terapia personalizzata. Non è quasi mai possibile per via dell'influenza dell'ambiente e dello stile di vita. Più recentemente, grazie al sequenziamento, è possibile analizzare i geni malattia; in alcuni casi si possono scoprire delle mutazioni nuove, non sempre è però possibile correlarle all'attività enzimatica e quindi alla patologia. Alcune patologie possono avere 300 mutazioni, ma nell'80% dei pazienti sono presenti solo 7/8 di esse.

Opzioni terapeutiche

• La primissima terapia utilizzata è stata una dieta restrittiva nel caso della fenilchetonuria (anni '50).
• Può essere efficace se nella patologia l'enzima non funziona e per questo il metabolita si accumula; il paziente deve seguire una dieta priva di questo metabolita. Funziona molto bene se la compliance del paziente è buona.
• Successivamente (anni '60) sono state messe a punto le prime terapie enzimatiche sostitutive. Se un gene mutato provoca l'inattivazione di un enzima, si può pensare di somministrare al paziente tale enzima. Si presuppone che sia noto qual è l'enzima inattivo e che si abbia a disposizione l'enzima da somministrare.
• Prima dell'avvento della biologia molecolare, gli enzimi venivano purificati da altre fonti (generalmente bovini). Questo processo causava però dei problemi per quanto riguarda la preparazione, i costi e la salute; le proteine sono diverse da quelle umane e alla lunga inducono una risposta immunitaria, il paziente diventa resistente alla terapia enzimatica sostitutiva e rischia lo shock anafilattico.
• Con l'avvento della biologia molecolare è stato possibile clonare i geni umani e produrre delle proteine ricombinanti che vengono meglio tollerate dal sistema immunitario.
• Il problema della terapia enzimatica sostitutiva è la compliance del paziente. A volte è possibile aumentare l'attività somministrando degli attivatori enzimatici (omocistinuria).
• Ma nella maggioranza dei casi è necessario somministrare un enzima dall'esterno, esistono diversi casi:
  • Difetto a livello di enzimi extracellulari con proteine extracellulari: utilizzato il fattore VIII ricombinante nel caso dell'emofilia A.
  • Difetto a livello di enzimi intracellulari con proteine extracellulari: ADA-SCID, somministrazione per via orale dell'enzima ADA ricombinante coniugato con il PEG che rende l'enzima più stabile; l'assorbimento avviene a livello intestinale in quantità sufficienti per migliorare la condizione dei pazienti.
  • Difetto a livello di enzimi intracellulari con proteine intracellulari: le proteine ricombinanti devono entrare nelle cellule, serve un tag che permetta l'endocitosi dell'enzima; malattia di Gaucher (da accumulo lisosomiale).
• A volte, se una via metabolica è difettosa, è possibile compensare il problema attivando altre vie metaboliche alternative. Si utilizza questa strategia nel caso dell'omocistinuria.
• È possibile togliere il substrato, approccio utilizzato per le malattie da accumulo lisosomiale: patologie nelle quali avviene l'accumulo di glicolipidi; si agisce sulla produzione dei glicolipidi.
• Strategie di inibizione enzimatica: esempio, utilizzate statine per ridurre la sintesi di colesterolo a partire dall'acetil-CoA.
• Terapia genica: inserimento di un gene funzionale all'interno delle cellule mediante l'utilizzo di un vettore. È un approccio nato alla fine degli anni '90, ha dato meno risultati rispetto alle aspettative in quanto può causare alcuni problemi:
  • Scelta del bersaglio non è sempre ovvia, ci sono diverse malattie multiorgano.
  • Scelta del vettore (di solito virale, esistono diversi tipi di virus).
  • La frequenza di trasfezione dipende dalla dimensione del gene, dal tipo di tessuto bersaglio, l'espressione non è sempre stabile.
  • In alcuni casi c'è anche la difficoltà di veicolare il vettore a livello del sito di interesse (le mucopolisaccaridosi hanno sintomi a livello della cartilagine, è un tessuto difficile da transfettare).
  • Potrebbe avvenire l'integrazione a livello di siti del genoma e il promotore potrebbe attivare la trascrizione di altri geni, possibile attivazione di oncogeni, rischio di sviluppo tumori. Esempio brillante: ADA-SCID, il vettore viene veicolato a livello del sangue.
• Trapianto di midollo osseo: è una strategia piuttosto invasiva, si adotta solo in forme gravi in cui le altre strategie terapeutiche non hanno funzionato oppure perché non ci sono altre terapie a disposizione. Non cura la malattia, ma il trapianto con cellule di donatore permette di produrre quel tanto di enzima che a volte basta per migliorare la condizione di vita del paziente, indipendentemente dal fatto che questo non viene prodotto da tutto il corpo. Problemi: compatibilità con un donatore, possibilità di rigetto, immunosoppressione.

Patologie del metabolismo degli amminoacidi

I difetti nel metabolismo degli amminoacidi possono riguardare il loro trasporto o la loro degradazione. Esistono 20 vie di degradazione (una per ogni amminoacido) e tutte finiscono nel ciclo dell'urea; modalità con la quale viene smaltito il gruppo amminico degli amminoacidi. Lo ione ammonio NH₄⁺ è un composto tossico, esplica la sua tossicità soprattutto a livello del SNC riducendo il livello di ATP nelle porzioni cerebrali, deve essere eliminato sotto forma di urea. Le mutazioni a carico di enzimi coinvolti nel ciclo dell'urea provocano delle malattie gravissime, spesso fatali molto precocemente.

Esistono diverse patologie legate a difetti nel metabolismo degli amminoacidi. Gli amminoacidi possono essere:

• Chetogenici: vengono degradati ad acetil-CoA, possono dare corpi chetonici
• Glucogenici: vengono degradati a dare un intermedio del ciclo di Krebs

La divisione non è netta, alcuni amminoacidi possono essere sia chetogenici che glucogenici.

Fenilchetonuria (PKU)

Patologia autosomico recessiva. Coinvolge la via degradativa della fenilalanina (aa essenziale). Incidenza 1:10.000 (popolazione caucasica). Si intendono condizioni molecolari diverse:

• Difetti della fenilalanina idrossilasi (PHA): enzima epatico che converte la fenilalanina in tirosina (I step della via degradativa)
• Difetti nel pathway di biosintesi della tetraidrobiopterina (BH₄), cofattore della PHA
• Difetti nel pathway di rigenerazione della BH₄

L'iperfenilalaninemia (HPA) è invece una forma più lieve causata da una deficienza enzimatica meno severa. La fenilchetonuria è caratterizzata da iperfenilalaninemia; nel sangue e nelle urine sono presenti concentrazioni molto elevate di Phe. Se non trattata, può provocare un grave ritardo mentale causato dall'accumulo di fenilalanina (QI di 20). Altri sintomi: problemi nell'assunzione di cibo, vomito, letargia, convulsioni.

Il ritardo mentale potrebbe essere dovuto al fatto che la Phe arriva alle cellule del sistema nervoso centrale passando la barriera ematoencefalica grazie al trasportatore LNAA (trasportatore degli amminoacidi neutri grossi). Normalmente, LNAA trasporta anche Try e Trp; in presenza di eccessi di Phe, questa satura i trasportatori e viene così impedito l'uptake di tirosina e triptofano che sono necessari per la sintesi di serotonine e catecolammine a livello cerebrale.

La fenilalanina viene convertita in acetil-CoA e fumarato. Nel primo step della via degradativa, la fenilalanina idrossilasi converte la fenilalanina in tirosina mediante l'aggiunta di un gruppo -OH a livello dell'anello aromatico. Gli enzimi che aggiungono atomi di ossigeno sono delle ossigenasi:

• Monossigenasi: inseriscono un atomo di ossigeno a livello del substrato, l'altro esce come H₂O
• Diossigenasi: inseriscono due atomi di ossigeno a livello del substrato

La fenilalanina idrossilasi è una monossigenasi, la reazione produce una molecola di H₂O. Questo enzima ha come co-fattori NADH e TETRAIDROBIOPTERINA (BH₄). Nel processo di idrossilazione della fenilalanina, la BH₄ viene convertita a diidrobiopterina, perde due atomi di H che vanno nell'H₂O.

È necessario rigenerare il co-fattore, per questo esiste una diidrobiopterina reduttasi che utilizza NADH e H⁺ per ridare BH₄. Se ci sono problemi nella rigenerazione di BH₄, non può avvenire l'idrossilazione della fenilalanina, causando PKU. La tirosina diventa poi p-idrossi fenilpiruvico e poi in omogentisato; se gli enzimi di queste tappe sono mutati, provocano tirosinemie. La fenilalanina idrossilasi è un enzima epatico, il fegato è la sede di processi degradativi degli amminoacidi.

Quando la Phe si accumula, può diventare il substrato di altri enzimi che normalmente non la utilizzerebbero. Può diventare substrato delle amminotransferasi che spostano il gruppo amminico da un amminoacido all'altro: lavorano partendo da un amminoacido e da un α-chetoacido; l'amminoacido diventa α-chetoacido e viceversa, mediante il trasferimento del gruppo amminico. La Phe diventa substrato della fenilalanina amminotransferasi che utilizza il piruvato come α-chetoacido: il piruvato, mediante il trasferimento del gruppo amminico, diventa alanina, mentre la fenilalanina diventa il suo α-chetoacido corrispondente, il fenilpiruvato. Il fenilpiruvato diventa a sua volta substrato di enzimi che normalmente non lo utilizzerebbero. Può essere ridotto a fenillattato oppure idrossilato a fenilacetato. Parte dei sintomi sono dovuti all'accumulo di fenilpiruvato.

Mutazioni

Il gene che codifica per la fenilalanina idrossilasi si trova sul cromosoma 12. È un gene abbastanza grande, contiene 13 esoni:

• Più del 60% delle mutazioni a carico di questo gene sono missenso
• Il 13% è rappresentato da delezioni (prevalentemente di ridotte dimensioni)
• 11% sono a livello dei siti di splicing
• 5% non senso
• 2% inserzioni
• Meno dell'1% sono duplicazioni o grosse delezioni

Sono state identificate più di 500 mutazioni diverse, ma solo 8 sono presenti nei 2/3 dei pazienti. Le mutazioni possono provocare fenilchetonuria o iperfenilalemia. Il 55% provocano PKU classica, il 27% PKU mild, 18% iperfenilalaninemia.

Fenilalanina idrossilasi

La fenilalanina idrossilasi fa parte della famiglia delle monossigenasi. È un enzima molto conservato ed è espresso prevalentemente a livello epatico. Viene attivato allostericamente dalla Phe. Ha una struttura quaternaria che può essere sia in forma omodimerica che omotetramerica. L'equilibrio tra la forma dimerica e quella tetramerica dipende dal pH.

Il monomero è caratterizzato da 3 diversi domini:

• Dominio catalitico: si trova nella porzione N-terminale, struttura con 13 α-eliche e 8 β-foglietti
• Dominio regolatorio: ha una struttura a sandwich α-β, contiene doppi motivi β-α-β
• Dominio di tetramerizzazione: estremità carbossi-terminale, è una grossa α-elica con due piccoli foglietti β che formano un β ribbon

I singoli monomeri si associano a livello dell'estremità carbossi-terminale. Le 500 mutazioni sono state trovate un po' in tutti i domini. Principalmente, però, si trovano a livello del dominio catalitico (70%) e causano una diminuzione dell'attività enzimatica. Il 16% delle mutazioni sono localizzate a livello del dominio regolatorio. Il 14% sono localizzate nel dominio di tetramerizzazione, risultano più gravi, in quanto il monomero non è cataliticamente attivo.

Nel sito attivo della fenilalanina idrossilasi si trova un atomo di ferro coordinato da due istidine. La BH₄ quando interagisce con l'enzima viene coordinata da una serina e da un glutammato, unici due residui non idrofobici del sito catalitico.

Diagnosi

Dal 1962 esiste lo screening neonatale per la fenilchetonuria: è importante intervenire con la terapia nelle primissime settimane di vita. Heel prick test: viene rilevata la concentrazione di Phe da uno spot di sangue prelevato dal calcagno del neonato. Storicamente si è utilizzato il test di Guhtrie di inibizione batterica. La goccia di sangue viene messa a contatto con una piastra sulla quale vengono fatti crescere dei batteri ai quali è stato somministrato un analogo della fenilalanina, un inibitore della fenilalanina idrossilasi che non permette la crescita dei batteri. Se nello spot di sangue è presente un elevato livello di Phe, questa compete con il suo analogo e viene quindi rilevata la crescita dei batteri.

Oggi questo test è in disuso e viene utilizzata la spettrometria di massa (possibile fare anche un dosaggio nelle urine mediante reazione colorimetrica). Viene considerata PKU se ci sono oltre 20mg/dl di Phe nel siero (vengono fatti numerosi replicati tecnici). Una volta individuato un caso di PKU, è importante individuare se è un caso BH₄ responsivo o meno; alcune mutazioni alterano l'affinità della fenilalanina transferasi per la BH₄, l'enzima lavora di meno perché lega meno il cofattore.

Si effettua un test da carico: somministrazione al paziente di elevate quantità di BH₄ e si vede nel tempo se la concentrazione ematica di Phe scende o meno; se scende al di sotto di una certa percentuale, si tratta di una forma responsiva. Nei casi BH₄ responsivi è possibile intervenire somministrando BH₄. Successivamente, viene effettuata l'analisi genetica degli enzimi coinvolti nella sintesi e nel riciclo della BH₄ (patologie che vanno comunque sotto il nome di fenilchetonuria).

Terapia

È molto importante intervenire tempestivamente, permette ai neonati di avere uno sviluppo intellettivo normale. La classica terapia consiste in una dieta totalmente priva di fenilalanina che deve essere portata avanti almeno fino ai 20/25 anni, meglio se per tutta la vita (studi in contrasto). La compliance del paziente rappresenta però un problema.

Esiste anche una terapia enzimatica sostitutiva con l'enzima fenilalanina ammonia liasi che deriva dalle piante e viene somministrato per via orale, consente di controllare i sintomi insieme alla dieta in quanto aiuta la degradazione della fenilalanina a livello del lume intestinale. Nelle forme responsive si somministra BH₄. Nuova terapia: assunzione di un integratore che contiene una miscela di amminoacidi che vengono trasportati dal trasportatore LNAA presente a livello della membrana ematoencefalica; prevengono la saturazione da parte della fenilalanina.