Biochimica clinica e patologia clinica

Biochimica clinica e patologia clinica A.A. 2020-2021

Patologia clinica - Prof.sse Pepe, Sticchi, Paniccia

Biochimica clinica - Prof.sse Fiorillo, Pinzani

Parte 1 (Pepe) - Patologia clinica

Emocromo-citometrico

È una delle tre analisi da fare ai pazienti quando per la prima volta fanno un controllo. Per capire a che specialista indirizzarlo queste analisi ci possono indicare quale tipo di problema possibile possono avere. Il sangue è fatto da cellule e plasma, e il sangue nell’adulto è 1/12 del peso corporeo, 5-6 litri, eritrociti 45% fatto da cellule e 55% da plasma. Gli eritrociti sono dischi biconcavi con diametro tra 6,5-8,5 µm con durata di vita di 120 giorni, importante per capire l’andamento temporale per un paziente con varie patologie. I valori della concentrazione di eritrociti è diverso tra uomini e donne, 4,3-5,9 milioni/mm³ per uomini e 4,0-5,1 per le donne.

Globuli bianchi granulociti

I globuli bianchi si dividono in polimorfonucleati (granulociti) e monomorfonucleati. I granulociti hanno il nucleo, non si dividono e moltiplicano e trascorrono 10-12 ore in circolo poi passano ai tessuti. Sono neutrofili, con diametro di 12-14 µm, e hanno un nucleo multilobato e ricco di granuli. Le dimensioni sono importanti per poter poi andare a analizzare i vetrini, ovviamente è importante per questo il colore, il numero e la forma dei nuclei ecc. Gli eosinofili (fig. a sinistra) contengono granuli grandi, colorati di rosso, e hanno un diametro tra 12-17 µm. I basofili (fig. nel mezzo) hanno nucleo bilobato con granuli anche scuri e diametro di 14-16 µm. Hanno la capacità di intrappolare i metalli pesanti, comportandosi da macrofagi, e quando abbiamo intossicazione da metalli pesanti (es. piombo) si riempiono di granuli all’interno. I monociti (fig. a destra) invece sono cellule grandi con un citoplasma vacuolato (C) e nucleo (N) irregolare, a forma di rene, detto reniforme. I piccoli linfociti hanno un diametro di 6-9 µm, con nucleo che occupa il 90% della cellula e hanno nucleo piccolo e si moltiplicano rapidamente, vivono poco o molti anni, viaggiano continuamente e la loro permanenza in circolo è solo parte della loro vita, e sono responsabili della competenza immunitaria.

Piastrine

Le piastrine sono frammenti cellulari con diametro di 1,5-3,5 µm, sono senza nucleo e trascorrono da 8-10 giorni nel circolo, e hanno numero tra 150 mila e 450 mila per mm³. I globuli bianchi in totale sono tra 4 mila e 10 mila per mm³. Questi non sono divisibili in uomo e donna.

Prelievo

Il prelievo e il campionamento del sangue è fondamentale, deve essere condotto con delle caratteristiche e modalità precise:

• Deve essere fatto in modo tale da non alterare il risultato finale, e deve essere fatto in base al tipo di esame. Preferibilmente nel centro di patologia si usa una siringa con ago, per non creare un’aspirazione (che abbiamo nel vacutainer, che si compone di farfallina, capillare e aspiratore) che potrebbe essere causa di attivazione di meccanismi cellulari che alterano gli esami, e fondamentale è anche la scelta dell’anticoagulante.
• Bisogna rispettare le regole della sicurezza e dell’igiene, ovvero usare materiale sterile e monouso; i vacutainer sono preferibili perché riducono il rischio connesso al contatto e alla manipolazione del sangue e riducono il rischio di emolisi.
• L’indagine di laboratorio deve essere fatta a breve tempo dal prelievo, oppure se non è possibile, il campione prelevato va tenuto in modo particolare, in frigo a +4°C fino al momento del prelievo.
• Il tipo di prelievo è fondamentale, se prendiamo il sangue venoso, arterioso o capillare, arterioso per emogas analisi. Sangue venoso periferico è quello più usato e la quantità è variabile, tra 5 e 10 mL. Il sangue capillare viene preso pungendo un dito, facendo uscire una goccia e prelevando il sangue con un capillare (ovviamente il dito viene prima disinfettato) e ormai viene fatto con degli apparecchi che hanno già di per sé un piccolo ago. È vantaggioso sicuramente per i bambini molto piccoli appena nati a cui si fa al tallone, ma anche nelle persone anziane. Di solito il dito preferito è il 3° o il 4°, da cui si ottiene la miglior goccia di sangue.
• Va eseguito a digiuno (dopo 8-12 ore dall’ultimo pasto) è il momento in cui si fa il prelievo soprattutto per non creare interferenze emolisi. Per quanto riguarda il problema è importante per non fare interferenze causate da enzimi eritrocitari che possono modificare il metabolita ricercato o l’analisi di enzimi indicatori della patologia.

Il prelievo di sangue venoso vede il rapporto tipico di 45% di cellule e 55% di plasma, e lo vediamo quando il sangue si centrifuga a bassa velocità ottenendo in pochi minuti ciò che otterremmo anche lasciando sedimentare da solo. Il plasma è fatto da più sostanze. Il sangue trasporta cellule che sono importanti per la difesa, infezioni, e sono funzioni essenziali perché se avessimo un tessuto o organo completamente privo di sangue, anche per pochi minuti, questo va in necrosi facilmente. Come distinguiamo globuli rossi da bianchi e piastrine e come li separiamo? Globuli bianchi e piastrine in realtà si differenziano perché c’è uno straterello tra la parte di eritrociti e plasma. Il plasma è per definizione sangue privo di elementi corpuscolati e si ottiene da sangue con anticoagulante dopo separazione da parte cellulare in seguito a separazione con centrifuga a bassa velocità (2000 rpm per 10-15 minuti) perché altrimenti si distruggerebbero le cellule. Il siero è il plasma senza fibrinogeno. Si ottiene dal sangue interno con aggiunta di anticoagulanti e separazione. I principali anticoagulanti sono il sodio o litio eparina, un mucopolisaccaride, anticoagulante biologico presente nell’organismo. Interferisce però sulle determinazioni chimico-biologiche (soprattutto sulla PCR) e altera la morfologia e colore dei leucociti e determina aggregazione piastrinica. L’EDTA (acido etilediammino acetico, sale dipotassico, più solubile del disodio) si usa in concentrazione di 2g/dl (le concentrazioni sono ben precise, bisogna ben immaginare che se c’è eccesso o difetto della concentrazione, o il sangue non si fluidifica abbastanza, oppure se in eccesso potrebbe alterare soprattutto le cellule). È un chelante degli ioni calcio, può dare interferenza ma è il migliore perché non altera volume eritrociti, riduce al limite la lisi dei leucociti e limita l’aggregazione piastrinica ed è rapidamente solubile nel sangue.

Emocromo-citometrica

Quindi diciamo, l’analisi ci permette di:

• Determinare il numero dei diversi tipi di cellule presenti nel sangue (piastrine, globuli bianchi o leucociti, globuli rossi o eritrociti).
• L'ematocrito (la percentuale in volume della parte corpuscolata del sangue separata dal plasma).
• La quantità di emoglobina.
• Il volume globulare medio (cioè la grandezza media dei globuli rossi).
• Il contenuto medio di emoglobina del globulo e la sua concentrazione media.

I fattori di disturbo per queste analisi sono e riguardano il conteggio di leucociti, eritrociti e piastrine. Per i leucociti influenzano le soluzioni “sporche” e la forma immatura nucleata della serie rossa. Per gli eritrociti troviamo sempre le soluzioni sporche, agglutinine a freddo, leucocitosi e piastrine giganti. Per il conteggio di piastrine possiamo avere sangue parzialmente coagulato, così come contaminazione batterica o aggregazione spontanea, o ancora soluzione sporca.

Metodiche emocitometriche

Le metodiche emocitometriche non automatiche sono l’emocitometria e possono sostituirsi a analisi automatizzate in condizioni particolari, soprattutto di emergenza, in laboratori grossi di riferimento. Le tecniche manuali possono essere usate con campioni particolari che gli strumenti automatici non possono analizzare per esempio. Costituiscono un metodo di confronto per misurazioni automatiche, e infine vengono tuttora utilizzate estensivamente per le conte cellulari su liquidi biologici. Ma perché usiamo soprattutto però analizzatori automatici? Perché è molto più alta la qualità dei risultati, non c’è errore di misura e di preparazione dei campioni (risparmio anche dei materiali perché tutto viene fatto iper-preciso), inoltre abbiamo un risparmio netto di costi globali di lavorazione con efficiente riproducibilità dei dati (un’analisi manuale fatta da più operatori infatti può portare a vari risultati diversi ovviamente con difficile riproducibilità dei dati).

Tornando ora ai preparati, è fondamentale che nella preparazione del vetrino si faccia in modo tale da non sovrapporre nessun globulo rosso, perché dobbiamo vedere la colorazione, la morfologia, le caratteristiche ecc. Nota che essendo leucociti migliaia e piastrine centinaia di migliaia, sono irrilevanti nei confronti di eritrociti che sono in termini di milioni. E se lo striscio è fatto bene nel vetrino possiamo distinguere tutti i tipi di cellule che ci interessa senza troppe difficoltà. Parlando sempre di automazione, si vede che l’esecuzione di carichi quotidiani molto spinti ha richiesto lo sviluppo di alcune caratteristiche operative volte a migliorare la velocità e la precisione dei conteggi e la riduzione di costi. Gli analizzatori ematologici automatici sono fatti in sospensioni diluite di cellule che vengono trasportate in un dispositivo sensibile (spesso un canale, es. capillare) che ne rileva la presenza, il numero e le dimensioni e altre eventuali caratteristiche chimico-fisiche. Ci possono dare analisi che più o meno hanno questo aspetto: quello dei globuli bianchi (numero a alta risoluzione di una popolazione leucocitaria), e notiamo una distribuzione di quelle macchie gialle diversa, in tre gruppi, che in genere non è un buon segno. E nell’andare a rilevare la conta delle varie cellule, vediamo che accanto ai valori rilevati ci sono quelli di riferimento (una media) con le lettere L o H per indicare se sono più bassi (Low) o alti (High) rispetto al riferimento. Il tutto lo vediamo anche in grafici con curve, ad esempio possiamo avere due picchi nell’analisi per esempio dei globuli rossi e uno dei due picchi rileva un valore sbagliato e anormale.

Striscio di sangue

Per fare queste analisi dobbiamo allestire uno striscio di sangue periferico di una goccia su vetrino. Deve essere strisciata in modo uniforme sul vetrino e si fa tutto manualmente. La parte di vetrino “iniziale” è un vetrino molare, particolare detto la cui superficie è perfetta, non ci sono spazi interni che non rendono lineare la superficie, allora con un altro vetrino viene messo a contatto con il vetrino da superficie molare, e si striscia lungo tutto il vetrino. Si fa un monostrato dove le cellule varie NON saranno sovrapposte (fondamentale). Vediamo cosa potremmo avere, per esempio un aumento dei globuli bianchi totali, di cui i valori principali ne abbiamo già parlato, e possono essere dati da un’infezione batterica, infiammazione. Solitamente se aumentano i neutrofili l’infezione è di natura batterica, se aumentano i linfociti è tendenzialmente di origine virale o infezione da parassiti, oppure è indice quest’ultimo anche di allergia, sebbene con variazioni estremamente minori. Quando i globuli bianchi nel totale aumentano in modo eccessivo, da 30 mila a centinaia di migliaia, dobbiamo sospettare a leucemia. Vediamo ora qua sotto i valori normali dei globuli bianchi e poi analizziamo le anomalie:

Valori normali e anomalie

Valori sballati di neutrofili (considerati invece valori normali quando sono tra 40%-74% rispetto al totale dei leucociti) possono essere dati da artrite reumatoidi, emorragie, gotta ecc. Valori invece inferiori al normale possono essere determinati da cirrosi epatica, epatiti croniche, influenza ecc. Parlando invece di valori anormali di basofili, i cui valori normali sono da considerare quando sono tra 0-0.2% del totale dei leucociti (con numero assoluto di 0-400). Valori superiori possono essere dati da epatite acuta, insufficienza renale cronica, leucemia, morbillo, pertosse. I valori invece inferiori possono essere dati da gravidanza, infezioni, ipertiroidismo ... Gli eosinofili sono nei valori normali tra 0 e 7% del totale dei leucociti (con valore assoluto di 0-80). Valori superiori al normale sono causati da allergie, morbo di Addison, morbo di Hodgkin e neoplasie maligne. Valori inferiori sono considerabili causati da interventi chirurgici, shock anafilattico, traumi e farmaci cortisonici. I monociti hanno un valore normale tra 3.4%-11% con valore assoluto tra 200 e 1000, valori superiori sono dati da morbo di Chron, malattia di Hodgkin ecc. inferiori invece da anemie e irradiazioni. I linfociti hanno valori normali tra 19%-48% con valore assoluto tra 1000 e 3200, con valori superiori dati da artrite, uso di farmaci, pertosse, mononucleosi ... mentre valori inferiori al normale si hanno con l’AIDS, insufficienza renale, linfomi, neoplasie maligne ecc. Infine vediamo alterazioni delle piastrine per cui possono dare le patologie dell’emostasi, emorragie e trombosi. Emorragia ovviamente se le piastrine diminuiscono, mentre trombosi se aumentano. Come valori di riferimento sono presi un numero di 150.000-400.000 /mm³.

Possiamo notare anche alterazioni normalissime, possono aumentare i globuli rossi per esempio per chi vive a altitudini elevate, oppure se si hanno casi di disidratazione, diarrea o beta-talassemia. Abbiamo valori inferiori in emorragie, crisi emolitiche e diminuita eritropoiesi. Possiamo avere una falsa diminuzione e si parla di emodiluizione.

Emoglobina

L’esame dell’emocromocitometrico comprende anche la misura dell’emoglobina, 13-17 g/dL per l’uomo, e 12-16 g/dL per la donna e vari valori per i bambini nelle varie età. Possiamo avere normalissime variazioni per differenza tra razze, per esempio la razza nera ha un valore lievemente più inferiore alla bianca caucasica, di circa 0,5-1 g/dL. Ma anche nelle persone anziane e in gravidanza abbiamo una lieve diminuzione. Mentre i fattori preanalitici che causano alterazione del dosaggio sono il laccio emostatico tenuto stretto per più di un minuto durante il prelievo (e allora va rimosso e aspettato un po’ di tempo), oppure nei soggetti che vivono a elevate altitudini e anche però nei fumatori. Quindi riassumiamo i principali valori che troviamo per l’esame emocromo-citometrico per il conteggio dei globuli rossi e per la misura dell’emoglobina:

• Uomo: 40-52%
• Donna: 32-47%

L’altro valore fondamentale è l’ematocrito, che rappresenta il volume occupato dei globuli rossi nel sangue totale. I valori aumentano in caso di laccio emostatico tenuto per più di un minuto durante il prelievo, mentre diminuisce con le gravidanze.

Parametri derivati

• MCV, volume corpuscolare medio. Si calcola in femolitri (fL) con la formula Ht x 10/GR, e il valore normale è 80-100 fL.
• MCH, emoglobina corpuscolare media. Si calcola in picogrammi (pg) con la formula Hb x 10/GR e il valore normale è 27-33 pg.
• MCHC, concentrazione emoglobinica corpuscolare media. Si calcola in g/dL, con la formula Hb/Ht x 100 e il valore normale è 33-36 g/dL.
• RDW, ampiezza della distribuzione dei globuli rossi (GR).
• HDW, ampiezza della distribuzione della concentrazione corpuscolare di Hb.

La valutazione di questi valori permette di valutare, riduzione di Hb in caso di anemia, mentre aumento di eritrocitosi. Quindi se osserviamo l’emoglobina, valori superiori sono associati a diarrea, shock, ustioni ecc. Mentre i valori inferiori al normale ci interessano di più perché sono associati a tutte le anemie e anche alle patologie croniche. Per l’ematocrito possiamo dire che valori superiori alla norma sono associati a diabete, insufficienza renale, e anche ad alcolismo. Mentre valori inferiori possono essere dati da anemia, carenza di vitamina B12, emorragie e patologie croniche.

Diametro degli eritrociti e MCV

Sappiamo che gli eritrociti hanno diametro di 7-8 µm, con MCV esprimiamo volume corpuscolare medio e esprime rapporto tra massa e numero di eritrociti. Con l’MCV possiamo calcolare che con valori sotto a 80 fL il diametro sarà ovviamente minore e parleremo di microciti, indice di difetto di sintesi di emoglobina con immissione in circolo di elementi inferiori al normale, associati a anemie sideroperniche, anemie talassemiche, anemia saturnina e anemie da malattia infiammatoria cronica. Si parla di normociti in valori normali, mentre quando il valore dell’MCV è superiore a 100 fL ma inferiore a 115 fL, e troviamo macrociti nelle sindromi mielodisplastiche, epatopatia e reticolocitosi. Si parla invece di megaloblasti se MCV è sopra a 115 fL e abbiamo in anemia perniciosiformi.

Anisocitosi e RDW

Quando guardiamo lo struscio del vetrino e guardiamo l’eterogeneità di globuli rossi, possiamo trovare una anisocitosi. Usiamo il RDW come coefficiente di variazione della distribuzione del volume eritrocitario, con valore normale tra 11.5-14.5%. Valori superiori indicano una estrema disomogeneità a livello del volume della popolazione eritrocitaria. Per esempio vediamo che nell’ “anemia da carenza di ferro”, MCV diminuisce e RDW aumenta, mentre nella talassemia minor MCV diminuisce.