Riassunto esame Patologia Vegetale, prof. Agosteo

IMPIEGO DI PIANTE INDICATRICI

Sono piante indicatrici le piante che rispondono all'azione patogena determinata da un virus o da un

microorganismo o a una sostanza fitotossica (inquinanti) e sono di grande utilità in questi casi:

nella necessità di effettuare diagnosi in strutture non dotate di laboratori, la messa in evidenza

mediante trasmissione per innesto a piante test , la segnalazione della presenza di inquinanti

atmosferici.

La trasmissione di un virus a diverse specie di piante test erbacee permette di avere un quadro

sintomatologico molto ampio e diversificato tale da indirizzarci verso il test diagnostico o

molecolare che è più adatto al caso specifico. La tecnica più usata è l'inoculazione “per succo”,

chiamata anche “trasmissione meccanica” o “trasmissione per strofinamento”, questo prevede la

prevede la preparazione dell'inoculo mediante triturazione , successivamente la distribuzione

dell'inoculo mediante strofinamento sulle foglie delle piante test, si procede al lavaggio delle foglei

trattate in modo da eliminare i residui dell'inoculo, per avere una chiara visione dei sintomi che

compaia nel giro di pochi giorni.

LA DIAGNOSI SIEROLOGICHE

Diverse macromolecole organiche e in particolare le proteine hanno potere antigeno. Virus,

microplasmi, batteri o funghi hanno un rivestimento costituito da proteine e hanno un potere

antigeno molto elevato e i test sierologici si rivelano particolarmente utili, le particolari zone del

capside virale determinano la formazione di anticorpi e sono detti determinanti antigenici, un serio

che contiene anticorpi che si sono formati come reazione ad un dato antigene è detto antisiero.

Reazioni fra antigeni e anticorpi possono avvenire, oltre che negli animali, in un mezzo liquido o

agarizzato, questa reazione, fatta avvenire in vitreo, costituisce lo studio della sierologia.

Ovviamente le piante non producono anticorpi, quindi per anticorpi intendiamo quelli prodotti da un

animale da esperimento dove il virus è stato iniettato.

L'importanza degli anticorpi nel settore diagnostico deriva dalla loro specificità, essi si combinano

soltanto con l'antigene che li ha determinati, infatti se misceliamo una sospensione di virus da

identificare come una serie di antisieri, la reazione in miscela è data dal virus.

Metodi sierologici: I metodi sierologici sono vari:

Precipitazioni in tubo: E' il metodo richiede quantità non indifferenti di antisiero, si

• preparano tante serie di provette, in ogni provetta si aggiunge virus da identificare

mantenuto a 37-38°, a distanza di alcune ore si può esaminare in quale provetta i virus ha

dato vita a un precipitato. Da migliori risultato con virus di maggiori dimensione e in

particolare con virus di forma allungata.

Microprecipitazione in goccia: Ha essenzialmente lo scopo di risparmiare spazio e

• reagenti, la serie di deluizione , viene fatta invece che a tubi , sottoforma di singole gocce su

una piastra Petri , ad ogni goccia di antiserio, si aggiunge una goccia di sospensione virale e

si copre il tutto con olio di paraffina per evitare l'evaporazione dei reagenti.

Diffusione in gel di agar: in una piastra Petri si fa solidificare una sospensione con lo

• 0,8-1% di agar, si praticano due o più pozzetti dove si ripone il virus da identificare e in altri

i diversi sieri di prova. Sia gli anticorpi che gli antigeni si diffonderanno attraverso l'agar

incontrandosi , daranno origine se affini a bande biancastre di precipitato. Il grande pregio è

che non esprimono soltanto un risultato positivo ma anche per fornirci il grado di parentela

fra i ceppi o virus diversi, è molto adatto per i virus di piccole dimensioni, mentre

sconsigliato per i virus di grandi dimensioni.

Metodo E.L.I.S.A.: E' un metodo estremamente sensibile capace di rilevare anche la

• presenza di minime quantità di virus, può essere impiegato anche su materiale prelevato

direttamente dal campo. La notevole sensibilità che la reazione di combinazione tra virus e

anticorpi viene resa particolarmente vistosa da un procedimento di colorazione gialla

catalizzata da un enzima fosfatasi alcalino, previamente legato agli anticorpi. La reazione è

ottenuta in singoli pozzetti di una piastra in materiale sintetico, nei quali sono giunti

anticorpi purificati, l'estratto dei tessuti del campione, una sospensione di anticorpi coniugati

con l'enzima e infine il substrato destinato a colorarsi di giallo. Se il campione non contiene

virus, mancando l'enzima, non si avrà la colorazione, in caso di esito positivo, l'intensità

della colorazione è proporzionale alla concentrazione del virus campione. Questo metodo è

importante per controlli e rilevamenti su vasta scala.

Immuno microscopio elettronico o metodo I.S.E.M. : Si basa sull'osservazione al

• microcopio elettronico dell'avvenuta reazione fra antigeni e anticorpi, è altrettanto sensibile

quanto il metodo E.L.I.S.A., anche di più se ben eseguito (ovviamente richiede la

disponibilità di un microscopio elettronico).

METODI MOLECOLARI

I metodi di diagnosi molecolare si basano sull'analisi degli acidi nucleici del patogeno:

Ibridazione molecolare: Esso è un fenomeno che avviene in natura ogni volta che una

• doppia elica di Dna o di Rna si forma da due eliche singole complementari l'una all'altra.

L'ibridazione molecolare in patologia vegetale viene usata per l'individuazione della

molecola dell'acido nucleico del patogeno. La reazione di ibridazione può avvenire fra due

catene di Dna o fra due di Rna oppure tra una di Rna e una di Dna ma che siano fra loro

complementari. Una delle due molecole viene preparata per rilevare la presenza di un acido

nucleico complementare , la sonda altro non è che un frammento di Dna o di Rna, bisogna

conoscere la sequenza di una parte dell'acido nucleico del patogeno, che viene inserito in un

plasmide batterico che viene introdotta in cellule Escherichia Coli che darà origine a un

numero alto di frammenti-sonda, successivamente verrà incorporato un nucleotide marcato.

Il Dna lega a sé la sonda marcata ed una lastra fotografica permette di visualizzare una

reazione di ibridazione oppure l'assenza del patogeno ricercato.

Amplificazione genica (PCR) : Si tratta di una tecnica molecolare che ci permette di avere

• un numero elevato di copie di un frammento di Dna del patogeno grazie all'attività

polimerasica di un enzima denominato taq, ottenuto da un microrganismo termofilo.

I protocolli diagnostici più diffusi utilizzando le tecniche di amplificazione genica,

permettono di ottenere risultati attendibili e di raggiungere livelli di sensibilità più elevati

rispetto a quelli che si ottengono con gli altri metodi. E' in grado di rilevare la presenza di un

patogeno a partire da poche copie di un acido nucleico. Oltre alla polimerasi Taq , oggi sono

disponibili Teth e Pfu, dotati di maggiore accuratezza, non possono essere usati virus ad Rna

passando attraverso la sintesi di una molecola di Dna, utilizzando come stampo la molecola

di Rna del virus. La PCR è considerato uno strumento indispensabile per la diagnostica

fitopatologica.

PCR con immuno-cattura: E' una metodologia che prevede una fase preliminare nella

• quale il patogeno viene catturato da una molecola di anticorpo e separata dal succo, si opera

in genere in provette o in piastre di polistirene di 96 pozzetti, nelle quali viene immessa

prima una soluzione contenente l'anticorpo, il patogeno se presente nell'estratto, rimane

legato all'anticorpo, che a sua volte è ancorato alla parete del recipiente. L'aggiunta di

opportune sostanze in grado di distruggere l'involucro del patogeno rende disponibili gli

acidi nucleici per le successive reazioni di PCR.

PCR a nido : Essa consiste di un doppio ciclo di amplificazione

• PCR multipla : Una malattia può essere causata da più patogeni, è possibile accertare

• mediante un saggio singolo, la presenza di eventuali infezioni miste.

Caratterizzazione con RFLP: Sull'amplificazione di un frammento genico si aggiunge il

• sequenzionamento del frammento stesso così che l'informazione si completa con

l'individuazione della specie e del ceppo del patogeno responsabile. Fra le innovazione che

riguardano la diagnostica molecolare bisogna citare la “realtime PCR” e la “Dna

microarray”

Realtime “PCR” : si basa sull'utilizzazione di un sistema combinato di reazione, la prima è

la PCR, seguita dall'ibridazione di una sostanza di poche decine di basi dove vengono legate

molecole fluorogeniche (fluorofori). La funzione di questi di riconoscere il frammento di

Dna al patogeno al quale sono stato designate.

Dna microarray : si tratta di una nanotecnologia, dove la sonda è immobilizzata su un

supporto solido. Il saggio consiste nel confrontare il Dna delle piante da saggiare con le

sonde precedentemente depositate sul microchip, uno o più sonde riconoscono sequenze ad

esse omologhe, i vantaggi sono: c'è la possibilità di standardizzare il procedimento

diagnostico, rapidità di come vengono fornite informazioni precise lo svantaggio sta nel

costo dell'apparecchiatura elevato.

MECCANISMI DI RESISTENZA AI PATOGENI

Le piante sono continuamente esposte ai patogeni ma parte di essa rimane sana per gran parte della

vita per uno dei seguenti motivi:

La pianta è incapace di soddisfare le esigenze vitale del patogeno e possiede barriere

• strutturali e chimiche che non permettono l'infezione (pianta non ospite)

La pianta riconosce il patogeno e attiva meccanismi di difesa che bloccano l'infezione

• La pianta è suscettibile al patogeno ma le condizioni ambientali non permettono di far

• avvenire l'infezione

Le piante possiedono due meccanismi di difesa: le difese passive, ovvero barriere strutturali e

chimiche e che escludono la maggior parte dei patogeni e le difese attive che costituiscono un

sistema di sorveglianza che individuano cellule o molecole estranee innescando una rapida difesa.

Ciascuno delle due linee di difesa possono essere strutturali (tessuti e strutture cellulari) o

chimiche (composti da attività antibiotica prodotti e presenti) , ma qualsiasi difesa attiva viene

stimolata solo grazie al riconoscimento del patogeno.

LE DIFESE PASSIVE O COSTITUTIVE

Le vie di ingresso dei patogeni sono una ferita (unica utilizzabile dai virus); lenticelle, stomi e

idatodi (via di ingresso per batteri e funghi); penetrazione diretta attraverso la cuticola (alcuni

funghi)

Difese passive e strutturali: Nella superficie di una foglia sono presente i tricomi, che possiedono

fra le varie funzioni, quello di rendere poco ospitale lo strato epic