Organi e funzioni

Organi e funzioni

Biotecnologie anno 2018-2019

Appunti delle lezioni dei prof. Rocchetti e Zaza
Alice Giussani

Membrane cellulari e trasporto

La membrana è costituita da fosfolipidi che formano il doppio strato insieme al colesterolo, carboidrati e proteine. I fosfolipidi sono anfipatici:

• Code idrofobiche
• Teste idrofile

Vi è la componente zuccherina dei carboidrati che formano glicolipidi o glicoproteine. Il doppio stato è uno strato isolante, è una barriera che separa un ambiente intracellulare con certe concentrazioni da uno extracellulare con altre concentrazioni. I glicolipidi e le glicoproteine danno stabilità, operano nella comunicazione tra cellule e il riconoscimento cellulare e nella risposta immunitaria.

La membrana è importante perché permette il trasporto di determinate sostanze e l'esclusione di altre. Presenta diversi gradi di permeabilità nei confronti delle diverse sostanze. È permeabile a gas (ossigeno, CO₂) piccole molecole apolari, piccole molecole come l'acqua e l'urea apolari o dipolari. Le molecole di maggiori dimensioni non passano ed è necessario un sistema di trasporto. Le molecole cariche anche se piccole non possono passare. Le dimensioni della molecola e la sua polarità sono dei criteri di selezione.

Tipi di trasporto

I trasporti si dividono in base alla richiesta di energia:

• Attivi che richiedono energia
• Passivi

Trasporto passivo

La sostanza viene trasportata secondo il suo gradiente di concentrazione, da un ambiente più a uno meno concentrato, questo trasporto utilizza energia del moto molecolare.

• Diffusione
  • Semplice: la molecola può oltrepassare il film lipidico, è necessaria solo una differenza di concentrazione
  • Facilitata: le molecole necessitano di un trasportatore (proteina carrier, canale ionico)

Trasporto attivo

Sono trasporti per cui una sostanza viene spostata contro gradiente di concentrazione verso l'ambiente in cui è più concentrata, per fare ciò è necessaria energia, nei trasporti attivi primari questa energia è fornita dall'ATP: è presente un ATPasi che può idrolizzare il legame del fosfato per liberare energia (es. sodio-potassio ATPasi). Nei trasporti attivi secondari il trasporto è sempre contro gradiente, ma non utilizza direttamente l'energia dell'idrolisi dell'ATP, ma la sfrutta in modo indiretto, non è presente un ATPasi, ma sfrutta la presenza di un'altra ATPasi nella cellula.

Vi sono anche trasporti mediati da vescicole dove il trasporto coinvolge una vescicola (endocitosi, esocitosi, transcitosi).

Leggi fondamentali

Vi è flusso se vi è una forza che spinge il flusso, il flusso è direttamente proporzionale alla forza che lo genera. Nel trasporto passivo l'energia è intrinseca nel sistema, nel trasporto attivo l'energia deve essere fornita dall'esterno. L’energia che si traduce in lavoro di trasporto è parte dell’energia libera del sistema (trasporto passivo) o è fornita dal metabolismo (trasporto attivo).

La forza che spinge il flusso è il gradiente di concentrazione, o forza chimica → un soluto tende a entrare o uscire a seconda della distribuzione della sua concentrazione. Oltre alla forza chimica bisogna considerare anche la forza elettrica → gradiente elettrico che agisce sugli ioni a seconda della propria carica.

Tutte le cellule hanno un potenziale di membrana interno negativo e positivo all'esterno, quindi la forza elettrica per un catione è in uscita, mentre per un anione è in uscita. La combinazione delle due è la forza elettro-chimica.

Tutti i sistemi tendono al minimo di energia, se un sistema è ad alta energia ha un elevato potenziale energetico e tenderà a dissipare questa energia passando a uno stato a basso potenziale, per fare ciò vi è una differenza di potenziale tra i due stati e è questa differenza di potenziale che causa il flusso di materia. Quando la differenza di potenziale scompare e il sistema raggiunge l’equilibrio, la diffusione cessa.

Energia A > Energia B
Per diventare:
Energia A = Energia B
Durante questo processo si libera energia, persa dal sistema A

Diffusione semplice

È una diffusione passiva ed è descrivibile dalle leggi di Fick:

• Diffusione in fase libera
• Diffusione con membrana

Prima legge di Fick

La diffusione in fase libera è il processo mediante il quale si mescolano atomi o molecole dotati di un moto casuale o browniano. La concentrazione tende a diminuire lungo la direzione del trasporto. Non richiede energia, è un trasporto secondo gradiente, è rapido e direttamente proporzionale alla temperatura poiché si basa sul moto browniano delle molecole che è direttamente proporzionale alla temperatura, ed è inversamente proporzionale alla dimensione. Vi è un flusso da A a B e da B ad A, ma ciò che conta è la velocità di diffusione netta, quando le velocità in un senso e nell'altro sono uguali siamo all'equilibrio. La concentrazione col tempo raggiunge l’equilibrio, ma prima sarà diversa in ogni piano perpendicolare a x ovvero all’asse di diffusione.

Per ogni tratto infinitesimo dx ci sarà una caduta infinitesima di concentrazione dc che darà luogo al flusso infinitesimo dn/dt (flusso di moli che passano nel tempo infinitesimo dt). Il flusso infinitesimo è direttamente proporzionale al gradiente ovvero alla forza che lo genera (dc/dx).

Il flusso infinitesimo è inversamente proporzionale a x e direttamente proporzionale a C. Vi è un segno meno perché la concentrazione nel sito di partenza tende a diminuire → caduta di concentrazione. Il coefficiente di diffusione tiene conto delle caratteristiche del soluto e del solvente.

T = temperatura
N = numero di Avogadro
f = coefficiente di attrito (6πηR → dipende dal raggio ipotizzando la sfericità)

Il coefficiente di diffusione D dipende da:

• Temperatura T
• Caratteristiche fisico-chimiche di soluto e solvente
  • Raggio
  • Viscosità liquido

È almeno 10000 volte più grande nei gas che nei liquidi.

Diffusione attraverso la membrana (seconda legge di Fick)

Le molecole possono attraversare più o meno agevolmente il film lipidico. Vi è un flusso secondo gradiente che avviene a livello della membrana:

• Dalla fase acquosa al doppio stato, questo dipende dal coefficiente di ripartizione K (olio-acqua), tanto più è alto tanto più passa facilmente
• Attraversamento fase lipidica, la velocità di trasporto aumenta proporzionalmente al coefficiente di diffusione della sostanza
• Migrazione nel citosol

La seconda legge di Fick: J = flusso, P = coefficiente di permeabilità, C₁ - C₂ differenza di flusso. Nel punto in cui i due flussi sono uguali il flusso netto sarà zero.

All'interno di P vi sono tutti gli altri parametri: K = coefficiente di ripartizione che è il rapporto della concentrazione del soluto nei lipidi rispetto a quello nell'acqua → permeabilità, D = coefficiente di diffusione della molecola, A = area della sezione di scambio, X = distanza dove le due concentrazioni sono calcolate.

La velocità di diffusione dipende dalla capacità della molecola che diffonde di sciogliersi nello strato lipidico della membrana. Il tasso di diffusione attraverso una membrana è direttamente proporzionale all’area della superficie di membrana ed è inversamente proporzionale allo spessore della membrana.

La diffusione semplice segue un andamento lineare, non è un flusso che va a saturazione, la pendenza della retta mi dà il coefficiente di permeabilità. Stiamo parlando di non elettroliti.

Flusso dell'acqua attraverso una membrana biologica

Osmosi: flusso di acqua che si ha attraverso una membrana semipermeabile a causa della differenza di concentrazione di un soluto. Segue il suo gradiente di concentrazione → osmosi. Si va da un ambiente più diluito a uno meno diluito. Il flusso è attraverso una membrana semipermeabile quando vi è una differenza di concentrazione tra i due ambienti, la membrana è permeabile al solvente, ma non al soluto → si genera una pressione osmotica che richiama acqua. La membrana presenta dei pori che permettono il passaggio dell'acqua verso l'ambiente da diluire. Si muove fino a quando non vi è una forza uguale e contraria che controbilancia il passaggio di acqua, la pressione osmotica è la forza da applicare per fermare l'ulteriore passaggio di acqua.

Equazione van't Hoff: pressione teorica π = pressione osmotica. È una pressione teorica perché si sta prendendo in considerazione una membrana 100% permeabile al solvente. Pressione reale: Δ = Δg = numero di particelle per mole in soluzione (osm/mole), σ = coefficiente di riflessione (da 0 a 1), se è 1 il soluto viene riflesso al 100% → posso usare l'equazione di van't Hoff e quindi la pressione reale è uguale a quella teorica, se è zero la pressione osmotica è zero perché il soluto non viene riflesso e quindi passa, la membrana non è semipermeabile e quindi non vi è pressione osmotica. Tiene conto del fatto che un po' di soluto riesce a passare.

Se la cellula viene messa in un ambiente iposmotico, l'acqua tende ad entrare nella cellula, in un ambiente iperosmotico l'acqua tenderà ad uscire. L'acqua essendo un dipolo presenta una distribuzione di carica. Dove è necessario un grande flusso d'acqua non mi posso basare su un semplice passaggio delle molecole attraverso un film lipidico → vi sono dei canali detti acquaporine ed è una diffusione facilitata.

Diffusione facilitata

Si parla sempre di trasporto passivo, ma vi sono molecole che non riescono passare il film lipidico e necessitano vettori:

• Canali ionici
• Carrier

I canali ionici sono proteine intrinseche di membrana con un poro centrale che attraversano tutto il doppio strato, passano da uno stato aperto a uno chiuso. Presentano dei filtri di selettività per le molecole che devono trasportare (es. canale sodio-potassio) che dipendono dal grado di selezione del canale.

I carrier possono essere proteine estrinseche che funzionano per cambiamento conformazionale grazie al quale vi è il trasporto da una parte all'altra della membrana, sono altamente specifici per il soluto. I trasportatori si legano al soluto in modo stereospecifico, andando poi contro a cambiamenti conformazionali che mediano il trasferimento transmembrana del soluto. Le proteine canale costituiscono un poro idrofilico attraverso cui il soluto può attraversare il doppio strato lipidico.

Il passaggio avviene sempre in 2 fasi:

• Passaggio all'interno del canale o del carrier
• Passaggio all'esterno del canale o del carrier

Vi è sempre uno stato di transizione, non è mai un flusso continuo.

Trasporto di cloro e bicarbonato (due anioni)

Se vi è legato uno non vi è legato l'altro, il legame del primo ligando causa una variazione conformazionale per cui viene internalizzato e una volta staccato si può legare il secondo ligando che causa a sua volta un cambiamento conformazionale.

I carrier hanno dei siti di binding per determinati soluti quindi sono altamente specifici, vi può essere un fenomeno di competizione. È un flusso che va a saturazione, non continua ad aumentare all'aumentare del soluto. La velocità non cresce linearmente.

Segue la cinetica di Michaelis-Menten: C+ S → CS. È la stessa cinetica di funzionamento degli enzimi.

Km = concentrazione a cui si ha la metà del flusso massimo. È sinonimo di affinità per il carrier, se aumenta l'affinità la Km diventa più piccola perché basta meno soluto per avere al semi-saturazione. All’aumentare del gradiente di concentrazione, il flusso transmembranario ha un aumento iperbolico, tendendo asintoticamente a un valore che corrisponde al flusso massimo.

Per diffusione facilitata si intende una diffusione passiva mediata da carrier o canali ionici.

• Elevata specificità
• Flusso va a saturazione (cinetica di Michaelis-Menten)
• Il carrier ha dei siti specifici di legame, vi possono essere substrati con struttura simile che possono legarsi al carrier, ma non essere trasportati inibendo l'attività del carrier che non può legare il substrato vero e proprio

Inibizione competitiva

L'inibitore va a legarsi nello stesso sito di binding del substrato entrando in competizione con il substrato, cambia l'affinità del carrier per il substrato → cambia la Km (aumenta), basta aumentare la concentrazione del substrato per spiazzare l'inibitore. Si raggiunge sempre lo stesso flusso massimo.

Inibizione non competitiva

L'inibitore si lega non nello stesso punto del ligando, ma in un sito diverso inibendo l'attività del carrier specifico, in questo caso non basta aumentare la concentrazione del substrato → cambia il flusso massimo. Vi possono essere casi di inibizione mista in cui varia sia Jmax che Km.

Canali ionici

Sono delle proteine intrinseche di membrana con all'interno un poro idrofilico che permette il passaggio più o meno selettivo degli ioni. Il canale per il sodio è molto selettivo, discrimina tra cationi ed anioni e tra cationi diversi.

Canali voltaggio dipendenti

Si aprono solo con variazioni del potenziale a cavallo della membrana, sono i più selettivi in assoluto, la loro permeabilità va a decrescere in condizioni non fisiologiche.

Gli ioni hanno una densità di carica, un raggio molecolare diverso e in un ambiente idrofilo sono dotati di un alone di solvatazione, una serie di molecole d'acqua attratte dalla carica dello ione, nel momento in cui passano del canale perdono l'alone di solvatazione per riacquisirlo all'interno. I canali voltaggio-dipendenti sono in grado di riconoscere lo ione all'interno del poro grazie a filtri di selettività. La carica del sodio è uguale a quella del potassio, ma il sodio ha un raggio minore quindi più attrazione dell'acqua, quindi in soluzione con l'alone è più grande dello ione potassio, dentro il poro il sodio perde l'alone di idratazione per interagire con il filtro di selettività. I canali ionici possono essere considerati degli enzimi perché abbassano l’energia di attraversamento della membrana.

I canali possono essere normalmente aperti (canali passivi) quindi gli ioni si muovono secondo la forza elettron-motrice ovvero secondo il gradiente elettrochimico, vi sono anche quelli ad accesso variabile che si attivano solo in alcune condizioni:

• Voltaggio dipendenti (VOC)
  • Sodio, calcio, potassio, cloro
• Ligando dipendenti (ROC)
  • Acetil-colina (sinapsi-neuromuscolare), GABA, glicina, glutammato
• Dipendenti da secondi messaggeri intracellulari
• Attivati tramite un'interazione con il citoscheletro (attivazione meccanica) → stretch attivati

La membrana a riposo presenta delle cariche positive dal lato extracellulare e negativo dalla parte intracellulare, i canali si aprono in seguito a depolarizzazione ovvero con l'inversione delle cariche (l'interno diventa positivo), tutti si aprono in depolarizzazione tranne il canale pacemaker, responsabile della generazione del ritmo cardiaco, si apre quando il potenziale diventa più negativo. Un ROC è un canale che si apre quando vi è legato determinato ligando, senza il legame con il ligando non si apre. Vi sono dei canali la cui apertura è regolata da un secondo messaggero (CNG) o da una fosforilazione dal lato intracellulare.

Canali voltaggio dipendenti

I canali voltaggio dipendenti sono fondamentali nelle cellule eccitabili ovvero quelle cellule in grado di scatenare un potenziale d'azione nei neuroni e nelle cellule muscolari generano una risposta tutto o nulla. Sono i canali più selettivi e discriminano anche tra cationi diversi, si aprono se c'è una variazione di potenziale della membrana quindi si aprono sopra una certa soglia di attivazione. Si aprono superata una soglia poiché presentano un sensore del voltaggio che è una porzione del canale ricca di aminoacidi carichi positivamente, quando il potenziale diventa positivo si ha una repulsione elettrostatica che permette l'apertura del canale. Vi sono 6 segmenti transmembrana con un N e C terminale dal lato intracellulare e una serie di...