Patologia Generale

EFFETTI DELLE MUTAZIONI PUNTIFORNI SULL’INFORMAZIONE GENICA:

Sostituzioni nella regione non coding nessun effetto, alterazione nella regolazione di trascrizione



o traduzione (promotore o altri siti, in eccesso o in difetto) e alterazione nello splicing.

Mutazioni di Splicing

Se le sostituzioni avvengono nella regione non-coding o non capita nulla, o si hanno alterazioni

nella regolazione della trascrizione (colpiti enhancers o promotori), o ancora ci possono essere

alterazioni dello splicing. Il 50% delle mutazioni che provocano malattie alterano lo splicing.

Lo SPLICING, che determina il tipo di trascritto di solito diverso per tessuto, è regolato da una serie

di segnali classici o accessori.

I segnali classici corrispondono alle prime 2 basi prima e dopo un esone (siti donatori AG o

accettori GT di splicing): tutte le mutazioni che mutano questa collocazione sono deleterie. Tra gli

accessori sono invece importanti ESE (exonic splicing enhancers), ISE (intronic splicing enhancers)

e ISS (inhibitory splicing sites): sono tutte mutazioni difficili da evidenziare.

I segnali accessori regolano anche gli splicing alternativit tessuto specifici, che aumentano il

numero di proteine prodotte da un dato numero di geni (+/- domini e diversa regolazione). Questi

sono controllati a livello di tessuto, genere, situazione metabolica, stimoli e stadio di sviluppo: le

mutazioni inducono l’espressione di proteine inappropriate.

N.B.: il meccanismo di splicing utilizza 5 snRNA e 150 proteine, incluse chinasi ed elicasi.

Le mutazioni di splicing sono divisibili in 4 classi:

- MUTAZIONI IN CIS che alterano:

i siti CLASSICI: alterazione di nucleotidi del sito di splicing (doppietti, consensus,

 branch site, siti di legame per proteine regolatrici ese, ise, iss), perdita di una

porzione della proteina, allungamento, frameshift e troncamento (degradazione)

i SEGNALI ALTERNATIVI (rare)



- MUTAZIONI IN TRANS che alterano.

la funzione del meccanismo di SPLICING GENERALE (identificati in rare malattia)

o la REGOLAZIONE DELLO SPLICING ALTERNATIVO (alcuni tipi di cancro, distrofia

o miotonica)

Mutazioni in cis

Quando viene alterato un sito di splicing può avvenire una MUTAZIONE IN CIS, ovvero mutazioni

facenti parte del sito di splicing. Viene persa una porzione della proteina, compare una proteina

più lunga o, per la maggior parte dei casi, slitta la cornice di lettura (perdita di un esone dopo –AG-

o prima –GT-, che potrebbe anche portare ad un frameshift e quindi ad una degradazione. Se

l’introne è meno di 100basi, questo viene mantenuto –ritenzione- come se fosse un esone: anche

qui c’è degradazione) instabilità, troncamento…



In sostanza, le mutazioni in cis producono specie abnormi e alterano gli splicing alternativi

fisiologici.

Una mutazione della sequenza della proteina può creare un perfetto sito di splicing (sito criptico o

mutazioni sinonime), che compete con quello canonico e a volte lo sovrasta perché funziona

meglio. Viene dunque introdotto un pezzo di introne come fosse un esone, andando fuori frame.

Spesso però la mutazione non ha effetto completo (leaky) e non tutti i trascritti risultano anormali.

L’unico modo per trovare un sito criptico è analizzare il cDNA (retrotrascrizione dell’mRNA e

purificazione)

ESEMPI DI MUTAZIONE IN CIS

- emoglobinopatie HbE: nel codone 26 l’acido glutammico viene convertito a lisina e compare

un sito di splicing criptico esonico. Inoltre, è una mutazione leaky per cui solo il 60% di Hb è

variata, cosa che si traduce in una sintomatologia talassemica mite

- beta-talassemia IVSInt110: mutazione con effetto incompleto per cui il 20% dell’mRNA è

normale e l’80% utilizza il sito di splicing criptico. Il fenotipo più grave è beta+

- fibrosi cistica atipica: debolezza del sito di splicing nell’introne 8 del gene della CFTR. Nella

popolazione ci sono varianti polimorfiche: 5T (debole ed associato ad exon skipping), 7T o

9T. Se l’individuo ha un sito 5T, solo a volte avverrà lo splicing corretto e, se non avviene, la

proteina mutata viene degradata, con conseguente diminuzione dei canali Cl-.

Per la maggior parte i maschi omozigoti per la fibrosi cistica (problema al canale del Cl-)

sono infertili proprio per la chiusura dei dotti efferenti (oltre che avere problemi

gastrointestinali, di pancreatite cronica idiopatica e polmonari nel caso in cui la mutazione

non sia eterozigote).

Si può quindi inture che la penetranza è direttamente proporzionale alla lunghezza del sito.

Inoltre, si pensa che 5T leghi più faticosamente U2AF, interazione resa ancora più

fiddicoltosa dalla proteina TDP43, che impedisce l’inclusione dell’esone 9, legata al polyUG

Nomenclatura: IVS (intervening sequence; ex: IVSInt110 CA), o numero della base.

Più del 50% delle mutazioni avvengono per splicing (missense, sinonime e piccole indels) e ¼ delle

mutazioni sinonime alterano lo splicing.

Mutazioni in Trans

L’alteramento dello splicing può anche avvenire per una MUTAZIONE IN TRANS, quindi che si trova

su un’altra regione genomica, ma altera la trascrizione di altri geni.

Queste mutazioni alterano tutti gli splicing (meccanismo basale), compresi quelli che dipendono

dallo stesso modulatore deficitario (splicing alternativo). Infatti, vengono alterati i componenti

dello spliceosoma e/o di proteina ausiliaria che regolano lo splicing alternativo.

Le CONSEGUENZE DELLE MUTAZIONI DI SPLICING dipendono dall’effetto sulla proteina e dalla sua

funzione, per cui:

- Alterazione cornice di lettura codone di STOP trascritto degradato perché non

 

completo

- Mantenimento della cornice di lettura mancano comunque gli a.a. codificati dall’esone



mancante trascritto degradato e danno più o meno grave in base alla funzione della



malattia

Genotipo-Fenotipo

Effetto delle mutazioni

- LOSS OF FUNCTION

- GAIN OF FUNCTION qualitativa o quantitativa (ex: sindrome di Kennedy, malattia

neurodegenerativa)

Mutazioni con effetto differente nello stesso gene danno fenotipi/malattie diverse (malattie

alleliche).

Il tipo di trasmissione ereditaria dipende dalla quantità di prodotto necessaria all’organismo

(mutazioni LOF) ed è in rapporto con le modificazioni di funzione indotte dalla mutazione:

- Malattia recessiva: la malattia è dovuta solo alla perdita di funzione di entrambi gli alleli

- Malattia dominante: anche solo una riduzione di poco del prodotto provoca malattia; si

tratta di proteine strutturali o recettori

- Per certe malattie dipende dal tipo di prodotto stesso (ex: fibrosi cistica)

- Mutazione su una proteina con molti domini: gli effetti possono essere diversi

Un difetto esempio è quello dell’ipoxantina guanina fosforibosiltransferasi. Quando c’è un difetto

dell’enzima e la percentuale di attività è maggiore del 60% non c’è malattia, tra 8% e 60% si ha la

gotta legata all’X –cristalli di acido urico nelle articolazioni- (il gene è sul cromosoma X, quindi

colpisce i maschi), tra 0% e 8% si assiste a gotta e ritardo mentale (automutilazioni).

Altri esempi: recettore androgeni (sindrome di Kennedy o sindrome di Morris), gene RET

(carcinoma alla tiroide, sindrome di Hirschsprung…).

Ripasso dell’eredità

MALATTIA AUTOSOMICA DOMINANTE

In tutte le generazioni, i maschi e le femmine sono affetti con uguale frequenza, può essere

passata anche da maschio a maschio, ciascun figlio di un malato ha un rischio del 50% di

sviluppare la malattia. Il gene codifica per una proteina di cui è necessaria una dose pari a quella

presente nel soggetto normale (ex: proteina strutturale o recettore).

Esempi:

- COREA DI HUNTINGTON: grave demenza con movimenti anormali; incidenza di 1:20.000 e

penetranza completa (salti generazionali solo se la persona non si riproduce); la mutazione

è un’espansione nucleotidica CAG a penetranza completa nel gene dell’huntingtonina

(4p16.3).

Si assiste al fenomeno dell’anticipazione, perché il numero di triplette aumenta di

generazione in generazione; la causa è ancora sconosciuta.

- ACONDROPLASIA (di solito deriva da

genitori normali; il padre subisce una

mutazione de novo in un sito

estremamente mutabile, il FGFR):

1:10.000, gain of function; volto e corpo

caratteristici; non esiste una cura, ma si

può intervenire con interventi chirurgici

cruenti pre-puberali per accellerare

l’accrescimento (rottura delle ossa per

inserire sistemi di cavi per distanziare i

monconi da riunire).

Nel genoma ci sono almeno 3 FGFR, un

recettore caratterizzato anche da un

dominio transmembrana, dove ha sede la mutazione per l’acondroplasia. Mutazioni nello

stesso gene ma in domini diverse provocano patologie più gravi (displasia tanatofora,

mutazione terzo dominio chinasico) o più lievi (ipocondroplasia, mutazioni primo dominio

chinasico).

I mutati in FGFR2 presentano sindrome di Apert, causata dalla chiusura precoce delle suture

(‘fontanelle’) e i bambini presentano difetti nella disgiunzione delle dita

La stessa sindrome (Crouzon) poi può essere causata da mutazioni in domini diverse

- SINDROME EEC (mutazione di TP63, coinvolto nello sviluppo degli arti e degli annessi

cutanei; ectrodattilia, displasia ectodermica, labiopalatoschisi). La malattia ha penetranza

completa ed espressività variabile per geni modificatori e modificazioni epigenetiche e

stocastiche

Eccezioni: penetranza incompleta (ha il genotipo ma non il fenotipo) o espressività variabile

(gravità variabile, con espressione di diversi sintomi; dipende dal diverso background genetico per

i fratelli, o da un effetto stocastico per i gemelli), oltre che gli apparenti salti generazionali (il

malato muore prima di manifestare la malattia).

MALATTIA AUTOSOMICA RECESSIVA

I malati non sono in ogni generazione, ma si possono avere più malati in una generazione; maschi

e femmine sono affetti con uguale frequenza, talora i genitori sono consanguinei, il rischio è di 1:4.

Il gene codifica per una proteina per cui solo una drastica riduzione della dose porta a carenza (ex:

enzimi)

Esempi:

- MUCOPOLISACCARIDOSI (Sindrome di Hurler; difetto della coinvolti nella

-ialuronidasi

catabolizzazione di mucopolisaccaridi; i metaboliti si accumulano dando

epatosplenomegalie e ingrossamento anche di cervello e ossa, con conseguenti

deformazioni scheletriche progressive e ritardo mentale)

- FIBROSI CISTICA o mucoviscidosi: mutazione nel CFTR (locus 7p; 1:2000); secrezioni viscose

delle ghiandole esocrine= infezioni polmonari, maldigestione, insufficienza respiratoria ed

infertilità maschile; incidenza di 1:2000

MALATTIA X-LINKED

I maschi sono p