PATOLOGIA VEGETALE completo

Patologia vegetale

Parte generale

Diagnosi

Effettuare la diagnosi di una malattia, ossia identificare la malattia in questione, è una premessa indispensabile per l’impostazione di provvedimenti di difesa di colture o di singole piante interessate da quella malattia.

Procedimento diagnostico

Si divide in:

• Fase 1  Esame visivo delle piante malate in loco o dei campioni pervenuti in laboratorio (si rilevano i sintomi della malattia indagata).
• Fase 2  Acquisizione di tutte le informazioni utili per la diagnosi (epoca di comparsa dei primi sintomi, la loro evoluzione, l’età della pianta).
• Fase 3  Confronto delle osservazioni effettuate e di quelle acquisite con quanto riportato in letteratura e formulazione dell’ipotesi diagnostica.
• Fase 4  Verifica dell’ipotesi diagnostica mediante analisi di laboratorio.

Diagnosi sierologica

Le proteine hanno potere antigeno se vengono iniettate o immesse in un organismo animale, vi stimolano la produzione di anticorpi. Questi si diffondono nel sangue, raggiungono ogni parte dell’organismo e tendono a combinarsi attraverso legami chimico-fisici con le sostanze (dette antigeni), che li hanno determinati bloccandone l’eventuale azione patogena.

È su tali meccanismi che si basano le reazioni immunitarie attraverso le quali uomini e animali possono difendersi da possibili infezioni causate da virus, microplasmi, batteri o funghi. La maggior parte dei virus, avendo il capside totalmente costituito da proteine, hanno un potere antigeno molto elevato, per questo i test sierologici sono particolarmente utili in diagnostica virologica. Le zone del capside virale, che determinano la formazione di anticorpi, sono dette determinanti antigenici. Il siero è la parte non corpuscolare del sangue. Un siero, che contiene anticorpi formatasi come reazione ad un dato antigene, è detto antisiero contro quell'antigene.

Per ottenere un antisiero contro un dato virus occorre iniettare nell’animale prescelto una sospensione contenente quel virus. Affinché l’antisiero risulti specifico è necessario che la sospensione contenga un virus altamente purificato; in caso contrario si avrà un antisiero meno specifico.

Metodo E.L.I.S.A.

Metodo di immuno-assorbimento e marcatura enzimatica. Si tratta di un metodo estremamente sensibile, capace di rilevare anche la presenza di minime quantità di virus. Per questa sua sensibilità può essere impiegato anche su materiale vegetale prelevato direttamente dal campo.

Risulta particolarmente idoneo ad accertare la frequenza di un virus in una o più coltivazioni e a verificare la sanità del materiale destinato alla moltiplicazione. La notevole sensibilità deriva dal fatto che la reazione di combinazione tra virus e anticorpi viene resa particolarmente vistosa da un procedimento di colorazione (gialla) catalizzato da un enzima (fosfatasi alcalina) previamente legato agli anticorpi.

La reazione è ottenuta in singoli pozzetti di un’apposita piastra in materiale sintetico nei quali sono stati via via aggiunti, in successione, una sospensione di anticorpi purificati, l’estratto preparato dai tessuti del campione in esame, una sospensione di anticorpi coniugati con l’enzima e il cosiddetto substrato destinato a colorarsi di giallo in presenza dell’enzima.

In caso di esito positivo, l’intensità della colorazione è proporzionale alla concentrazione del virus nel campione; pertanto effettuando la lettura con un adatto fotometro si può ottenere anche un dato di carattere quantitativo.

Metodi molecolari

I metodi di diagnosi molecolare si basano sull’analisi degli acidi nucleici del patogeno ottenuta attraverso l’utilizzo della proprietà del DNA ricombinante.

Ibridazione molecolare

È una tecnica che consente di verificare la complementarietà esistente tra due molecole di acidi nucleici in base alla loro omologia di sequenza; l’appaiamento delle basi avviene tra due molecole di DNA o RNA. Sfrutta questo meccanismo attraverso:

• Produzione ex novo di filamenti di DNA o RNA a singola elica la cui sequenza è specifica per un certo patogeno e che viene chiamata sonda molecolare;
• Confronto di questa sonda con un frammento complementare del patogeno, eventualmente presente in un estratto proveniente dalle piante da saggiare;
• Verifica se c’è complementarità tra i due filamenti appaiati e se si avrà ibridazione o no; la reazione potrà poi essere messa in rilievo mediante autoradiografia o clonazione (uno dei due filamenti deve essere marcato).

Passaggi:

• Immobilizzazione della catena di DNA su membrana di cellulosa o nylon;
• Ibridazione con sonde marcate con DIGoxygenina; le sonde si legano ai corrispondenti nucleotidi;
• Aggiunta di anticorpi anti-DIG coniugati alla fosfatasi alcalina;
• Rilevamento della reazione con reattivi chemioluminescenti o colorimetrici.

PCR (Amplificazione genica)

Tecnica molecolare che ci permette di ottenere un numero elevato di copie di frammenti degli acidi nucleici sfruttando l’attività polimerasica dell’enzima DNA polimerasi. Tale processo di moltiplicazione presume la conoscenza delle sequenze nucleotidiche finali ed iniziali, all’interno delle quali l’enzima provvederà a polimerizzare un frammento di DNA specifico.

È una tecnica attendibile e più sensibile del test E.L.I.S.A. e dell’ibridazione molecolare. Si opera con polimerasi di organismi termofili e si deve prima denaturare la molecola di DNA (due eliche singole e separate), si effettua poi un appaiamento e successivamente si opera l’estensione delle due doppie eliche. Questa tecnica, la PCR, rileva la presenza del patogeno anche analizzando poche copie del suo acido nucleico.

Fra gli enzimi di modificazione finora conosciuti non esistono polimerasi in grado di sintetizzare ex novo frammenti di acido nucleico utilizzando come stampo una molecola di RNA. Quindi è necessario passare attraverso la sintesi di una molecola di DNA. In questi casi la PCR dev’essere preceduta da una reazione preliminare detta di retro-trascrizione nella quale si forma una molecola di DNA complementare utilizzata poi come stampo per la successiva reazione di PCR.

PCR con immuno-cattura

Metodologia che prevede una fase preliminare nella quale il patogeno, in estratti di piante infette, viene catturato da una molecola di anticorpo e separato dal succo. Il patogeno, se presente nell’estratto, resta legato all’anticorpo che, a sua volta, è ancorato alla parete della provetta. L’aggiunta di opportune sostanze in grado di distruggere l’involucro del patogeno rende disponibili gli acidi nucleici per le successive reazioni di PCR.

PCR a nido

Consiste nell’effettuazione di un doppio ciclo di amplificazione, condotto sullo stesso templato; infatti, il secondo turno di PCR viene eseguito utilizzando, come templato, l’amplicone ottenuto da una precedente reazione di PCR. Si individua così una seconda copia di primers.

PCR multipla

Una malattia può essere causata da più patogeni in infezione mista. In questi casi è possibile accertare, mediante un saggio singolo, la presenza di eventuali infezioni miste, utilizzando due o più copie di primers nella stessa miscela.

Realtime PCR

Si basa sull’utilizzazione di un sistema combinato di reazioni, PCR seguita dall’ibridazione da parte di una sonda di poche decine di basi, alla quale vengono legate molecole fluorogeniche dette fluorofori. La funzione dei fluorofori è quella di segnalare il riconoscimento da parte della sonda del frammento di DNA appartenente al patogeno per il quale è stato designato. L’utilizzo di questa tecnica presenta numerosi vantaggi, fra i quali la rapidità del saggio e la possibilità di rilevare con precisione il risultato ottenuto attraverso un lettore spettrofotometrico.

Sintomi, fitoplasmi e virus

I fitoplasmi sono organismi intermedi tra virus e batteri, a differenza dei batteri sono privi di parete cellulare e possiedono una membrana di natura proteico-glucidica e lipidica; non hanno un vero nucleo, anche se contengono DNA e RNA. Il loro habitat è endocellulare, per questo li troviamo all’interno del floema ricco di carboidrati e caratterizzato da un’alta pressione osmotica. I fitoplasmi sono ritenuti gli agenti causali di numerose malattie, le più importanti sono: moria del pero, scopazzo del melo, malattia x del pesco, giallumi della vite...

I sintomi indotti sono: virescenza, fillodia, internodi allungati ed eziolati, fiori piccoli e poco colorati, malformazioni di fiori e foglie.

I virus provocano alterazione del processo fotosintetico, esaltazione della respirazione cellulare (abnorme consumo di ATP da parte della cellula), deviazione del metabolismo dei carboidrati con accumulo di zuccheri (accartocciamento), diminuzione delle sostanze di crescita (auxine) per la sintesi di sostanze inibenti. I sintomi visibili sulla pianta indotti dai virus possono essere: nanismo o gigantismo, accartocciamento, ingiallimento, bollosità, mosaico, bronzatura, rotture, necrosi, imbrunimento delle foglie e su frutti e fiori si possono avere virescenza, bronzatura, gibbosità, perdita di simmetrie.

Infezioni da funghi

I funghi fitopatogeni possono svolgere la loro azione in equilibrio con l’ospite, intrecciando un rapporto nutrizionale che porta ad un deperimento della pianta, senza però ucciderla. I funghi parassiti delle piante possono attaccare una sola specie vegetale e quindi possono essere monofagi oppure possono attaccare più specie e quindi essere polifagi. Il parassitismo del fungo può essere obbligato oppure facoltativo, quelli obbligati devono sempre vivere a spese dell’ospite altrimenti soccombono, invece quelli facoltativi possono anche nutrirsi di sostanza organica derivante da materiale morto.

Il fungo raggiunge l’ospite sotto forma di spora o conidio, emette un tubetto germinativo primario con funzione ricognitiva. Una volta verificata la possibilità di successo dell’infezione il conidio emette il tubetto di germinazione vero e proprio detto appressoriale. Avviene poi lo sviluppo dell’ifa di infezione e la sua adesione all’ospite viene indirizzata verso i siti più adatti alla penetrazione. Questa può avvenire attraverso le aperture naturali della pianta o mediante l’azione meccanica esercitata dal patogeno. La colonizzazione può essere intracellulare o intercellulare.

Infezione da virus

I virus fitopatogeni sono incapaci di entrare attivamente nei tessuti vegetali e pertanto l’entrata nella cellula ospite è passiva. Il virus riesce ad entrare nella cellula vegetale se sono presenti soluzioni di continuità che mettono in comunicazione l’esterno con l’interno, queste soluzioni possono dipendere da ferite (lesioni) oppure dall’attività dei fitofagi, funghi parassiti e piante parassite...

Le lesioni per permettere l’infezione virale devono almeno interessare il rivestimento cuticolare perché non tutte le lesioni permettono l’infezione virale ed è ormai accertato che sono i plasmodesmi, i punti di inoculo preferiti. Una volta entrato nella cellula ospite, il virus si moltiplica utilizzando un meccanismo che utilizza le risorse energetiche e le strutture chimiche dell’ospite per produrre virus. La moltiplicazione varia in funzione del tipo di virus e del genoma. Successivamente alla moltiplicazione avviene la diffusione all’interno della pianta infetta.

La diffusione può essere localizzata quando il virus passa dalle cellule infette a quelle sane contigue attraverso i plasmodesmi; può essere sistematica invece quando i virus vengono traslocati nelle varie parti della pianta attraverso i vasi floematici. Questo tipo di diffusione avviene soprattutto per opera degli insetti vettori che si nutrono di linfa elaborata. La diffusione sistematica è molto veloce però nonostante questo non riesce a raggiungere i meristemi apicali.

Differenze oomiceti e funghi

• La sostanza di riserva degli oomiceti è costituita da amido mentre nei funghi è costituita dal glicogeno.
• La parete cellulare degli oomiceti è costituita da cellulosa mentre nei funghi è presente la chitina.

Spore fungine

I principali organi di diffusione e di conservazione sono le spore, la loro forma può variare a seconda della specie e della loro origine, possono infatti derivare dalla riproduzione asessuata o da quella sessuata. Le spore possono germinare immediatamente oppure rimanere quiescenti per periodi di tempo più o meno lunghi, fino a quando le condizioni ambientali non diventano favorevoli alla germinazione.

Prima che avvenga la germinazione, la spora assorbe acqua e di conseguenza aumenta il proprio volume e il consumo delle sostanze di riserva. L’aumento della pressione interna provoca la rottura della parete della spora e l’emissione del tubetto germinativo o premicelio. L’allungamento di questa prima ifa avviene in zona apicale, poi questa si ramifica producendo un’ifa laterale e così ha inizio la produzione di molte ife che si estenderanno e ramificheranno in varie direzioni.

La spora è una cellula riproduttiva in grado di svilupparsi senza fecondazione. Le spore dei funghi si dividono in mitospore che essendo geneticamente identiche alle cellule somatiche dell’individuo che le produce danno luogo a riproduzione agamica e meiospore aploidi derivanti da individui diploidi che danno riproduzione gamica in quanto geneticamente diverse dalle cellule del genitore.