Mutagenesi 2013 2014

MECCANISMI DI AUTODEPURAZIONE

Gli ambienti acquatici si oppongono all'inquinamento attraverso fenomeni di natura

fisica(SEDIMENTAZIONE E DILUIZIONE),chimica(COMPLESSAZIONE,REAZIONE ACIDO-

BASE,PRECIPITAZIONE E FLOCCULAZIONE),biologica (DEGRADAZIONE DA ORGANISMI

SUPERIORI,ASSIMILAZIONE VEGETALE O ANIMALE).Nell'ultimo caso si depura l'acqua ma

contemporaneamente l'agente tossico entra nell'organismo.

L'inquinamento dell'acqua comporta degrado ambientale e quindi conseguenze avverse dirette

sull'ecosistema e indirette sull'uomo.

Ci sono metodi che permettono il controllo di tutto ciò tramite:

approccio analitico(analisi chimico-fisiche):ricercano inquinanti a priori,per cui questo

• metodo non ha né sensibilità né precisione delle tecniche di ricerca,perché non permette di

rilevare tutti gli inquinanti anche perché non sanno di preciso quale effetto biologico

cercare. Per questo sono affiancati da metodi biologici.

approccio biologico(indicatori biologici che sono organismi in cui si possono misurare i

• marcatori biologici)che devono avere delle caratteristiche precise come un'ampia

distribuzione geografica, abitudini stanziali o territorialmente ristrette,essere adattabili a

condizioni di laboratorio,capacità di BIOACCUMULO e BIOMAGNIFICAZIONE (accumulo

di sostanze tossiche nell'organismo).

Questi in ogni caso ci danno una misura integrata nel tempo e nello spazio delle entità di

inquinanti nell'organismo.

Per quanto riguarda l'uso di questi marcatori biologici per il monitoraggio di ambienti acquatici,si

usano questi approcci:

APPROCCIO CHIMICO:non determina gli inquinanti,ma prevede

• l'estrazione/concentrazione di campioni di acqua;un saggio di genotossicità dell'estratto

finale;caratterizzazione chimica delle frazioni informativo del momento del prelievo.

IMPIEGO DI ORGANISMI CONCENTRATORI:sono i BIOACCUMULATORI,qui si fa

• un'estrazione/concentrazione di tessuti e poi dopo il test di genotossicità;

RILEVAMENTO DIRETTO EFFETTI GENOTOSSICI:si sfruttano diversi sistemi cellulari

• quali molluschi,anfibi,vermi,ma soprattutto le cellule dell'apice radicale delle piante

acquatiche,oppure eritrociti,cellule branchiali,renali,cellule stabilizzate dei pesci.

STRATEGIE DI MONITORAGGIO GENOTOSSICO

Prevedono saggi di laboratorio in cui il danno genotossico riflette il grado di inquinamento della

rispettiva area oggetto di campionamento. Si può fare anche un monitoraggio in SITU su organismi

residenti o introdotti. Una volta che so che il mio sistema cellulare reagisce all'agente

inquinante,tutti i danni genotossici dipenderanno dal contatto con questo.

Per quanto riguarda il monitoraggio in situ, se il sistema di studio non riflette il grado di

inquinamento dell'area campionata,posso usare specie diverse. Gli organismi più usati per questo

tipo di monitoraggio sono i molluschi bivalvi,perché sono facili da usare.

Nel caso di organismi introdotti si possono valutare e studiare aree a diversa tipologia e in questo

modo vedrò anche le fluttuazioni di frequenza di danno genotossico nel tempo,per ogni

postazione. Quindi possiamo valutare le differenze sia nello spazio che nel tempo.

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Test di mutagenesi con microrganismi

Alcune metodiche sperimentali prevedono l'utilizzo di microrganismi come sistemi modello per

riconoscere agenti mutageni capaci di alterazioni a livello genetico. I batteri e gli eucarioti semplici

sono molto adatti a questo tipo di utilizzo poiché crescono rapidamente in terreni semplici, hanno

un ciclo cellulare ben caratterizzato, abbiamo una conoscenza sufficientemente vasta del loro

genoma ed una alterazione genetica porterà, comunque sia ad un effetto facilmente visibile, come

un cambiamento nelle richieste nutrizionali.

Test di Ames

Il test di Ames è un test di reversione effettuato su Salmonella Typhimurium. Solitamente i ceppi

utilizzati presentano una mutazione in uno dei geni che costituiscono l'operone per la biosintesi

dell'istidina, sono detti auxotrofi per l'istidina. È possibile ripristinare la funzione genica (ritorno al

fenotipo selvatico in cui il ceppo è prototrofo per l'istidina) attraverso una reversione.

Esistono tre tipi di reversione:

reversione vera (o retromutazione) in cui si ha una seconda mutazione nello stesso punto

– della prima e un conseguente ripristino dell'esatta sequenza nucleotidica.

reversione parziale dove abbiamo il ripristino dell'esatta sequenza aminoacidica attraverso

– due mutazioni, in cui la seconda non rimetterà il nucleotide precedente ma ne metterà un

altro che non comprometterà la funzione proteica (la tripletta codificherà per lo stesso

amino acido)

reversione per soppressione che prevede il ripristino della funzione proteica. Questa classe

– comprende due sottotipi: la retromutazione intragenica (due mutazioni nello stesso locus di

un gene, una delezione e un'inserzione. Un esempio è la frameshift) e la retromutazione

intergenica (le due mutazioni avvengono in geni diversi)

Nel 1983 Maron ed Ames pubblicarono le linee guida PER IL TEST DI REVESIONE CON S.

Typhimurium ed indicarono in tre punti il modo per aumentare la sensibilità del test in modo da

testare un gran numero di sostanze mutagene:

1. aumento sensibilità ceppi

: grazie ad una serie di manipolazioni genetiche specifiche, quali:

* una mutazione rfa che comporta la sintesi di una componente polisaccaridica più lassa

del normale in modo da far entrare anche molecole voluminose, *una delezione dei geni

uvrB e bio che rendono il ceppo biotina-dipendente e ne elimina il sistema di riparazione

error-free, *aggiunta di un sistema di riparazione error-prone portato dal plasmide pKM101

che conferisce anche resistenza all'ampicillina, *eventuale inserzione di un altro plasmide

pAQ1 che dà resistenza alla tetraciclina. I ceppi più usati sono TA98 e TA100 che

differiscono per una mutazione nell'operone per l'istidina. TA100 ha una mutazione per

sostituzione mentre TA98 per frameshift, per cui Ta100 reverte con agenti chimici che

inducono sostituzione, TA98, invece, con quelle che danno inserzione o delezione.

Entrambi i ceppi hanno i geni bio e uvrB deleti, una mutazione rfa e la presenza/assenza

del plasmide.

2. Aumento del numero dei composti identificabili : è necessario testare sia i mutageni diretti

(analoghi di base, derivati dell'acido nitroso, agenti alchilanti), che quelli indiretti. Per far ciò

è necessario introdurre un sistema di attivazione dei metaboliti artificiali, il S9-mix (permette

di attivare i mutageni indiretti). È necessario fornire degli enzimi microsomiali, provenienti

da fegato di ratto, per far si che i batteri siano in grado di modificare dei metaboliti insolubili

in acqua. Successivamente si aggiungono dei cofattori, quali il NADPH, il tampone fosfato

e il G6P, per far funzionare gli enzimi. [di ogni ceppo metterò uno con gli enzimi e uno

senza (TA100 e TA100+S9-mix, TA98 e TA98+S9-mix) in modo da saggiare se un

mutageno è diretto o indiretto. Se si pensa che causino sostituzione useremo TA100, se

invece sospettiamo inserzione o delezione adopereremo TA98]

3. procedure sperimentali rapide e riproducibili : a questo punto si usa il plate corporation test.

In primo luogo si devo osservare la frequenza di mutazioni spontanee, per far ciò si utilizza

un terreno completo (contenente istidina) in cui semino una aliquota di una coltura e al

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termine della fase esponenziale (circa 10 cellule) facciamo le nostre osservazioni. Fatto

ciò poniamo i batteri in un terreno povero, privo di istidina o comunque presente in tracce

minime sufficienti alla sopravvivenza fino alla mutazione, contenente biotina e poniamo una

piccola quantità di sostanza da testare. Dopo 48 h posso contare la colonie revertenti

poiché dopo tale ora solo le cellule che revertono al fenotipo selvatico sono in grado di

continuare il processo di crescita (l'istidina e la biotina presenti all'inizio sono ormai finite).

Controllo dei marcatori.

È un test per controllare se la le caratteristiche genetiche dei ceppi selezionati sono rimaste

invariate.

*Si saggia l'auxotrofia per l'istidina e la biotina preparando tre piastre: a) + istidina, - biotina, b) -

istidina, + biotina, c) + istidina, + biotina. Se non è cambiato niente vedremo crescita solo nella

piastra c.

*Per vedere se abbiamo la mutazione uvrB (delezione del gene uvrB) basta piastrare il ceppo su

un terreno completo, coprire una metà della piastra ed esporre l'altra ai raggi UV. Si osserverà una

crescita solo nella metà coperta.

*E' possibile testare la presenza di una mutazione rfa piastrando il ceppo su un terreno completo,

e ponendo un dischetto di carta al centro della piastra e aggiungendo del cristal-violetto, tossico se

entra nella cellula. Se la mutazione è ancora presente non avremo crescita al centro, mentre al

bordi sì (avremo un alone di crescita).

*La presenza del plasmide è verificabile piastrado su un terreno contenete ampicillina e

tetraciclina. Avremo crescita solo nella metà in cui i batteri hanno pKM101 e pAQ1 (i due plasmidi).

Test di mutazione genica nei lieviti. (test di ricombinazione mitotica)

I lieviti sono degli eucarioti unicellulari aventi una fase aploide e una diploide. Hanno un genoma

costituito da 13Mb con 16 cromosomi, un DNA mitocondriale e 6000 geni. (23% di omologia con il

genoma umano). Per i test è utilizzato il ceppo D7 (diploide) di Saccharomices cerevisiae, avente

gli omologhi appaiati. Sul cromosoma 5 è presente il gene per la sintesi dell'isoleucina, per far sì

che il ceppo sia auxotrofo per questo aminoacido è necessario avere una mutazione in omozigosi

(entrambi glia alleli mutati). Sul cromosoma 15 vi sono i geni per l'adenina, aminoacido non

fondamentale per il lievito. Si possono indurre due mutazioni diverse in due siti diversi (mutazioni

in trans, eteroziogosi) in modo che complementino. [complementazione: produzione di un fenotipo

selvatico quando due diverse mutazioni sono combinate in una cellula diploide] in questo caso

avremo la crescita di colonie bianche dato che c'è produzione di adenina e non si accumula il suo

precursore (tipo selvatico: colonie bianche → mutazioni in siti diversi). Se, invece, abbiamo

un'omozigosi per il primo sito non ci sarebbe sintesi di adenina e le colonie appariranno rosse a

cause dell'accumulo del precursore (colonie rosse → mutazioni nel 1° sito). Un'altro possibile

risultato vede la crescita di colonie rosa dovuta ad un'omozigosi nel secondo sito (detta

parzialmente inattivante) che porta ad un parziale accumu