Mutagenesi 2013 2014

Mutagenesi ambientale

Definizioni

Ambiente, def.: “Condizioni esterne che causano danni alla salute umana; tutto ciò che non è genetico”. Per cui si parla di stile di vita, agenti biologici naturali e prodotti, esposizioni professionali, etc... Tutto ciò che non è genetico si può modificare, quindi tutti i determinanti non genetici sono modificabili. La maggior parte di questi provocano inquinamento e contaminazione.

Nota Bene: l'inquinamento è diverso dalla contaminazione in base alla quantità di sostanze inquinanti. A maggiori quantità, corrisponde l'inquinamento. L'ambiente causando danni alla salute umana, ne provoca patologie che quindi saranno, in una certa percentuale, di etiologia ambientale.

Esposoma

Tutte le diverse esposizioni a cui è sottoposto l'uomo, sono racchiuse nel termine esposoma. Ci sono:

• Esposizioni endogene: metabolismo, infiammazioni, stress, invecchiamento.
• Esposizioni esterne: dieta, stili di vita, inquinamento, radiazioni.
• Esposizioni esterne generali: stato sociale, psicologico, clima educazione.

Epigenoma

Epigenoma, def.: “Funzione genica regolata da meccanismi che non alterano il DNA ma attivano determinati geni” infatti riguarda per esempio la traduzione dell'mRNA in proteine che vengono codificate da geni diversi. Nell'epigenoma troviamo:

• Meccanismi epigenetici (non genetici);
• Programma di espressione genica;
• Sistema cellulare dell'organismo.

L'epigenoma guida il differenziamento cellulare di un organismo che quindi, avendo nelle cellule lo stesso DNA, sarà costituito da epigenomi diversi. Anche qui esiste un'interazione ambiente-epigenoma (come l'interazione ambiente-genoma), solo che nel caso dell'epigenoma, l'ambiente è in grado di modificarlo direttamente senza però cambiarne il genoma, anche perché quest'ultimo è maggiormente protetto dai suoi sistemi di riparazione che l'epigenoma invece non ha. Le modifiche dell'epigenoma sono dette epimutazioni.

Risposta tossicologica

Risposta tossicologica, def.: effetto(i) delle sostanze estranee entrate nell'organismo.

Tossicologia, def.: scienza che studia la tossicità (agente o sostanza che causa variazioni non fisiologiche in un sistema biologico), che può essere:

• Generale (acuta, subacuta, subcronica)
• Speciale (cancerogenesi e teratogenesi)

Per avere un effetto tossico si devono considerare le strutture molecolari della sostanza in esame e anche l'agente patogeno in azione. Inoltre, va determinata la lipofilicità o idrofilicità della sostanza e la sua quantità esistente nell'organismo, cioè la dose, che può essere di soglia o senza effetto.

Tossicodinamica

Tossicodinamica studia l'evoluzione nel tempo della sostanza estranea nell'organismo, considerando l'equilibrio tra:

• Assorbimento (vie d'entrata)
• Distribuzione (sistema attraverso cui la sostanza giunge fino all'organo bersaglio)
• Metabolismo (metodo di degradazione della sostanza in funzione della sua eliminazione)
• Escrezione (espulsione effettiva dall'organismo)

Queste sostanze a livello cellulare procurano: effetti genotossici, quando modificano permanentemente il materiale genetico e quindi portano ad una mutazione, oppure ad un effetto citotossico quando si altera l'intera fisiologia cellulare.

Genotossicità e citotossicità

Nel caso della genotossicità, la cellula continuerà a replicarsi ma avendo un'alterazione dell'informazione genetica possono dare o mutazioni puntiformi/cromosomiche (se viene alterata la sequenza nucleotidica) o ripetizioni di sequenze di basi o un cambiamento nel numero di cromosomi (se vi è un'alterazione numerica della sequenza di basi).

In caso di citotossicità la cellula non si replica più quindi il danno può essere reversibile quando si blocca la proliferazione cellulare perché viene alterato l'apparato mitotico, oppure irreversibile se la cellula va incontro a morte programmata (apoptosi) e non (necrosi).

Test di mutagenesi

Come si individuano questi effetti? Attraverso dei test di mutagenesi che ci permettono non solo di riconoscere le alterazioni del materiale genetico, ma anche l'effetto epigenetico: con questi test si identificano le sostanze responsabili della mutazione. Le loro strutture molecolari e i loro meccanismi d'azione.

Siccome il DNA è uguale per tutti i sistemi cellulari, si sono creati dei test per ogni tipo di cellula (procariotica, eucariotica, somatica e germinale) che si possono isolare in vivo, ex vivo o in vitro, oppure da uno specifico organo cui appartengono.

Mutazioni

Qualsiasi cambiamento permanente nella struttura del materiale genetico, trasmissibile ad una generazione successiva, è detto mutazione. Le mutazioni creano variabilità genetica e sono spontanee e si attuano casualmente in un punto del DNA. Possono essere inoltre somatiche o germinali.

Nelle mutazioni germinali è lo zigote a possedere la mutazione quindi si trasmetterà di generazione in generazione in ogni individuo. Le mutazioni somatiche invece riguardano solo la cellula e il tessuto cui la cellula appartiene per cui non ci sarà alcuna trasmissione generazionale.

Con le mutazioni si può avere perdita o acquisto di una funzione e quindi in questo caso avremmo un effetto benefico nell'evoluzione. Le mutazioni possono essere anche silenti quando ad un cambiamento genotipico non corrisponde uno fenotipico.

Categorie di mutazioni

In generale le mutazioni appartengono a 3 categorie: puntiformi, cromosomiche e genomiche. Quelle puntiformi determinano un cambiamento qualitativo (quando si sostituisce una coppia di basi-transizione → sostituzione di una purina con una purina e di una pirimidina con una pirimidina; e transversione → una purina è sostituita con una pirimidina e viceversa -), quantitativo (quando si perdono o si aggiungono le basi -inserzione e delezione-) e dinamico (quando aumenta il numero di triplette attraverso le generazioni: espansione di triplette).

Cause delle mutazioni spontanee

• Deaminazione delle basi
• Creazione di siti abasici
• Tautomeria
• Forme reattive dell'ossigeno
• Errori nella riparazione
• Elementi trasponibili

Deaminazione delle basi

Cambia l'appaiamento tra le basi perché si perde il gruppo amminico. Come per la metilcitosina nei promotori dei geni, che se viene deaminata si trasforma in timina dando quindi la sequenza TA e non più CG. Questa è una transizione, che in genere si presenta in frequenza maggiore rispetto alla transversione.

Creazione di siti abasici

Si idrolizza il legame glicosidico tra base e zuccheri, quindi manca un sito di legame.

Tautomeria

Cambia la specificità di appaiamento. Esiste quella cheto-enolica e tra ammina e immina.

Forme reattive dell'ossigeno

Attraverso il metabolismo ossidativo endogeno si vengono a formare i ROS (perossidi-radicali liberi). In questo caso la G non si appaierà più alla C ma alla T (si perde la specificità di appaiamento) così nella successiva mitosi cellulare avrò che CG diventerà TA (transversione).

Elementi trasponibili

Elementi genetici che si spostano nel genoma e che quando si inseriscono nella sequenza la interrompono creando quindi una proteina tronca o inattiva. È quindi una mutazione perché nel genoma viene inserita una sequenza nuova diversa dalla sua. Nell'uomo circa il 45% delle sequenze sono trasponibili. Se inseriti vicino o all'interno di una sequenza codificante inattivano il gene.

Replicazione del DNA

Si fanno degli errori anche nella replicazione del DNA ad opera delle polimerasi che sbagliano circa ogni 10^-4/10^-5 basi, ma avendo anche la correzione di bozze gli errori si riducono a 10^-6/10^-7. Siccome il genoma umano ha circa 3x10⁹ basi, ad ogni ciclo replicativo ci saranno 6 x10^-3 nucleotidi sbagliati.

Epimutazioni

Epimutazioni: anormalità in uno o più meccanismi epigenetici. Tra questi esiste per esempio la metilazione del DNA, la modificazione degli istoni, interazioni proteine-DNA o proteine-proteine. Sono tutti meccanismi di regolazione della trascrizione che però non funzionano come dovrebbero nel caso di epimutazioni. Ci sono diversi tipi di epimutazioni:

• Primarie: difetto iniziale che viene ereditato dalle cellule figlie (come la non metilazione del DNA).
• Secondarie: mutazione di un gene coinvolto in un meccanismo epigenetico, trasmissibile in mitosi e meiosi.

Mutazioni cromosomiche

Riguardano il cambiamento della struttura o del numero di cromosomi possono essere:

• Costituzionali: proprie delle cellule germinali, da cui nascono gli aborti spontanei causati per il 60% da anomalie numeriche e per il 40% di struttura.
• Acquisite: proprie delle cellule somatiche da cui nascono neoplasie.
• De novo

Consideriamo i cambiamenti strutturali dei cromosomi, quindi le aberrazioni strutturali. Consistono in rotture a singola elica (DNA parzialmente integro) o in rotture a doppia elica (perdita dell'integrità del DNA). Le aberrazioni si dividono in cromatidiche o cromosomiche. Nel primo caso sono coinvolti solo i cromatidi, che saranno “anormali” quando si rompe il doppio filamento di DNA e quindi solo nel caso in cui ormai ci sia stato un SSB che poi è stato replicato e non riparato, portando quindi al DSB.

Nel secondo caso invece si forma prima della replicazione del DNA e si duplica nel cromatidio fratello, per cui l'anomalia riguarderà entrambi i cromatidi e quindi l'intero cromosoma. Inoltre le aberrazioni sono classificate in:

• Stabili (si trasmettono alle generazioni cellulari successive)
• Instabili (la cellula affetta non può dividersi e così si formano i cromosomi dicentrici)
• Bilanciate (non si perdono e non si acquistano elementi cromosomici)
• Sbilanciate (si perdono e si acquistano elementi cromosomici)

Le traslocazioni sono aberrazioni cromosomiche stabili e bilanciate.

Osservazione di SSB e DSB su vetrino

Si fa tramite l'utilizzo di coloranti. Nel caso del SSB si noterà un GAP nel cromatidio, che sarà il punto in cui il preparato non ha preso il colore. Le 2 parti non risultano essere staccate, ma anzi rimangono allineate in asse perché c'è comunque l'altra elica integra che li tiene insieme al resto della struttura, per cui un GAP è una sezione acromatica lungo 1 o 2 cromatidi del cromosoma, con estremità allineate e non troppo distanti.

Per un DSB invece, con la stessa tecnica, si osserverà una parte mancante del cromosoma, infatti le 2 porzioni sono slegate da quelle a valle e sono libere di muoversi come vogliono perché non esiste un asse e quindi formano ciò che si chiama delezione terminale.

Queste regioni acromatiche osservate prendono il nome di break o frammento e quando si staccano viaggiano insieme perché tenuti legati dalle coesine che fanno aderire i cromatidi.

Aberrazioni da delezione

• Delezione terminale: il frammento cromosomico/cromatidico viene perduto;
• Delezione interstiziale: il frammento cromosomico/cromatidico viene staccato e le 2 estremità ricongiunte;
• Cromosoma ad anello (Ring): le estremità del frammento cromosomico contente il centromero, si ricongiungono tra di loro a formare un anello. Ciò non esiste nei cromosomi integri perché hanno i telomeri che tengono staccate le estremità.

Se si forma un DSB su cromosomi diversi, ci può essere un riarrangiamento o scambio tra i cromosomi che si sono creati. Può avvenire una traslocazione reciproca stabile o si forma un cromosoma dicentrico (a caramella) o uno acrocentrico piccolino e instabile.

I frammentini che si creano, non avendo centromero, non possono segregare, mentre gli altri ne hanno due e quindi si possono separare in anafase. Se avviene un DSB cromatidico non c'è scambio perché i frammenti rimangono attaccati ai cromatidi grazie alle coesine, per cui si forma una struttura quadriradiale simmetrica. Se lo scambio avviene tra frammenti col centromero allora si forma la struttura a triade e in questo caso i frammenti senza centromero vengono persi.

Anomalie numeriche

Riguardano la variazione dal normale numero di cromosomi che dovrebbe esistere all'interno della cellula. Le anomalie che si possono verificare sono:

• Poliploidia: moltiplicazione dell'intero assetto cromosomico aploide
• Aneuploidia: perdita/acquisto di uno o pochi cromosomi:
  • Trisomia (2n+1): acquisto di 1 cromosoma da parte della coppia di omologhi o 2 coppie diverse.
  • Monosomia (2n-1): perdita di un cromosoma di una coppia di omologhi;
  • Tetrasomia: acquisto di 2 cromosomi da parte di una coppia di omologhi.
• Tetraploidia o endoreduplicazione: la cellula duplica il DNA ma non fa mitosi.

Con una monosomia si ha la sindrome di Turner, con la trisomia si ha il Klinefelter o Down, e con aneuploidie varie si può avere la sindrome di Patau e Edwards. Nella sindrome di Turner, le cellule dei diversi distretti corporei sono monosomiche per il cromosoma X, ma alcune sono normali e altre diverse, per cui si presenta il fenomeno del mosaicismo.

Tutte queste condizioni si ottengono per esposizioni a veleni del fuso (agenti mutageni).

Meccanismi di aneuploidia

Le aneuploidie si formano per una mancata disgiunzione dei cromosomi omologhi nella meiosi I oppure per la mancata disgiunzione dei cromatidi in meiosi II.

Esempio: Spesso sia in individui Down che Turner, avendo il mosaicismo, succede che i gameti normali non si disgiungano dopo la fecondazione nelle prime fasi di divisione dello zigote. Quindi una cellula ha perso un cromosoma e una lo acquista e questa mutazione si diffonde poi per clonazione alle altre cellule dell'organo in cui si è originata la cellula mutata.

La perdita del cromosoma è avvenuta per ritardo anafasico nella mitosi e non nella meiosi, in cui un cromatidio può staccarsi dalla fibra del fuso e rimanere in mezzo al citoplasma, determinando la sua localizzazione in una cellula piuttosto che in un'altra, attraverso la citodieresi.

Nella meiosi la disgiunzione avviene correttamente se il crossing over è avvenuto correttamente. I cromosomi sessuali sono più soggetti ad aver crossing over anomali o ad averne meno perché i cromosomi X e Y sono molto piccoli e oltretutto permettono il crossing over solo nelle regioni pseudoautosomiche.

Danni al DNA e sistemi di riparazione

Un danno o una lesione al DNA può essere riparato o causare il blocco del ciclo cellulare e quindi la morte della cellula nel caso in cui il danno sia troppo esteso o interessi una parte vitale del DNA. La ripetizione può non avvenire o essere errata e causare mutazioni con la successiva replicazione. Alcuni meccanismi di riparazione si basano sulla ricombinazione (crossing over). Quindi una mutazione si avrà quando non c'è un bilanciamento tra le funzioni cellulari che assicurano una corretta divisione e una corretta replicazione del materiale genetico.

La fedeltà replicativa implica una corretta sintesi del DNA, mentre la corretta distribuzione del materiale genetico implica una giusta segregazione dei cromosomi. Per cui i sistemi di riparazione devono bilanciare l'equilibrio tra duplicazione e segregazione.

La riparazione si divide in:

• Riparazione accoppiamenti errati: in questo caso si usa la correzione di bozze della polimerasi replicativa, che utilizza l'attività esonucleasica della DNA polimerasi, oppure il sistema MMR che corregge le basi sfuggite alla polimerasi.
• Riparazione diretta: si elimina la lesione con una stretta specificità di substrato. Es.. la luce bianca UV fa legare 2 anelli di pirimidine dando dimeri che vengono rotti da fotoliasi. Questo avviene nei batteri. Nell'uomo una riparazione è la dealchilazione delle basi: alla guanina viene aggiunto il gruppo alchilico OCH₃ e la O6-metilguanina-DNA transferasi, prende il gruppo metile e in più la dealcalina, ma con quel gruppo metile acquistato, quest'enzima si inattiva.
• Riparazione indiretta: si eliminano una o più unità danneggiate.

MMR (Mismatch Repairing)

Agisce su basi malappaiate o anche su sequenze mini e microsatelliti che si ripetono più volte nel DNA e che se la polimerasi non rimuove vanno incontro a formazioni di anse. La funzione dell'MMR è proprio quella di eliminare queste anse. Per esempio, ho questa sequenza AGCGAGCG AGCG, la polimerasi aggiunge basi complementari e invece di mettere una G sulla prima C, la mette alle sesta e continua così lasciando 5 basi non appaiate che mi danno il loop.

L'MMR è formato da più enzimi, se uno non funziona perché mutato, insorgono malattie quali il cancro al colon-retto ereditario policistico. Le anse non rimosse distorcono il DNA, lo destabilizzano e causano crossing over ineguali.

Lo schema di funzionamento dell'MMR è il seguente: si riconosce l'appaiamento errato, stabilizzazione del complesso e taglio intorno al danno, rilascio parte danneggiata e aggiunta di nucleotidi, sintesi di DNA e ligazione.

Riparazione indiretta

Può essere di diversi tipi:

• Riparazione per excissione:
  • Base excision repair (BER)
  • Nucleotide excision repair (NER)
• Riparazione postreplicativa: translation synthesis
• Riparazione di tipo ricombinativo:
  • Riparazione legami crociati
  • Riparazione delle DSB

La riparazione indiretta in genere segue questo schema d'azione: riconosce l'alterazione, elimina la sequenza a monte e a valle del sito alterato, sintesi della nuova sequenza e saldatura dei frammenti (excissione) infine scambio di sequenza di DNA e risaldatura (ricombinazione).