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- una nuova varietà di frumento o di soia o di pomodoro va riprodotta per via sessuale (vendo seme);

La varietà deve essere (indispensabile DUS):

- Distinguibile

Riconoscibile rispetto alle altre varietà disponibili in mercato per caratteri ad es:

- morfologici → colore, altezza;

- fisiologici → ciclo vegetativo preciso (es: 180 giorni);

- molecolari → bande del DNA.

- Uniforme

Stesso comportamento delle piante della varietà. Se la varietà è precoce tutte le piante dovranno

essere precoci.

Il grado di uniformità dipende dal tipo di varietà:

- se iscrivo una varietà clonale, ad es un nuovo vitigno che viene moltiplicato per via

vegetativa, le piante devono essere identiche;

- se iscrivo una linea pura, una varietà di soia o di frumento, tutte le piante sono

ssolutamente identiche;

- se iscrivo un ibrido di mais, pomodoro, insalata, l’uniformità deve essere assoluta perché

l’ibrido è il risultato tra l’incrocio di due genitori omozigoti.

- se iscrivo una nuova varietà di medica o di radicchio, l’uniformità e molto più blanda perché

è una popolazione che si riproduce per incrocio (le piante genotipicamente diverse tra di loro).

- Stabile

Per tutta la durata commerciale della varietà, l’agricoltore che compra quella varietà deve avere lo

stesso materiale.

- Possedere valore agronomico superiore

Carattere agronomico nuovo e migliore (anche solo precocità o tardività).

- Tracciabilità

Non è obbligatorio ma è requisito che diventa sempre più importante e tema di dibattiti. L’analisi

del genotipo, qualora fatta, ha comunque valore legale.

(CULTIVAR è un termine generico che può riferirsi anche alla coltivazione di un ecotipo.)

Nel seme si racchiude tutta la tecnologia del miglioramento genetico.

Quanta variabilità genetica può essere presente in una varietà di una specie coltivata?

Dipende dal sistema riproduttivo e dalla tipologia di varietà:

Se parlo di una varietà di mais a libera impollinazione (es: marano, bianco perla, ma anche varietà

più recenti che vengono costituite per i paesi in via di sviluppo e che non possono comprarsi il

seme di mais ibrido) viene accettato un livello di variabilità compatibile con l’inter-incrocio del

nucleo di genitori selezionati; ma se vendo del seme ibrido F1 di mais non può essere accettato

nessun livello di variabilità, l’uniformità deve essere assoluta (tutte piante geneticamente

identiche).

La varietà deve comunque, a prescindere dalla variabilità, essere uniforme per caratteri morfologici

e performances. 6

Qualsiasi attività di miglioramento genetico si basa sulla disponibilità di variabilità entro specie e

tra specie:

Ci procuriamo variabilità genetica attraverso:

- Incrocio

Incroci controllati che permettono di ricombinare caratteristiche diverse dei genitori trasferendoli in

un unico individuo.

- Mutagenesi

Le mutazioni sono l’unica fonte vera di nuova variabilità, permettono di creare delle varianti

alleliche che prima non esistevano.

- Ingegneria genetica (o tecnologia del DNA ricombinante)

Permette di trasferire geni al di là della barriere di compatibilità sessuale, addirittura tra individui

appartenenti a regni diversi.

Si ottiene quindi nuova variabilità, nuove combinazioni genotipiche sulle quali andare a selezionare

gli individui che rispondono ai nostri obiettivi per creare nuove varietà da moltiplicare.

Miglioramento genetico = selezione resa possibile dall’esistenza di variabilità genetica;

Selezione = scelta dei migliori individui entro una popolazione geneticamente variabile.

Obiettivi del miglioramento genetico nel passato

Aumentare la produzione unitaria mediante:

- Modificazione di caratteri morfologici:

- taglia ridotta (es: varietà nane di frumento e di orzo);

- dimensione della spiga e quindi n° delle cariossidi per spiga;

- portamento delle foglie permette di aumentare l’investimento (l’angolo di inserzione delle

foglie

di mais è oggi molto stretto, sicuramente sotto i 45°, mentre un tempo erano a 90° o

quasi).

- Modificazione di caratteri fisiologici:

- indice di raccolta (maggior spostamento della biomassa verso la produzione di granella);

- utilizzazione di nutrienti

- tolleranza a stress

Obiettivi nuovi

- Miglioramenti qualitativi della produzione:

- intrinseci (contenuto in vitamine, carboidrati,….);

- estrinseci (qualità merceologica del prodotto: pezzatura, colore,…).

- Miglior utilizzazione delle risorse:

- ambientali e tecniche (es: uso ponderato delle dosi di concime);

- resistenza agli stress sia abiotici che biotici (obiettivo importante è quello di creare varietà

che

richiedano minor uso di trattamento pesticidi) e quindi anche riduzione degli impatti

ambientali

legata ai prodotti utilizzati;

- Adattamento ai mezzi meccanici:

- sistema di allevamento dei fruttiferi per un buon espletamento del controllo parassitario;

- semina, confettatura dei semi e semi monogerme per l’adattamento alla semina

automatica;

- raccolta (es: fruttiferi, impalcatura dei baccelli di soia a 8-10 cm per non perdere quelli più

bassi);

- Adattamento alle condizioni ambientali:

- insensibilità al fotoperiodo (es: varietà di soia (brevidiurna) adattate a fotoperiodi diversi o

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insensibili che siano in grado di indurre la fioritura senza dover aspettare da diminuzione

della

durata del giorno);

- richiesta del freddo per la fruttificazione (es: pesco coltivato nel regioni del sud Italia grazie

alla

selezione di varietà nelle quali c’è l’induzione a fiore con fabbisogno di freddo molto

limitato).

- Controllo dei sistemi riproduttivi:

- mantenimento della varietà stabile, uniforme, ...

L’applicazione delle tecniche innovative (cosiddette non convenzionali) sono da vedere come un

supporto importante che può permettere di:

- utilizzare la variabilità genetica che altrimenti sarebbe impossibile utilizzare

(trasferimento di geni

tra organismi non sessualmente compatibili);

- maggiore rapidità ed efficienza di selezione (selezione assistita da indagini di tipo

molecolare che

permettono di mettere in evidenza la presenza effettiva del gene al quale siamo

interessati);

- proteggere le varietà vegetali (tracciabilità).

SISTEMI RIPRODUTTIVI

Quando si lavora su una specie la prima cosa da sapere è come si riproduce perché dal tipo di

riproduzione dipende come è organizzata e strutturata la popolazione dal punto di vista genetico,

ossia come è distribuita la variabilità genetica all’interno di questa popolazione.

Ciò condizionerà:

- le modalità con le quali si farà la selezione (è diverso selezionare su materiale omozigote o

eterozigote);

- il tipo di varietà che si andrà a costituire.

Opzioni di riproduzione

1) Via asessuale in vari modi:

- Per seme

Specie che producono seme che non deriva da fecondazione ma da un processo apomittico

(apomissia = formazione dell’embrione senza unione dei gameti).

Processi di produzione del seme che avvengono in assenza di fecondazione dell'ovocellula

femminile da parte del nucelo spermatico maschile.

Distinguiamo:

- Embrionia avventizia: gli embrioni si formano a partire da delle cellule somatiche dell’ovulo

che sono in grado di differenziare gli embrioni (es: specie del genere Cyprus). Si

formano degli embrioni somatici che sono quindi identici/dei cloni della

pianta madre.

- Apomissia gametofitica: si verifica per due passaggi successivi:

- apomeiosi (senza meiosi): si forma un sacco embrionale non

ridotto “2n anziché n” (= non ha subito la

riduzione del numero cromosomico perché

non c’è stata meiosi) e anche la cellula

uovo è 2n, quindi identica alla pianta madre.

- partenogenesi: la cellula uovo 2n si differenzia in embrione

identico alla pianta madre (es: Poa, Taraxacum).

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Nelle specie dove avviene riproduzione per apomissia non avviene solo così, perché sarebbero già

scomparse non essendoci possibilità di evoluzione, di risposta a cambiamenti ambientali. Quindi

presentano contemporaneamente anche riproduzione sessuale (producono una parte del seme per

fecondazione e una parte per apomissia). Da una parte genotipi adatti possono perpetuarsi e

dall’altra, attraverso ricombinazione genetica, possono garantirsi l’evoluzione.

- Vegetativa

È la propagazione per parti di piante (rizomi, bulbi, stoloni e nella pratica agricola: innesti, talee,

margotte).

- Micropropagazione

Moltiplicazione vegetazione artificiale tramite riproduzione in vitro di cellule o tessuti.

2) Propagazione sessuale o gamica (anfimissia: unione casuale).

A) pianta

B) dentro all’ovulo c’è la cellula madre delle megaspore

C) la cellula subisce meiosi e produce le megaspore (4 cellule aploidi tutte diverse tra di loro). Nel

caso della sporogenesi femminile (macrosporogenesi) tre di queste degenerano e una sola rimane

la megaspora funzionale che subisce tra mitosi e forma il

D) sacco embrionale: la struttura aploide che sta dentro all’ovulo. Il gametofito femminile presenta:

- otto nuclei identici disposti tre al polo vicino al micropilo di cui quella al centro è la cellula uovo

ridotta (numero cromosomico n);

- i nuclei polari;

- i due al centro che daranno origine al nucleo secondario dell’endosperma;

Una volta che i tre nuclei spermatici arrivano al gametofito femminile entrano dal micropilo e

avvengono due fecondazioni (doppia fecondazione caratteristica di tutte le angiosperme):

- il gamete maschile va a fecondare la cellula uovo formando lo zigote e ripristinando il numero

cromosomico 2n;

- il secondo va a fecondare i due nuclei al centro del gametofito e va a formare un nucleo triploide

definito nucleo secondario dell’endosperma che dividendosi per mitosi forma l’endosperma (tessuto

di riserva che supporta la germinazione e l’accrescimento dello zigote nelle prime fasi).

La doppia fecondazione non c’è nelle gimnosperme dove l’endosperma è aploide.

Questa è la strada normale (doppia fecondazione) che porta alla formazione dello zigote con

numero cromosomico 2n (n ricevuti dalla cellula uovo e n ricevuti dal granulo pollinico) per mitosi

dà origine all’embrione, e una volta che il seme germina si forma la pianta 2n.

In caso di apomissia si ha apomeiosi e quindi la cellula madre delle megaspore anziché andare in

meiosi si divide per mitosi o comunque con meiosi alterata producendo un sacco embrionale non

ridotto (tutti gli otto nuclei del sacco embrionale sono 2n).

La cellula uovo 2n differenzia per mitosi l’embrione con un processo definito partenogenesi: lo

zigote che si forma è identico alla pianta madre. Ovviamente si formerà l’endosperma per

supportare lo sviluppo dell’embrione.

Il passaggio dalla riproduzione sessuale a quella apomittica è definita da tre eventi:

1) abolizione della meiosi (apomeiosi);

2) sviluppo embrionale indipendente dalla fecondazione (partenogenesi);

3) produzione di un endosperma funzionale.

L’apomissia è stata rinvenuta in parecchie specie (15%) caratterizzate tutte da:

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- poliploidia (specie con assetto cromosomici multipli rispetto al n° di base) = alterazione della

megasporogenesi (mancanza della meiosi femminile);

- microsporogenesi che avviene in maniera assolutamente regolare (normale polline);

- apomissia solitamente facoltativa e avviene parallelamente alla riproduzione sessuale.

NO affermazione apomissia nel lungo periodo:

- accumulo di mutazioni svataggiose;

- mancanza di variabilità per rispondere alla variazione delle condizioni ambientali.

Si affermazione apomissia nel breve periodo:

- assenza di meccanismi di selezione e ricombinazione

Il vantaggio legato all’apomissia si ha perché produrre per apomissia significa clonare via seme e

quindi si costituisce un ibrido, questo si riproduce per apomissia e le ditte sementiere “saltano”

(perché in questo modo si fissa l’eterosi, le caratteristiche di quella varietà ibrida, il vigore ibrido

dell’F1 che deve essere ogni anno riprodotto tra i due parentali omozigoti che lo hanno costituito).

Riuscendo quindi a inserire il gene dell’apomissia si riescono a fissare anche i caratteri controllati

da molti geni che altrimenti sono difficili da fissare perché la ricombinazione è alta.

Il meccanismo consente quindi di clonare via seme, con tutte le conseguenze che questo comporta:

rispetto a moltiplicare per via vegetativa, il cui materiale è poco conservabile e difficile da gestire, il

seme potrebbe essere stoccato anni, inscatolato, confezionato, ...

NON VIENE TRATTATA LA MOLTIPLICAZIONE VEGETATIVA

- Fusti modificati usati come organi di moltiplicazione vegetativa (patata, topinambur);

- Fragola moltiplicata mediante stoloni;

- Marze innestate (ciliegio, olivo).

3) Micropropagazione

Si parte da espianti che in condizioni asettiche (assoluta sterilità, virus esente) e in condizioni

ottimali di crescita (terreno di coltura che contenga tutti gli elementi necessari, sali minerali,

carboidrati perché non fotosintetizzi, fitormoni, vitamine,…), di temperatura e umidità (perché non

hanno regolazione stomatica) vengono indotti a perdere la loro differenziazione, devono

de-differenziarsi e ripartire da capo per differenziare, mitoticamente, tutti i tessuti e tutti gli organi

per costituire una nuova pianta (le cellule vegetali sono totipotenti). È più facile partire da tessuti

giovani.

Le strade per ottenere tali risultati sono due:

1) Organogenesi x una piantain un periodo di 15-20 gg una pianta in quel terreno ottiene

parecchi accestimenti (5-10 piante = madri)

2) Embriogenesi somatica x una foglia in vitro possono usare espianti foglia

RIPRODUZIONE SESSUATA

Sistema riproduttivo = insieme delle strutture e dei processi che predispongono al tipo

d’impollinazione e determinano il tipo di fecondazione.

Due modalità di riproduzione sessuale delle piante in funzione anche delle strutture morfologiche

che controllano e facilitano la riproduzione:

1) Autogamia (o autofecondazione)

Nella specie autogame la fecondazione avviene fra un gamete maschile e uno femminile prodotti

dallo stesso individuo.

2) Allogamia (o incrocio)

Le fecondazione avviene tra gameti maschili e femminili prodotti da individui diversi.

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Non esiste una specie al 100% autogama o allogama. Perché se una pianta è solo allogama e vi è

un periodo in cui piove sempre non c’è dispersione di polline. Così come una specie solo ed

esclusivamente autogama non potrebbe mai ricombinare perché ha come conseguenza l’omozigosi

e la formazione di linee pure (non ci sarebbe variabilità).

SPECIE A PROPAGAZIONE SESSUALE O GAMICA

Le specie hanno evoluto strategie diverse per garantirsi il successo riproduttivo.

Fiore ermafrodita di Lilium (numero base per gli organi fiori tre o multipli).

Può riprodursi sia per incrocio che per autofecondazione.

Fiore ermafrodita di pomodoro. (autogama ma 1-2% allogama)

Le antere sono tra loro saldate a formare una colonna staminale chiusa al cui interno

sta il pistillo. Quando le antere sono mature, deiscono (si aprono) verso l’interno,

emettendo il polline. Questo permette allo stilo fiorale di sporcarsi di polline, quindi

viene favorita l’autoimpollinazione (strettamente specie autogama, 1-2% allogamia).

Fiore di peperone. (autogama ma 30% allogama)

Stessa famiglia del pomodoro (solanaceae). La struttura fiorale è analoga, ma le

antere non formano la colonna staminale chiusa. È comunque una specie

prevalentemente autogama, ma con una tasso abbastanza consistente di allogamia

(30%).

Fiore di pisello. (autogama)

È strettamente autogama perché la fecondazione avviene a fiore chiuso.

Erba medica (leguminosa).

È altamente allogama (quasi 100%). Quando l’insetto che favorisce l’incrocio si

appoggia sulla carena, questa scatta e si apre e gli stami (10) sbattono sull’addome

dell’insetto sporcandolo. Feconderà visitando altri fiori.

Il mais, porta organi maschili e femminili ma su fiori diversi (specie diclina).

- fiori maschili riuniti a pannocchia all’apice della pianta per disperdere il polline al

vento (impollinazione anemofila);

- fiori femminili racchiusi in una spiga che sta all’ascella della foglia.

È tendenzialmente allogamo.

Il nocciolo, come il mais, porta fiori maschili e femminili separati. È allogama.

Infiorescenze maschili (amenti).

Gemma femminile all’ascella della foglia.

Il melo ha fiore ermafrodita con molti stami. Non è autogama perché sussiste un

meccanismo di auto-incompatibilità.

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Autogame = specie le cui barriere morfologiche o funzionali (fecondazione a fiore chiuso)

impediscono l’incrocio.

Queste barriere possono essere superate con:

incrocio manuale, emasculazione, maschiosterilità (mutazioni che danno origine ad una

non-funzionalità del polline e per questo la pianta maschiosterile viene usata come genitore

femminile nell’incrocio).

L’effetto dell’autofecondazione è l’omozigosi (gli individui sono altamente uguali, ma una piccola

quota di incrocio c’è sempre). (es: soia, pomodoro, frumento, riso, orzo).

Allogame = specie che presentano barriere morfologiche o funzionali che impediscono

l’autofecondazione, o per lo meno la limitano.

La condizione normale dell’incrocio porto all’eterozigosi (individui tutti geneticamente diversi fra di

loro).

Meccanismi che favoriscono i diversi tipi di fecondazione:

Specie dioiche (fiori maschili su una pianta e fiori femminili su un’altra – kiwi, canapa, asparago,

pioppo, salice, spinacio).

Hanno fiori unisessuati su individui diversi per cui in linea teorica l’autofecondazione è impossibile

(ma esistono fiori ermafroditi). Le dioiche sono quindi certamente allogame.

Specie monoiche:

- dicline: fiori unisessuati sullo stesso individuo (mais, ricino, nocciolo, zucca, zucchino).

L’allogamia è prevalente e l’autogamia è possibile.

- monocline: fiori ermafroditi (entrambi organi)

1) Stigmi e antere dello stesso fiore maturano in tempi diversi (barriera funzionale):

antere deite ma stigma è ancora verde e non è recettivo oppure al contrario lo

stigma è turgido, umido e recettivo ma le antere sono ancora verdi.

- proterandria se maturano prima gli organi maschili;

- proteroginia se maturano prima gli organi femminili.

Sono barriere che si trovano anche nelle specie dicline: mais è proterandro anche se gli ibridi

moderni non lo sono. L’allogamia è favorita ma non è impossibile l’autofecondazione (per

sovrapposizione).

2) Maturazione contemporanea di stigmi e antere dello stesso fiore.

- casmogamia: fiori aperti al momento dell’impollinazione (autogamia favorita);

- cleistogamia: fiori chiusi al momento dell’impollinazione (autogamia quasi

esclusiva – orzo, frumento, pisello, fagiolo).

Ad eccezione delle specie dioiche, in tutte le altre situazioni possono verificarsi casi di

autoincompatibilità (melo, ciliegio, certe varietà di ulivo) =

DEF: barriera riproduttiva sotto controllo genetico che nelle piante determina l'incompatibilità tra

polline e pistillo della stessa pianta rendendo obbligatoria la fecondazione incrociata.

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- meccanismo a controllo genetico determinato da un locus genico; è l’incapacità di una pianta

fertile ermafrodita di riprodursi per autofecondazione, apparentemente ha tutti i requisiti ma in

realtà non è capace di produrre seme per autofecondazione.

È diffusissimo tra le angiosperme (70-80%) tanto che si ritiene che sia alla base del loro successo

evolutivo. L’autoincompatibilità ha favorito l’incrocio e quindi il mantenimento di un’alta variabilità

all’interno della specie, un’alta capacità adattativa e evolutiva.

L’autoincompatibilità è controllata da un singolo locus che viene chiamato locus S

(self-incompatibility). Questo locus comprende almeno un paio di geni: uno codifica per una

proteina espressa nel tessuto maschile e uno per una proteina che viene espressa nel tessuto

femminile perché l’autoincompatibilità si realizza attraverso una reazione biochimica di

riconoscimento tra polline e stigma (reazione proteina - proteina altamente specifica - proteina

stimmatica stilare che interagisce con una proteina pollinica).

Questo locus è multi-allelico: i due geni (determinante maschile e femminile) contemplano decine

di alleli (es: nel trifoglio sono stati individuati più di 200 alleli al locus S).

Locus = posizione fisica che occupa un gene nel cromosoma.

Nei tessuti femminili (stigma e stilo) la proteina S prodotta dal genotipo di quella pianta determina

la reazione di incompatibilità.

Nei tessuti maschili, invece, possiamo avere due meccanismi diversi:

- Autoincompatibilità gametofitica (GSI)

In alcune specie la reazione d’incompatibilità, la proteina maschile di riconoscimento, è prodotta

dal singolo granulo di polline (aploide - gametofito maschile), quindi un unico allele al locus S che

produce la proteina di riconoscimento.

Se una pianta è eterozigote al locus S (S1S2) produce due tipi di granuli pollinici: metà polline S1 e

metà polline S2 per meiosi. L’allele S1 e l’allele S2 produrranno due proteine diverse di

riconoscimento.

La specificità è determinata dal genotipo aploide del singolo granulo pollinico.

La reazione avviene a seconda delle specie a livello stimmatico o stilare.

È la più diffusa (melo, ciliegio,…). Solitamente nel melo, per garantire la fecondazione, si mettono

nel frutteto piante di una varietà diversa come impollinanti poiché è presumibile che, essendoci

tanti alleli al locus S, almeno per un allele siano differenti e quindi il polline prodotto da questi

impollinanti è sufficiente per impollinare tutto l’impianto.

A B C D

A) Pianta con genotipo al locus S → S1S2.

Quando produce gameti, produrrà metà polline S1 e metà polline S2 (segregazione 50%-50%). Il

polline si appoggia sullo stimma dello stesso fiore, ed essendo la pianta dello stesso genotipo S1S2

c’è una proteina di riconoscimento dettata da questi due alleli che viene riconosciuta sia dal polline

S1 che dal S2 e l’accrescimento del polline viene bloccato.

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In certe specie il polline nemmeno germina, in altre inizia a germinare e poi viene bloccato a livello

di stilo durante la penetrazione nei tessuti stilari.

B) Pianta con genotipo al locus S → S1S3.

Questa pianta quando produce gameti, produrrà metà polline S1 e metà polline S3. Se sullo stimma

della pianta si deposita il polline S1, magari prodotto da lei stessa, viene bloccato; arriva un insetto

che ha visitato una pianta S1S2 e porta del polline S1 o S2: il polline di nuovo viene riconosciuto e

bloccato perché ha lo stesso allele presente nei tessuti stilari e quindi la proteina viene riconosciuta

e bloccata e l’S2 è l’unico polline che può germinare perché la sua proteina è diversa e non viene

riconosciuta né da S1 né da S3 (parziale compatibilità).

C) Pianta con genotipo al locus S → S2S3

Se arriva polline S1S2, viene bloccato il polline S2, mentre il polline S1 può accrescersi e andare a

fecondare (parziale compatibilità).

D) Pianta con genotipo al locus S → S3S4

Se arriva polline S1S2, tutto questo polline può germinare.

Questo meccanismo non solo limita l’autofecondazione, ma anche l’incrocio tra piante imparentate

e in ogni caso il genotipo che si forma al locus S è per forza eterozigote, non potrà mai formarsi un

genotipo omozigote al locus S perché se c’è un allele in comune, quel polline viene rigettato.

Quindi affinché avvenga l’incrocio, è necessario che le piante differiscano per almeno un allele del

locus S e sarà solo quell’allele diverso in grado di operare la fecondazione.

- Autoincompatibilità sporofitica (SSI)

La proteina di riconoscimento non viene prodotta dal singolo granulo di polline, ma sull’esina, ossia

sulla parete che riveste il granulo di polline, e viene depositata sul singolo granulo dalle cellule del

tappeto delle antere che supportano la maturazione del polline stesso. È una proteina che ha

origine diploide (S1S2).

La specificità è determinata dal genotipo diploide del genitore che ha prodotto il polline.

La reazione avviene normalmente a livello stimmatico.

A B C D

Autoincompatibilità gametofitica (GSI) (stessi es anche per Autoincompatibilità

sporofitica (SSI))

Autoimpollinazione Se la pianta è di

genotipo S1S2 tutta la

pianta ha S1S2 al

locus S compreso lo

stilo e lo stimma. Le

cellule uovo che sono

dentro all’ovario,

prodotte dalla meiosi,

avranno o S1 o S2 e

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lo stesso vale per i granuli di polline che si formano sulle

antere di questa pianta (metà S1 e metà S2). Quando il

polline si appoggia sullo stimma dello stesso fiore, o di un

altro fiore della stessa pianta, la sua proteina S1 o S2 viene

riconosciuta dalla proteina stilare e viene bloccato

l’accrescimento del tubetto.

Impollinazione incrociata (anemofila o entomofila)

Arrivano alleli S3, S4, S8, S10 e tutti possono germinare.

L’obiettivo è dunque quello di evitare l’autoimpollinazione, o tra piante imparentate, e di favorire

l’incrocio tra individui diversi per garantire l’eterozigosi.

Famiglie nelle quali è stata osservata l’autoincompatibilità gametofitica

Sono sia monocotiledoni che dicotiledoni. Quelli più studiati sono quelli delle:

- Rosaceae, per l’importanza delle piante da raccolto (melo, pero, prugno);

- Solanaceae (tabacco, pomodoro, petunia, patata);

- Scrophulariaceae (antirrhinum);

Determinante femminile

È una RNA, ossia una ribonucleasi, enzima che degrada l’RNA. Quando il tubetto pollinico inizia a

penetrare nei tessuti dello stilo o tenta di penetrare, l’Rnasi prodotta dallo stilo entra nel tubetto

pollinico e brucia tutti i suoi RNA e gli impedisce di accrescersi (gli RNA messaggeri degradati non

producono nulla).

Le ribonucleasi sono specifiche, un po’ diverse per ogni allele S. Si dice che sono molto polimorfiche

(hanno forme diverse e alta specificità –identità amminoacidica diversa che scende anche fino al

40%).

Determinante maschile

Nelle solanaceae e nelle rosaceae è stata identificata la proteina prodotta dal determinante

maschile, chiamata SLF (proteina F-box del locus S). F-box sono una famiglia di proteine

caratterizzate da un cinquantina di aminoacidi che permettono alle proteine stesse di legarsi ad

altre proteine formando dei complessi enzimatici. Queste proteine si legano ad una proteina detta

ubiquitina (scoperta in quasi tutti i tessuti dei procarioti) formando un complesso enzimatico che

degrada proteine.

Il locus S di Brassica

Situazioni multi-alleliche (locus polimorfico con 60 alleli).

Due tipi di proteine espresse nello stimma:

- glicoproteina del locus S (SLG);

- recettore kinasico (SRK).

La specificità della reazione di riconoscimento è dovuta all'interazione tra il SRK e la SRC(proteina

ricca di cisteina localizata nella parete del polline.

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Meccanismo di autoincompatibilità di tipo sporofitico anche per il radicchio (autoincompatibile)

simile ma non uguale a quello di brassica. Ogni specie si comporta o da gametofitica o da

sporofitica.

Nelle Compositae vi è un meccanismo analogo a quello di Brassica ma con alcune differenze.

A Il granulo pollinico ha

emesso il tubetto, è germinato e ha raggiunto i tessuti connettori dello stilo, penetra e va in fondo

fino all’ovulo (reazione compatibile).

B L’auto-polline non si attacca alle papille stimmatiche (è comunque assolutamente vitale).

C Allo-polline (reazione compatibile). I tubetti pollinici sono germinati e stanno penetrando.

Autosterilità = meccanismo di tipo biochimico che garantisce il controllo della fecondazione,

impedisce l’autofecondazione e obbliga all’incrocio (non è comunque vero al 100%).

In natura esiste un ulteriore meccanismo genetico in grado di controllare la fecondazione:

MASCHIOSTERILITÀ

= mutazione sporadica spontanea che determina la mancata produzione o la non funzionalità di

gameti maschili prodotti.

Interessa per produrre seme ibrido, per controllare la fecondazione. Se abbiamo una pianta

maschiosterile tutto il seme prodotto su quella pianta non può che derivare da incrocio.

Tipi di maschiosterilità:

1) Maschiosterilità nucleare (NM)

E' una forma di maschiosterilità controllata da un singolo gene nucleare allo stato recessivo (ms).

Non è possibile ottenere progenie composte unicamente da piante maschiosterili poichè le piante

maschiosterili (msms) posso essere ottenute SOLO con l'incrocio con piante maschiofertiliti

eterozigoti (Msms).

2) Maschiosterilità citoplasmatica (CMS)

E' una forma di maschiosteritilità controllata da geni mitocondriali e pertanto ad eredità materna

nella maggiorparte delle specie vegetali. Le piante maschiosterili possiedono un particolare

citoplasma che conferisce sterilità (S) e possono produrre seme solo ricorrendo a piante

impollinatrici con citoplasma normale (N). Tutte le progenie risulteranno maschiosterili.

Maschiosterilità genetico-citoplasmatica

Forma di maschiosterilità risultante dall'interazione di fattori citoplasmatici e nucleari. In questo

caso le piante con citoplasma S non sono necessariamente maschiosterili poiché la presenza di

geni ristoratori (R) con sede cromosomica può ripristinare in tutto o in parte la fertilità maschile.

(gene BARSTAR) 16

Usata per produzione seme ibrido

3) Maschiosterilità ingegnerizzata

Ottenuta con tecniche di ingegneria genetica da utilizzare nelle specie delle quali non si conoscono

mutazioni spontanee di maschiosterilità.

Utilizza gene BARNASE, ribonucleosi citotossica che degrada l'RNA, estratto da un battere il quale

taglia i legami fosfodiesterici tra ribonucleotidi.

Maschiosterilità nucleare Incrociando una pianta maschiosterile omozigote

come femmina con una pianta normale (MsMs) si

ottengono piante eterozigoti fertili (con polline

normale). Queste piante maschiofertili eterozigote

possono essere utilizzate per mantenere la linea

maschiosterile che andrebbe persa. Con l’incrocio c'è

segregazione (50-50).

È rigorosissima perché ad es facendo del seme ibrido

di mais selezionando una linea imbreed da usare

come genitore femminile va mantenuta, e si deve

avere una linea eterozigote che sia per tutto il resto

identica alla linea imbreed (isoline – linee uguali a

mono di pochissimi geni).

Quindi la linea deve essere ad es: AA, BB, cc, dd, EE,

msms e una sorella che sia AA, BB, cc, dd, EE, Msms.

Vengono costruite queste linee sorelle uguali senza il gene di maschiosterilità in modo da

incrociarle e avere segregazione (poco utilizzata). Viene usata solo nelle specie nelle quali non si

conosce una più semplice maschiosterilità citoplasmatica.

Come si presenta fenotipicamente una pianta maschiosterile

Le mutazioni che possono dare maschiosterilità sono diverse e possono avvenire in momenti diversi

del processo di formazione dei gameti:

- anomalie a livello di meiosi (in qualsiasi fase della meiosi) che impediscono la formazione di

polline;

- meiosi regolare ma mutazione delle cellule del tappeto che ne impedisce il normale sviluppo delle

stesse per cui non sono funzionali e non supportano la formazione del polline (microspore). Se le

microspore non maturano e non vengono rivestite da parete non sono polline;

- polline funzionale, ma antere anormali che non deiscono e il polline resta chiuso dentro;

- polline privo di aperture, se non riesce a trovare l’apertura non emette il tubetto pollinico.

Dal punto di vista morfologico non c’è polline, antere atrofizzate, polline che al microscopio non

riesce ad emettere il tubetto. Le basi molecolari di questa maschiosterilità non sono note.

Rinvenuti geni di maschiosterilità in specie sia autogame che allogame: mais, cotone, patata, lino,

riso, sorgo, soia, tabacco, frumento, …

La maschiosterilità nucleare è di scarso interesse per la produzione di seme ibrido per:

- effetto ambiente, non è un carattere estremamente stabile per cui produrlo in zone diverse può

dare risultati diversi;

- mantenimento della linea maschiosterile

Permette comunque di eliminare le operazioni di castrazione che sono delicate e impegnative, e

facilita la produzione di seme ibrido.

Maschiosterilità citoplasmatica 17

Ha ereditarietà citoplasmatica e quindi viene trasmessa per via materna. È importantissima per la

produzione di seme ibrido ed è stata trovata in molte specie anche di interesse agrario, viene

spesso utilizzata per produrre semi ibridi in girasole, nelle Brassicaceae, in barbabietola e la prima

utilizzata per produrre semi ibridi in cipolla (che non necessita di geni ristorati).

È attribuibile ad una ORF chimerica. (ORF = Open Reading Frame, regione codificante, modulo di

lettura di un gene, corrisponde alla sequenza dell’RNA maturo.)

Quando un gene viene trascritto nell’RNA questo matura e vengono eliminati gli introni, rimangono

solo gli esoni (splicing) e la sequenza codificante viene effettivamente tradotta in proteina.

Chimera = tessuto o organo composto da cellule che non sono tutte geneticamente identiche. Può

derivare (ad es nel differenziamento) da una cellula che va incontro a mutazione, per cui tutta la

line acellulare che deriva dalla mitosi di quella cellula mutata è diversa, dà origine ad un tessuto o

un organo chimerico.

ORF chimerica si forma a seguito di mutazioni che danno origine a dei riarrangiamenti inglobando

pezzi di DNA che codificano per geni ribosomali (per lo più visto che i ribosomi stanno nel

citoplasma). La ORF deriva da questo montaggio di pezzi diversi.

Quando si formano le ORF chimeriche i mitocondri possono essere poco funzionali e quindi uno dei

primi effetti è quello di non supportare lo sviluppo delle cellule del tappeto.

Limite di questa maschiosterilità:

- talvolta è risultata associata a geni di suscettibilità a malattie,

questo ha creato dei danni enormi e nel mais non viene più utilizzata.

A

B

C

DE

Essendo un carattere controllato da DNA citoplasmatico, durante la

riproduzione il citoplasma viene fornito allo zigote dalla cellula uovo

(gamete femminile) quindi è un carattere ad eredità materna.

Tutta la progenie di una pianta maschiosterile è maschiosterile. Non è

possibile produrre seme ibrido usando una maschiosterilità di questo tipo. Infatti producendo del

seme ibrido di mais o di girasole da una linea femmina maschiosterile e questa dà tutto seme

maschiosterile non lo si può vendere all’agricoltore.

Per poter utilizzare la maschiosterilità deve essere associata a dei geni nucleari in grado di

rispristinare la fertilità (geni ristoratori). Per quasi tutte le specie per le quali si è trovata una

mutazione maschiosterile sono stati trovati anche geni ristoratori.

Come funziona l'eredità materna

Linea maschiosterile con fattore citoplasmatico di sterilità (non ha geni

ristoratori, non ha alleli che sono in grado di ristorare la fertilità – al locus

r è rr). Questa viene usata come genitore femmina (portaseme).

Non ha geni ristoratori ma non ha bisogno perché non ha fattori di maschiosterilità. La discendenza

eredita il citoplasma dalla madre (sterile), un allele r dalla madre e r dal padre quindi non ha geni

ristoratori: sono tutte piante maschiosterili e non potranno essere ibrido commerciale.

La CMS è caratterizzata dal fatto di non produrre polline vitale e non avere non eredità Mendeliana

(non segrega).

Il caso studiato è quello del mais perché ha creato molti danni e non si può più usare. È chiamata

CMS-T perché deriva da una mutazione comparsa in Texas.

18

Le ditte sementiere l'hanno inserito nelle linee femminili genitori degli ibridi. Il gene mitocondriale

riarrangiato, che ha dato origine ad nuova ORF (T-urf13), si trova vicino ad un gene che dà

suscettibilità all’Endosporium Maidis, un fungo che produce delle necrosi striate lungo le nervature

delle foglie portandole al disseccamento. Nel ‘73-‘74 si è sviluppato un nuovo ceppo di questo

fungo che è stato chiamato razza T, al quale il citoplasma è risultato molto suscettibile. Il fungo si è

diffuso rapidamente perché tutti gli ibridi avevano quel citoplasma e ha creato ingenti perdite.

È importante mantenere una certa diversità nella base genetica del materiale coltivato.

Esempi di Fenotipi maschiosterili (diversa morfologia fiorale)

FERTIL STERIL : fertile con antere estruse ed esposte al vento per

MAIS

disperdere il polline; sterile senza antere.

: alterata la morfologia degli stami; nella linea sterile

COLZA

le antere alla sommità degli stami sono raggrinzite, nel fiore

normale turgide.

: nella linea sterile non c’è polline sulle antere.

PETUNIA : nella linea sterile vi è assenza di polline sui fiori

GIRASOLE

della calatide.

: nella linea sterile i petali dei fiori vengono convertiti

CAROTA

in brattee verdi (alterazione di tutta la morfologia fiorale).

: nella linea sterile gli stami sono fusi con i carpelli

TABACCO

fiorali.

Morfologie diverse con lo stesso risultato --> non

funzionalità dei gameti maschili dovuta ad un gene citoplasmatico.

Quasi tutte le CMS note hanno geni ristoratori.

MAIS

Nel mais sono stati individuati due geni entrambi dominanti chiamati ristoratori della fertilità 1 e 2

(Rf1 – Rf2). Essendo dominanti è sufficiente che la pianta sia eterozigote per entrambi i geni per

essere fertile. Quindi l’impollinante omozigote dominante per tutti e due i geni dà un ibrido

eterozigote per entrambi i geni, fertile.

L’ibrido eterozigote Rf1rf1 - Rf2rf2, produce i gameti:

Rf1 Rf2

Rf1 rf2

rf1 Rf2

rf1 rf2

Non interessa se la segregazione del gene porta alla ricomparsa della maschiosterilità, l’importante

è che il seme sia fertile. Non viene riutilizzato per le semine.

Il gene mitocondriale dà la maschiosterilità, la non funzionalità del polline, perché produce delle

aldeidi tossiche per le cellule del tappeto che morendo non permettono la maturazione del polline.

La CMS non è più utilizzata, per la produzione di seme ibrido viene sostituita dalla castrazione

meccanica. Nei campi di mais viene seminata una linea di maschio e tre-quattro linee di femmine

(è sufficiente per impollinare). Prima che il pennacchio esca dalla guaina si passa con delle

macchine a cavallo delle file che tagliano il pennacchio apunto delle piante portaseme, così che

19

tutto il polline che c’è all’interno del campo considerato derivi dalla linea impollinante. I campi sono

poi ancora contornati da impollinanti che fanno da barriera contro l’entrata di polline estraneo.

Sono comunque rispettate distanze di sicurezza per evitare impollinazioni non controllate anche

per il costo del seme ibrido.

Questa maschiosterilità è utilizzata per produrre seme ibrido di girasole, sorgo e barbabietola. Si

utilizza una linea femminile maschiosterile e una linea maschile con geni ristoratori omozigoti così

che tutto l’ibrido sia maschiofertile. In realtà è poco interessante per la barbabietola perché non

deve produrci seme, anche se fosse maschiosterile non consumerebbe energia per emettere lo

scapo fiorale e produrre seme. I geni di ristorazione sono invece fondamentali per sorgo e girasole

per i quali il prodotto commerciale è granella.

Maschiosterilità ingegnerizzata

Messa appunto per avere un gene di maschiosterilità da utilizzare nelle specie per le quali non si

disponeva di maschiosterilità naturale. Si utilizza in linee transgeniche per la maschiosterilità e il

costrutto viene inserito con tecniche di ingegneria genetica.

A B C

Tappet

Tappet

Tappet Polline Tappet Tappet o

o

o present o o presen

presen

present assent assent

e

A tipo selvatico

B Pianta maschiosterile

C Pianta maschiofertile ristorata

Il sistema riproduttivo di una specie dipende:

- dalla riproduzione per allogamia o autogamia dipende la quantità di variabilità presente nelle

popolazioni naturali, quindi la loro capacità evolutiva e adattativa;

- anche l’organizzazione di tale variabilità, come è distribuita tra gli individui (autogame omozigoti,

allogame eterozigoti);

- procedure di selezione differenti perché il tipo di varietà da produrre è necessariamente diverso:

quando si costituisce una nuova varietà da coltivare per produrre seme commerciale, va rispettato

il sistema riproduttivo della specie;

- il tipo di varietà che può essere ottenuto:

- moltiplicazione vegetativa (non esclusiva in natura)

varietà clonali, quindi un genotipo selezionato perché risponde ai criteri di selezione,

che viene moltiplicato e costituisce cloni.

Si possono fare varietà policlonali per evitare l’eccessivo restringimento della

variabilità genetica rispettando l’uniformità e la distinguibilità (normalmente

sono monoclonali).

Specie con varietà clonali: tutti i fruttiferi (melo, banano, vite), specie ornamentali,

patata, aglio, piante bulbose.

- riproduzione via seme (sessuata)

se la varietà appartiene a specie autogama (frumento, soia, pisello, pomodoro) la

varietà per eccellenza è la linea pura (insieme di piante omozigoti che deriva per

20

autofecondazione da un capostipite omozigote) o una varietà costituita

da due-tre linee pure molto simili messe assieme, ma anche varietà ibride (varietà di

individui completamente eterozigoti ottenute da incrocio tra due genitori

opportunamente selezionati).

La difficoltà nelle allogame è quella di produrre seme ibrido.

Se la specie è allogama possiamo ottenere ordine di complessità della varietà:

- Popolazioni in equilibrio

Insieme di pianta selezionate che si riproducono per libero incrocio.

- Varietà sintetiche

Costituite da un nucleo ridotto di genitori selezionati (8-10 al max).

- Ibridi F1 (di prima generazione)

La difficoltà è quella di avere genitori altamente omozigoti (linee imbreed) ottenute attraverso 6-7

generazioni di autofecondazione (ogni generazione si dimezza la quota di eterozigosi). Si ottengono

ibridi di elevato pregio, individui F1 con altissima eterosi e tutti geneticamente identici tra loro

(uniformità) perché derivano da genitori omozigoti.

Gli ibridi hanno dunque questo doppio vantaggio: eterosi e uniformità.

RIASSUMENDO:

1. Specie a moltiplicazione vegetativa: CLONE = 1 genotipo selezionato e moltiplicato (melo, vite,

frutti)

2. Specie a riproduzione sessuata:

A)AUTOGAME : LINEE PURE e IBRIDI

B)ALLOGAME : POPOLAZIONE IN EQUILIBRIO, VARIETA' SINTETICHE E IBRIDI

Linee inbreed: linee che incrociate tra di loro danno luogo ad un ibrido con altissima eterosi. F1

altamente eterozigoti e identici tra loro derivanti da 2 genitori omozigoti.

VERIFICA SPERIMENTALE del SISTEMA RIPRODUTTIVO DI UNA SPECIE

1. Esame della struttura fiorale

2. Isolamento della pianta e verifica della produzione di seme

3. Verifica della depressione da inbreeding

4. Impiego di marcatori genetici (morfologici e molacolari)

BIODIVERSITÀ e RISORSE GENETICHE

La varietà di specie vegetali, animali e microrganismi presente in

una comunità naturale (habitat) o in particolare ambiente (diversità

ecologica), oppure la variabilità genetica rilevabili in una specie

(diversità genetica).

Può essere definita anche come la variabilità totale delle forme di

vita esistenti.

Si sono selezionate:

- in base ad all’epoca di semina (esempio frumento autunnale o primaverile) e di raccolta in una

certa zona

selezionando una certa durata del ciclo;

- per la tolleranza ai patogeni in un determinato ambiente;

- per la tolleranza alla siccità se in quell’ambiente non c’era disponibilità di acqua di irrigazione;

21

Popolazioni selvatiche:

selezione naturale --> evoluzione adattativa --> ecotipi

Popolazioni coltivate:

selezione naturale + selezione antropica --> evoluzione adattativa in ambiente antropico

(Landraces)

VAVILOV

Contributo fondamentale alla conoscenza della distribuzione geografica della variabilità genetica

delle piante coltivate sulla base dei principi del metodo fitogeografico.

La maggiore diversità genetica della specie coltivata la troviamo dove quella specie coltivata è

stata domesticata, dove ha cominciato ad essere coltivata in tempi più antichi.

Se una specie è coltivata in una certa area da più tempo, in quell’area troveremo la massima

diversificazione di quella specie. È probabile anche che si trovino le specie selvatiche dalle quali si

è originata.

In base a questo principio, Vavilov ha identificato le aree di origine delle principali specie coltivate.

Considerazioni:

- La distribuzione delle specie vegetali sulla Terra non è uniforme e l’area in cui si trovala maggiore

variabilità è probabilmente il centro di origine o di diversificazione di una coltura.

- È presumibile dunque che in quell’area vi siano anche gli ancestrali selvatici dai quali la specie è

stata domesticata.

- Distingue:

- specie primarie. Sono derivate direttamente da piante selvatiche (frumento, orzo, riso, soia,

cotone);

- specie secondarie. Si sono evolute come infestanti delle colture primarie e solo in un

secondo tempo sono state domesticate e che quindi hanno acquisite anche tutta quella

variabilità legata allo status di infestanti(avena, pomodoro).

- L’agricoltura, da reperti archeologici, aveva avuto inizio soprattutto ai piedi delle grandi catene

montuose, in regioni situate tra il 20° e il 45° N, quindi tra il tropico e il nostro parallelo.

Sulla base di queste considerazioni individua 8 centri principali dai quali si sarebbero evolute tutte

le colture e che chiamò “Centro di diversità”. Fa eccezione l’ottavo centro in Sud America.

Girando per l’unione sovietica, si era reso conto che i tipi di frumento coltivati erano molto diversi e

che andando verso Sud, verso il Caucaso, c’era una grande differenza tra le varietà coltivate,

mentre verso il Nord, le varietà si assomigliavano molto di più fra di loro. Aveva dunque legato tale

differenza di varietà alla componente ambientale.

Centri:

1. Cinese. Derivano molte specie arboree da frutto (melo, pesco), soia, cipolla;

2. Indiano con due sub-centri:

- sub-centro principale: riso, arancio, canna da zucchero, anguria, mango, cotone orientale

(Gossypium arboreum);

- sub-centro indo-malese: riso, banana, cocco;

3. Asia Centrale. È una delle regioni del mondo più ricca di variabilità genetica. Alberi di frutto

(mandorlo, albicocco) vite, melone, carota.

4. Vicino Oriente. Brassicaceae (cavolo cappuccio), cereali (orzo), erba medica.

5. Bacino del Mediterraneo. Frumento duro, barbabietola, olivo, leguminose da granella (cece).

22

6. Etiopico. Sorgo, miglio, caffè.

7. Messico-Centro America. Cotone (Gossypium hirsutum), fagiolo, mais, patata dolce, amaranto.

8. Sud-America.

- Perù-Ecuador-Bolivia: Patata, fagiolo Lima, pomodoro, peperone, zucche;

- Brasile-Paraguay: manioca, arachide, ananas, albero della gomma.

La domesticazione implica l’uscita della specie dal centro di origine e la diffusione verso nuove

aree. Questo presuppone che la specie abbia la capacità di adattarsi ai nuovi ambienti.

FRUMENTO

Originario del Vicino-Oriente ed è una delle prime specie ad essere domesticate perlomeno come

specie del genere Triticum (12.000 anni) e frumento tenero (più recente).

Oggi è coltivato in tutti i continenti e ciò significa che è stato in grado di adattarsi alle condizioni

ambientali più disparate.

La prima specie ad essere stata domesticata è il Triticum monococcum, specie diploide (2n=2x=14

→ n° cromosomico di base n=7). La specie esiste ancora come specie selvatica e non ha avuto

evoluzione. È un frumento a seme vestito ed è il meno produttivo di tutti avendo solo una

cariosside per spighetta.

Parallelamente si sono evoluti altri frumenti coltivati. La linea che ha portato alla formazione del

grano tenero e del grano duro, dovrebbe essere partita dall’incrocio intergenerico tra:

- Triticum uratu. Specie diploide. Genoma indicato con AA; 2n=2x=14

- Aegilops speltoides. Genere affine. Genoma indicato con BB; 2n=2x=14

A e B indicano che sono due set di cromosomi diversi tra di loro.

Dall’incrocio: un gamete con 7 cromosomi dell’uratu e un gamete con 7 cromosomi della Aegilops,

quindi 14 cromosomi. Questi 14 cromosomi tra loro diversi non si appaiano e quindi la discendenza

dell’incrocio ha acquisito fertilità attraverso un raddoppiamento del numero cromosomico

(poliploidizzazione).

- Triticum turgidum ssp. dicoccoides. Porta quindi genoma AABB e ha 2n=4X=28 (4X perché si

intende la somma dei 2 assetti cromosomici diversi) .

da questa specie selvatica è stata selezionata la sub-specie dicoccum che è la forma domesticata:

- Triticum turgidum ssp. dicoccum. Ha lo stesso assetto AABB; 2n=4x=28. È il farro.

Dal farro è stato selezionato il Triticum turgidum ssp. durum che il grano duro. È dunque un

frumento tetraploide con due assetti cromosomi A e B che derivato dall’uratu e dall’Aegilops (3

cariossidi per spighetta).

Il farro dicoccum si nel contempo incrociato con un’altra specie selvatica, il Triticum tauschii che ha

un genoma ancora diverso, indicato con la lettera D ed è un’altra specie diploide.

Dall’incrocio:

F1 ha 14+7 = 21 cromosomi (n° dispari - sterile). La fertilità è stata acquisita nuovamente

attraverso un processo di poliploidizzazione che ha portato al raddoppiamento del numero

cromosomico (42 cromosomi). La nuova specie che si è formata è il Triticum aestivum (frumento

tenero), una specie esaploide (tre set cromosomici). AABBDD; 2n=6x=42.

23

VITE

Originario del Centro-Asia.

Vi sono due sottospecie della Vitis vinifera:

- silverstris. Forma selvatica dioica

- sativa. Forma coltivata con fiore ermafrodita

Dopo la domesticazione, avvenuta probabilmente nella zona del Caucaso circa 6.000 anni fa.

Da questa regione si è diffusa sia verso oriente sia verso occidente. Arriva in America molto di

recente dopo la Scoperta 1492 e incrociandosi con varietà selvatiche locali e ha acquisito

caratteristiche di adattamento.

Dall’America del Nord arriva nell’’Estremo Oriente molto recentemente (1958).

L’interfertilità delle specie che ha prodotto ibridi vigorosi, ha permesso la diffusione a livello

mondiale.

Protagonisti di questo sono i processi di ibridazione e introgressione.

Introgressione = quando si incrociano due specie diverse, l’ibrido è svantaggiato perché sono più

adatte le specie parentali, o per lo meno una delle due specie parentali. Quindi rincrociandosi

ripetutamente con la specie parentale adatta, assomiglierà moltissimo a questa, ma ha

“introgredito” alcuni caratteri dell’altra specie.

È quello che è avvenuto in vite perché sono stati i reincroci su Vitis vinifera (di interesse

agronomico) che hanno permesso di introgredire caratteri adattativi provenienti dalle specie

selvatiche americane.

Dopo la domesticazione, le colture si sono diffuse dal Centro di origine verso altre regioni del

mondo. Su di loro hanno agito:

1) selezione naturale che selezione per caratteri adattativi:

- adattamento al fotoperiodo (molte specie sono legate alla lunghezza del giorno per passaggio

dalla fase vegetativa a quella riproduttiva-fioritura). Es: soia.

- modifica della richiesta di vernalizzazione. Molte specie hanno necessità di un periodo di freddo

per l’induzione a fiore e questo limita l’ambiente di coltivazione.

- no-shattering delle infruttescenza. È il primo carattere che viene modificato con la

domesticazione, ossia quello di trattenere il seme e non rilasciarlo.

- ridotta dormienza dei semi.

2) selezione umana (prevalente)

- dimensioni della pianta, n° ramificazioni;

- n° ridotto di infiorescenza ma di grandi dimensioni (es: mais, girasole);

- riduzione dei costituenti tossici, ossia la presenza di metaboliti che possono ridurre l’appetibilità.

Selezione antropica + selezione naturale = Landraces

È la risposta di una popolazione coltivata alla selezione naturale e antropica, in equilibrio quindi

con l’ambiente nel quale si sono evolute e “mantenute” in maniera stabile.

Sono la risposta anche alle variazioni culturali aspetto di notevole importanza (salvaguardia dei

saperi contadini).

Maggiore è la diversificazione degli ambienti nei quali la coltura si diffonde e maggiore sarà la

diversificazione dei materiali coltivati.

Le Landraces possono essere viste come “varietà che si differenziano per l’organizzazione genetica

per la produttività”. 24

Popolazioni coltivate in equilibrio con l'ambiente in cui si adattate, selezionate e incrociate e per cui

si sono mantenute stabili per lunghi periodi.

Non sono mai state varietà molto produttive, ma quella produzione attraverso caratteristiche di

resistenza al secco, di germinabilità a bassa temperatura, di ciclo vegetativo corto. Quindi

un’organizzazione genetica differente che ha selezionato caratteristiche diverse in funzione delle

condizioni dei diversi ambienti.

Le consideriamo importanti proprio perché sono il frutto di centinaia di anni di generazioni di

selezione di mutazioni spontanee, incroci spontanei difficili da rimettere insieme.

Hanno grandissima variabilità. Sono state selezionate dalla selezione naturale e dagli agricoltori

per la stabilità affinché siano in grado di dare quella poca produzione sempre. Non avranno grande

potenziale produttivo ma hanno stabilità dovuta alla variabilità che assicura a queste popolazioni

l’evoluzione.

Tra le varietà landraces: Bianco perla, fagiolo di Lamon.

La grande variabilità deriva dal fatto che si sono evolute in condizioni eterogene nel tempo (es:

tempo atmosferico diverso in diverse annate) e nello spazio (possibilità o meno di irrigazione).

La selezione è stata dunque una selezione per la rusticità più che per la produttività.

Sono fonti di geni assemblati in maniera diversa di alto valore adattativo, frutto di una lungo

selezione per l’adattamento.

Es: inversioni cromosomiche

Il cromosoma con geni A B C D E F, subisce una rottura (per mutazione) e un frammento si

riattacca invertito per cui avremo ad esempio A D C B E F. Il cromosoma è assolutamente

funzionale, tuttavia quando l’individuo che porta questa mutazione in condizioni di eterozigosi e si

riproduce i due cromosomi devono appaiarsi. In questo caso non c’è omologia.

A B C B

A

A D C D

Allora un cromosoma fa un’ansa e l’altro fa un anello permettendo l’appaiamento. L’individuo sarà

fertile e porterà metà gameti con inversione e metà gameti senza inversione. Se però avviene un

crossing over avremo dei cromosomi che portano geni duplicati e che sono geni privi di alcuni geni

e due cromosomi non vitali. Per cui si dice che l’inversione è una mutazione che sopprime il

crossing-over. In realtà se avviene il suo risultato è nullo e i gameti vengono eliminati. Quindi non

può mai avvenire crossing-over, tra quei geni.

Questo è un meccanismo potentissimo perché non permette ai geni di ricombinare, non permette

la ricombinazione intra-cromosomica). Quindi i geni BCD stanno sempre assieme.

Noi non riusciremo mai a selezionare linee che portano analoghe inversioni.

Si creano quindi dei “blocchi di geni di adattamento” in cui sono tenuti insieme caratteri importanti

per l’adattamento in determinati ambienti e sono bloccati (non c’è ricombinazione).

Dall’inizio del miglioramento genetico scientifico il panorama è cambiato. Si è passati dalle vecchie

varietà rustiche e con ampia variabilità, tutte diverse tra di loro, a varietà altamente produttive con

una base genetica molto ristretta perché:

- l’uniformità e diventato uno dei parametri della selezione (es: linee pure);

- selezione per obiettivi definiti.

A mano a che i processi di miglioramento vanno avanti, per costituire una nuova varietà, si parte

dall’ultimo materiale migliorato, e quindi la base genetica si restringe.

L’introduzione delle nuove varietà altamente uniformi e produttive, ha determinato la scomparsa in

qualche decennio delle vecchie varietà che si erano mantenute per centinaia di anni. Dunque

miglioriamo, ma ci preludiamo così la possibilità di nuovi miglioramenti in funzione dei nuovi

obiettivi che potrebbero essere necessari in futuro.

EROSIONE GENETICA = perdita di variabilità dovuta, in questo caso, al ristringimento della base

genetica. 25

Il restringimento della base genetica del materiale coltivato, ne aumenta l’uniformità limitando

quindi la capacità di una risposta adattativa. L’uniformità rende le colture più vulnerabili ai

cambianti in presenza di patogeni.

Es: Razza T in USA che ha sterminato il mais (1970);

Epidemia di peronospora che ha devastato le coltivazioni di patata in Irlanda (1845-46).

Causa dell’erosione genetica

- Il successo delle variabilità create dai breeders (paradosso del miglioramento genetico);

- Pratiche colturali;

In generale le colture nonostante abbiano una potenzialità produttiva enorme, necessitano di

pratiche raffinate. E quindi Il diserbo, l’eliminazione delle razze infestanti ad esempio dai bordi dei

campi coltivati, elimina variabilità;

- Degrado ambientale (in primis la deforestazione);

- Risemina di pascoli con miscugli standard di sementi.

Conservazione biologica --> ha lo scopo di impedire l’estinzione degli organismi (specie,

popolazioni, singoli individui) con priorità la protezione di quelli che rischiano un’imminente

estinzione.

5 principali minacce alla consevazione della Biodiversità sono rappresentate da :

- perdita e degrado degli habitat;

- introduzione di specie alloctone invasive (globalizzazione);

- inquinamento e carico alimentare;

- sovra-sfruttamento del territorio e uso non sostenibile;

- cambiamenti climatici.

Zone a maggior rischio di estinzione di specie (Hotspots)

Sono 34 e sono individuate sulla base di:

- ricchezza delle specie presenti;

- specie endemiche;

- rischio di alterazione dell’habitat.

Sono soprattutto le fasce costiere e le zone insulari.

Molte zone nel bacino del mediterraneo (coste dell’africa e isole del mediterraneo, Liguria, Grecia,

…).

Si parla allora di conservazione della diversità biologica (e quindi diversità genetica).

Conservazione genetica. Per la FAO è l’insieme delle azioni politiche e gestionali sviluppate per

assicurare la continua esistenza e disponibilità della variazione genetica.

La diversità è potenzialmente utile per l’uomo, per migliorarne le condizioni di vita che potrebbero

necessitare di nuova variabilità genetica.

Risorse genetiche vegetali

Sono costituite dalla diversità genetica complessiva delle specie coltivate e delle specie selvatiche

affini e può risultare preziosa per il miglioramento genetico (concetto di utilità). La biodiversità, per

il fatto che esiste ha il diritto di continuare ad esistere.

Risorse genetiche 26

Insieme di materiale biologico che porta una specifica informazione genetica o che presenta una

particolare variabilità genetica.

La conservazione delle risorse genetiche persegue tre obiettivi:

1) Preservare la potenzialità per ottenere combinazioni genetiche favorevoli (preservare le varianti

alleliche grazie alle quali possiamo ricostruire combinazioni favorevoli);

2) Preservare l’adattabilità genetica (Landraces);

3) Preservare la variabilità genetica non conosciuta (tutto ciò che è possibile va preservata perché

può tornare utile in futuro soprattutto per il fatto che oggi possiamo andare oltre le barriere di

compatibilità sessuale).

Tipi di risorse genetiche

1. Landraces

Selezionate per caratteri di interesse agronomico;

2. Ecotipi

Selezionate per l’adattamento;

3. Forme infestanti (selvatiche)

Possono essere utili per il miglioramento;

4. Specie selvatiche tassonomicamente affini a quelle coltivate

Possiamo da queste ricavare forme di resistenza a nuovi patogeni, stress, …;

5. Vecchie varietà commerciali

Varietà coltivate negli ani 50-70 in mano alle ditte sementiere che non vanno mai perse;

6. Linee che fanno parte di miglioramento

Materiale scartato ma mantenuto perché potenzialmente interessanti;

7. Mutanti spontanei o indotti

Es: frumenti nani portati in America dal Giappone alla fine della II Guerra Mondiale tornati utili

nella Rivoluzione Verde;

8. Varietà attuali.

Come possiamo utilizzare questi materiali?

- partire da una popolazione (Landraces, ecotipo) e selezionare per alcune caratteristiche;

- fonte gruppi di geni (materiale utilizzato come parentale per incroci per trasferire specifici

caratteri a materiali di maggiore pregio);

- fonte di singoli geni (con tecnologie di ingegneria genetica). (es: Laurical pag 48)

Tutte le vecchie varietà (o ecotipi), sono tante popolazioni diverse che appartengono alla stessa

specie e che si sono differenziate per condizioni ambientali e colturale. Per cui il loro pregio sta nel

fatto di esser tante e diverse e ci danno l’opportunità di pescare caratteristiche diversa, assemblate

in modo differente (es: resistenza alla siccità + resistenza a certe malattie, resistenza alla siccità +

resistenza al freddo,…).

Nelle specie che noi oggi coltiviamo hanno avuto un ruolo importante processi di ibridazione

avvenuti nei corso del tempo associati a processi di poliploidizzazione

= raddoppiamento del numero cromosomico – un ibrido interspecifico per definizione è sterile ma

acquista fertilità quando il suo numero cromosomico si raddoppia e quindi ogni cromosoma trova il

suo omologo con il quale appaiarsi durante la meiosi.

Questi processi nei grandi numeri dell’evoluzione sono avvenuti molte volte e la maggior parte

delle nostre specie son in realtà di origine poliploide (Es: frumento già visto, Triticale, fragola)

Triticale. Poliploide artificiale (incrocio di un triticum con una secale).

Fragola (moltiplicazione vegetativa)

Come la coltiviamo oggi è ottoploide e la chiamiamo Fragaria x ananassa 2n=8x=56. Il nome

botanico ci dice che è un ibrido e deriva dall’incrocio tra due specie Nord americane che erano a

loro volta già ottoploidi (Fragaria chiloensis 2n=8x=56 e Fragaria virginiana 2n=8x=56). L’incrocio

è avvenuto in Europa. la fragola con fiori ermafroditi, come noi la conosciamo, è invece il frutto di

selezioni successive artificiali perché inizialmente erano dioiche (a sessi separati). Come si sono

formate le specie ottoploidi non si sa. 27

POLIPLOIDIA

È una mutazione genomica (che riguarda l’intero genoma) data dalla presenza di set multipli di

cromosomi.

Vi è il n° cromosomico 2n ma questo deriva dall’unione di set multipli (2n=4x, 6x, 8x).

È diffusissima nel mondo vegetale e praticamente non esiste nel mondo animale. È molto rara

anche tra le Gimnosperme.

Nelle Angiosperme è diffusissima tanto che si ritiene che tutte le specie che tutte le specie che

hanno n° di gameti n > 9 siano dei poliploidi ma è possibile anche con numeri più bassi.

L’evoluzione attraverso al poliploidia può avvenire in due modi

Abbiamo specie di origine:

1) Autopoliploide Più serie dello stesso genoma. Vi è stato il raddoppiamento di un n°

cromosomico. Solitamente sono in genere autotetraploidi (2n=4x, non in numeri superiori).

Es: patata, medica.

2) Allopoliploide Unione di genomi diversi formatisi a seguito di ibridazione interspecifica e

successivo raddoppiamento cromosomico. Es: frumenti, cavoli, tabacco

(autotetraploide) melo, pero, vite (alloesaploide).

Poliploidizzazione sessuale

Forma di poliploidizzazione dovuta alla fusione di gameti non ridotti derivanti da un nucleo di

restituzione formatasi al termine della prima o della seconda divisione meiotica.

Incrocio interspecifico tra due specie A e B a diverso numero cromosomico (A→ 2n=4 e B→ 2n=6).

La specie B produce un gamete normale da tre cromosomi che va a incrociarsi con un gamete non

ridotto prodotto dalla specie A per errore nella meiosi.

Si riuniscono quindi in uno stesso individuo 7 cromosomi. Quando l’individuo va a produrre gamete

per riprodursi è sterile, ma qualche gamete può avere tutti e 7 questi cromosomi. Questo perché

quando vanno in meiosi e non riescono ad appaiarsi, si attardano a cercare l’appaiamento e inizia

la separazione. Per cui tutti rimangono nello stesso nucleo (nucleo di restituzione). Se questo

individuo viene fecondato da un gamete normale, porta ad un numero cromosomi 2N=10 che è la

somma dei due genomi (7+3).

L’allopoliploidia si forma attraverso 2 passaggi successivi di ibridazioni iter-specifiche che

richiedono il coinvolgimento di gameti non ridotti. Spesso avvengono più volte (origine multipla).

Non per tutte ma per alcune specie, come le Brassiceae esistono le specie diploidi di origine. Per

queste, è stata ripercorsa sperimentalmente la strada, la modalità di formazione delle nuove

specie.

Perché ci sono così tante specie poliploidi e sono poi allopoliploidi

Perché una specie che deriva dall’assemblaggio di due o tre assetti cromosomici diversi, ha molte

più chance di affermarsi. Si è visto che le specie a numero cromosomico più alto, si trovano negli

ambienti ecologicamente più difficili (es: aumenta la frequenza dei poliploidi andando verso il

circolo polare, nel deserto allontanandosi dalle oasi). Portando più assetti cromosomici, coppie

multiple dello stesso gene, sono in grado di acquisire mutazioni senza perdere però la caratteristica

originaria.

Come sono i poliploidi dal punto di vista fenotipico

28

Le specie poliploidi, avendo un elevato numero di cromosomi, hanno cellule più grandi.

Questo, negli organi ad accrescimento definito, può portare alla presenza di organi più grandi. È un

aspetto molto sfruttato ad esempio in floricoltura (es: fiori di maggiori dimensioni). Per contro, il

fatto di avere molti cromosomi, rallenta le divisioni cellulari, per cui negli organi che non sono ad

accrescimento determinato, possiamo avere il comportamento opposto, ossia minori dimensioni

(es: alberi nani ornamentali).

Es: cotone

Gossipium hirsutum Gossipium barbadense

n=4x=52 2n=4x=52

Genomi AADD Genomi AADD

Domesticato in Messico Doemesticato in Sud America

ono tetraploidi, uniscono genomi A e D che vengono indicato con lettere diverse perché derivano da specie

iverse.

genoma A è originario del Vecchio Mondo e potrebbe essere derivato sia da G erbaceum o G arboreum, due

pecie selvatiche senza interesse.

genoma D che ha conferito le caratteristiche di interesse, probabilmente deriva da una specie di origine

eruviana

G raimondii o simile).

Le organizzazioni internazionali per la salvaguardia delle Risorse genetiche vegetali

Dal punto di visto operativo, l’organismo che coordina tutte le attività di coordinazione delle risorse genetiche

il CGIAR, istituito ancora negli ’70 e più recentemente ne furono rivisti gli scopi.

un’istituzione che si occupa della ricerca agricola a livello internazionale e contribuisce attraverso la ricerca

nternazionale e la collaborazione con i governo locali al miglioramento dell’attività agricola e forestale ne

aesi in via di sviluppo in modo da migliorare le condizioni dell’alimentazione e il benessere delle popolazioni

CGIAR esplica la sua attività attraverso 15 centri di ricerca internazionali distribuiti per la maggior parte in

ei paesi in via di sviluppo tranne l’IPGRI che ha sede a Roma (ruolo di gestione delle banche dati) e

ell’IFGRI che ha sede a Washington (gestione delle politiche internazionali).

Centri internazionali CGIAR

CIMMIT: istituito in Messico, centro di miglioramento del mais (originario) e del frumento e nel quale son

tate eseguite molte delle attività che hanno portato alle varietà nane del frumento.

CIP: centro internazionale della patata a Lima (Perù) perché ha origine andina e li si trova la maggiore

iversificazione.

IRRI: si occupa di riso. Conserva circa 110.000 accessioni di riso tra coltivati e selvatici.

CIFOR: è l’ultimo nato, si occupata di risorse forestali con sede in Indonesia che negli ultimi decenni ha molt

roblemi di deforestazione per la coltivazione della palma da olio.

ICARDA: si occupa della ricerca in aree siccitose

Biodiversity international (ROMA)

Triplice scopo dei centri del CGIAR

) produrre nuove varietà da coltivare adatte soprattutto ai paesi in via di sviluppo che non possono utilizzar

randi input energetici in termini di concimazioni, seme costoso, macchine per la lavorazione;

) mettere a punto sistemi di coltivazione più idonei per questi materiali;

29

) creare le banche genetiche per la conservazione delle varietà locali. Quando è possibile sono banche de

eme (più facile da conservare e occupa meno spazio). La conservazione va fatta comunque in celle a

emperatura e umidità controllate e rigenerare ogni anno una quota di seme in funzione della germinabilità.

semi di molte specie tropicali o che contengono olio non sono conservabili e quindi si conserva materiale in

itro con elevati costi di gestione o in arboreti (Es: ICARDA nell’altipiano dell’Iran ha un arboreto di noci

entro di origine).

Conservazione delle risorse genetiche

Conservare le risorse genetiche significa mantenere la variabilità genetica delle specie secondo criter

conomicamente e socialmente accettabili e gestirle in modo che siano utilizzabili da tutte le istituzion

ubbliche e private che facciano richiesta. Inoltre affinché siano utilizzabili, le accessioni devono essere

escritte per:

temperatura di germinazione

fabbisogno fotoperiodico

portamento

descrittori morfologici

caratteristiche adattative

stress biotici e abiotici

caratteristiche qualitative

….

e strategie per conservare le risorse genetiche sono:

1. In situ --> mantenimento di popolazioni vegetali in coltivazione nell'ambiente di adattamento.

Conservazione dinamica: le popolazioni restano in perfetto equilibrio con l'ambiente da

momento che le frequenze geniche vengono lasciate libere di fluttuare in risposta alle divers

ressioni selettive esercitate dall'ambiente.

Importante per:

- selezione di popolazioni di base e varietà superiori

- preservare processi evolutivi

- salvaguardare biodiversità

- valorizzare zone agricole marginali

2. Ex situ --> mantenimento di materiali vegetali di specie coltivate e semi in banche de

germoplasma.

Conservazione statica: mantenimento costante di frequenze geniche che caratterizzano le

opolazioni da conservare.

Nelle banche dati, vengono costituite le cosiddette core collection, in sub-collezione di accession

appresentative che vengono moltiplicate in maniera massiva e messe a disposizione delle istituzioni. La core

ollection “include la massima variazione con il minimo di ripetitività.

3. On farm --> mantenimento delle antiche varietà locali nell'areale di adattamento soprattutto pe

ottenimento di prodotti alimentari dotati di tipicità.

- Coltivazioni di varietà da parte di agricoltori

- salvaguardia del patrimonio niologico

- tutela delle tradizioni colturali

Utilizzazione della variabilità genetica nel miglioramento genetico

Conseguenza della domesticazione, se la specie riesce ad evolvere ed adattarsi alle condizioni ambienta

iverse, è la diffusione. Questo fa sì che si possa reperire in ambienti diversi:

resistenze agli stress abiotici (T°, acqua, luce, …) e biotivi;

varianti con caratteristiche qualitative particolari.

s:

ricerca nel riso (IRRI) di un gene per la resistenza alla Sogatella furcifera in rapida diffusione(co lo

creening sono stati trovati geni nel materiale coltivati, ma con più alta frequenza nei materiali selvatici).

30

ricerca nel riso di un gene per la resistenza ad una virosi che blocca la formazione della spiga che non esce

alla guaina (gene trovato in una specie selvatica).

e risorse genetiche possono essere utilizzate :

per nuove domesticazioni;

come popolazioni di base per fare selezione;

come parentali per fare incroci;

fonte di geni singoli.

s: Varietà transgenica di colza (cv. Laurical).

stata modificata la composizione dell’olio: l’acido laurico (utilizzato in industria per la produzione di saponi e

etergenti), che è l’acido grasso a più corta catena di carbonio (12 atomi) è presente tra gli acidi grassi pe

irca il 40%. La modifica è stata ottenuta trasferendo un gene che codifica per ACP-diesterasi dalla

Umbrellifera californiana (pianta selvatica senza interesse agronomico) in grado di bloccare l’allungamento

elle catene degli acidi grassi con il conseguente accumulo di acido laurico.

QUALI SONO GLI STRUMENTI CHE ABBIAMO PER ANALIZZARE LA VARIABILITÀ GENETICA?

Richiami Il DNA è una molecola polinucleotidica, ovvero costituita da una successione d

nucleotidi costituiti da:

- base azotata, rivolta verso l’interno della molecola;

- gruppo fosfato rivolto verso l’esterno;

- zucchero a cinque atomi di carbonio rivolto verso l’esterno.

La posizione permette ai gruppi fosfati di legarsi tra loro e dare stabilità all

molecola.

L’allungamento della molecola del DNA avviene solamente in una direzione (5’→

3’). L’aggancio del nucleotide successivo può quindi avvenire sul carbonio 3

dove c’è un OH libero mediante un legame fosfodiesterico (molto stabile) e s

libera un nuovo OH sul carbonio 3’. Si dice quindi che il filamento del DNA h

una polarità: ad un estremità il carbonio libero è quello in posizione 5’ con

ruppo fosforico e l’altra estremità ha il carbonio 3’ libero con l’OH.

a molecola del DNA è costituita da due filamenti polinucleotidici caratterizzati da perfetta complementarietà

elle basi azotate che si appaiano tra di loro sempre nello stesso modo: adenina-timina, citosina-guanina. Ne

momento in cui il DNA si replica i due frammenti si separano e la successione di basi funge da stampo per la

intesi del nuovo filamento complementare.

Quando si forma il legame fosfodiesterico che libera quattro atomi di fosforo, si generica una carica elettrica

egativa.

Nei due filamenti complementari, in cui la posizione dei gruppi fosfati permette ai filamenti di legarsi tra loro

dare stabilità alla molecola, le basi timina e adenina che si fronteggiano si legano son due ponti idrogeno e

e basi citosina e guanina si legano con tre ponti idrogeno.

due filamenti si dicono antiparalleli, poiché avendo orientamento 5’ 3’ invertiti, si allungano in direzion

pposta.

Replicazione del DNA

rocesso di sintesi di nuovo DNA catalizzato dall'enzima DNA polimerasi. E' un processo semiconservativo e

emidiscontinuo.

Richiede 1 filamento stampo, l'enzima DNA polimerasi e la presenza di un innesco che esponga un C3' con

OH libero all'azione della DNA polimerasi. 31

MARCATORI DEL DNA

trumenti permettono di analizzare la variabilità genetica a livello della sequenza del DNA.

un segmento di DNA, un tratto di cromosoma, fenotipicamente rilevabile e che permette di individuare un

ratto cromosomico ben definito.

quindi un locus genomico rilevabile con:

sonda specifica

un tratto di DNA a filamento singolo ibridato, va a cercare la sequenza complementare per formare il ponte

drogeno. Quindi attraverso la sonda si può individuare dove sta la sequenza complementare.

primer - innesco specifico

=corto oligonucleotide (10-30) a singolo filamento con un ossidrile libero che attaccandosi al filamento

stampo del DNA denaturato funge da innesco per la reazione di polimerizzazione di un nuovo filament

per opera della DNA polimerasi.

Quando nella provetta inserisco il pezzetto di DNA che funge da innesco, questo va a cercare la sequenza

omplementare alla quale si attacca e parte da DNA polimerasi. Quindi la sequenza dell’innesco permette d

dentificare con sicurezza il locus genomico che vado a replicare.

MARCATORE MOLECOLARE  frammento di DNA di dimensione variabile e riconducibile ad un locus genomico

ilevabile con sonde (probe) o inneschi (primer) che contraddistingue in modo caratteristico e inequivocabil

tratto cromosomico con il quale si identifica (a quel punto, possono fare il confronto tra individu

opolazioni, specie, confrontando quel tratto cromosomico) e le regioni che lo circondando alle estremità 5’ e

’.

er il tratto cromosomico, in realtà è la stessa cosa che faceva Mendel quando confrontava le piante di pisello

er il colore del fiore. Confrontava un tratto cromosomico, ossia il tratto cromosomico che codifica per

olore del fiore, andando a vedere il fenotipo morfologico. Noi facciamo gli stessi confronti andando però

edere il fenotipo molecolare e le regioni che lo circondando alle estremità 5’ e 3’.

Ciò significa che il locus genomico che si analizza è delimitato dalle regioni che hanno sequenza nota, ossia

uella degli inneschi che abbiamo immesso e che fiancheggia il tratto di DNA.

Mendel  carattere utile ed ereditabile SE esiste almeno in due forme (fenotipi)

Marcatori  fenotipo riconducibile ad un una forma alternativa di un gene specifica(allele) o parte del tratto

romosomico

Caratteri morfologici  un singolo fenotipo può dipendere da più geni.  MARCATORE MORFOLOGICO

Gene è polimorfico  se presenta almeno due alleli diversi  mutazioni

Gene è monomorfico  Ex. (tutti semi gialli) non è un carattere utilizzabile come marcatore perché g

ndividui per quel tratto di cromosoma sono tutti uguali.

Le due sequenze che fiancheggiano il cromosoma s

conoscono sempre perché sono quelle del primer. L

sequenza del frammento possiamo conoscerla o meno i

funzione della tecnica che usiamo.

I marcatori morfologici hanno dei limiti :

- è difficile in una specie trovare caratteri morfologici che s

presentano in forma alternativa chiaramente distinguibili;

- epistasi, penetranza incompleta. L’epistasi è un tip

’interazione intergenica per cui la situazione ad un locus condiziona la manifestazione di un altro (es: colore

ella zucca). Penetranza incompleta significa che tutti gli individui che portano un certo genotipo

manifestano quel carattere. Se un gene ha penetranza incompleta, l’analisi fenotipica è labile.

32

è difficile risalire dal fenotipo al genotipo. È possibile solo per quei caratteri che vengono definiti mendelian

emplici, caratteri controllati da un solo gene. Per altezza, epoca di fioritura, contenuto oleico, produzione d

ranella, il passaggio da fenotipo a genotipo è impossibile perché i caratteri sono controllati da molti geni.

sono influenzati dall’ambiente. Due piante di genotipo identico coltivate in ambienti diversi, sono diverse tra

i loro.

Aspetti positivi dei marcatori molecolari:

Analisi fatta a livello di DNA  non vi sono interazioni dal parte dell’ambiente. Non vi sono differenza a livell

i fenotipo molecolare in funzione delle diverse condizioni (età, ambiente,…)

Si può analizzare qualsiasi parte del genoma permettendo confronti tra individui sia tratti di DNA che

ontrollano caratteri fenotipici più o meno importanti o regioni intergeniche non trascritte rilevando differenze

ra individui che sono geneticamente molto simili e fenotipicamente identici (es: si possono rilevare differenze

livello di regioni non trascritte, che non danno origine a proteine, ma che magari hanno funzione d

egolazione dell’espressione);

Si può distinguere la condizione eterozigote da quella omozigote in funzione della tecnica usata.

Uso dei marcatori molecolari

Analizziamo se nel tratto di cromosoma gli individui sono tutti uguali tra di loro (monomorfici) e in questo

aso non avremo nessuna informazione utile o se ci sono delle differenze (polimorfismi). I polimorfismi non

ono altro che la conseguenza di mutazioni. NB: gli allei diversi di Mendel, sono conseguenze di mutazioni da

n iniziale carattere unico. Quindi si analizzano polimorfismi in regioni omologhe del DNA ossia nello stess

ratto cromosomico d’individui diversi.

Non è detto che i marcatori molecolari siano riconducibili all’azione di un gene. Possiamo analizzare, infatti

n tratto cromosomico in regioni non codificanti (NB: nel genoma umano solo il 3% e codificante).

Quindi ci si basa, non su specifici geni, ma sulla rilevazione di differenze a livello di regioni della molecola d

DNA e la certezza di confrontare la stessa regione negli individui è data dal primer.

marcatori studiati si basano su una tecnica di base = Reazione a Catena della Polimerasi (PCR)

marcatori PCR - derivati.

PCR

a reazione a catena della polimerasi, utilizza l’enzima DNA polimerasi per replicare molte volte (amplificare

na delimitata regione del DNA, un determinato frammento del DNA, ossia quello delimitato dai primer.

Una volta partita la DNA-polimerasi che duplica quel frammento selezionato, questo a sua volta funge da

tampo per la sintesi di un nuovo frammento. Quindi ad ogni ciclo di replicazione raddoppia il numero di copie

el frammento (amplificazione esponenziale).

Affinché la DNA-polimerasi sia in grado di replicare il frammento, è necessario che il DNA si denaturi. Quest

i ottiene portando la provetta ad una certa temperatura piuttosto elevata che consenta la rottura dei legam

drogeno. Così facendo però denaturo anche la DNA-polimerasi stessa.

a scoperta che ha segnato una svolta è stata la Taq DNA polimerasi. È la polimerasi di un batterio (Thermu

cquasticus) che vive nelle acque termali a 72°C e in grado quindi di tollerare temperature elevate (fino 95°).

quindi necessaria questa DNA-polimerasi e che i primer selezionino il frammento. Questi primer saranno

ovviamente a singolo filamento (singola elica) perché solo in questo mod

si attaccheranno alla sequenza complementare permettendo alla Taq d

partire.

Come funziona la reazione a catena della polimerasi?

33

Vengono messi all’interno della provetta: DNA dell’individuo da analizzare, Taq-polimerasi, primer, nucleotidi

si fa partire la reazione.

tutto avviene con una serie di cicli di cambio di temperatura mediante il termociclatore.

A) Avvenuta la denaturazione (94-95°C), appena le condizioni di temperatura della reazione lo permettono, s

ormano i ponti idrogeno (37°-55/60°C – in funzione di quanto lungo è il primer, delle basi azotate) e i primer

anno ad ibridare (attaccarsi) dove trovano la sequenza complementare.

A questo punto, con il primer che ha il carbonio 3’ con l’OH libero, può partire la DNA-polimerasi

nalogamente in entrambi i frammenti che si allungano uno verso l’altro (direzione 5’-3’). Vengono così

intetizzati i nuovi frammenti delimitati inizialmente dai primer.

B) Avviene nuovamente un ciclo e i nuovi frammenti avranno come stampi i due frammenti originali e i due

rammenti sintetizzati dagli originali dalla prima DNA-polimerasi (in tutto 4 molecole di DNA). Ad ogni ciclo si

addoppia la quantità di copie del frammento.

30

a PCR dura di norma 25-30 cicli e avremmo 2 copie del frammento.

Fasi della PCR

) Denaturazione del DNA

Rottura dei ponti idrogeno tra i due frammenti complementari (94-95%);

) Annealing

bridazione dei primer con la sequenza complementare riformando i ponti idrogeni ad una temperatura che

uò andare dai 37 ai 60°C;

) Allungamento

Avviene a 72°C in funzione dell’enzima del Thermus aquaticus.

termociclatore opera questi cicli termici in maniera molto precisa poiché sbagliare anche di mezzo grado

uò compromettere l’efficienza della reazione (es: ibridazione anche con base errata).

ciclo dura di norma 2min:

30 sec. Denaturazione;

30 sec. Annealing;

1 min. Allungamento.

a variazione di temperatura deve essere pressoché immediata.

imiti della DNA-polimerasi:

necessità frammento stampo;

necessità innesco;

non riesce a replicare frammenti troppo lunghi.

a capacità di polimerizzazione è di circa 2000 paia di basi. Quindi può avvenire se i due primer trovano

innesco ad una distanza compatibile con la capacità di polimerizzazione. Se sono troppo distanti non vi

arebbe amplificazione.

Tipi di primer

Primers casuali

Utilizzo per fare analisi di variabilità genetica in una popolazione oppure per sapere se due individui sono lo

tesso clone o cloni diversi. In tal caso non interessa quale frammento amplifico. Mi basta che siano gli stessi

egli individui che vado a confrontare. Conosciamo la sequenza dei primer ma non dove andranno ad

mplificare.

- RADP (Rapid) - AFLP. 34

Primers specifici per un determinato sito

i utilizzo per amplificare frammenti specifici (primer di 25-25 nucleotidi).

- SSR, marcatori microsatelliti;

- SNP, marcatori che analizzano mutazioni di singoli nucleotidi.

Distiguiamo inoltre:

marcatori multilocus (primers a sequenza casuale)

ermettono di analizzare più loci alla volta (anche 100) che derivano dall’amplificazione di tratti cromosomic

on primer a sequenza casuale. Proprio perché sono più brevi, è verosimile che trovino più siti d’ibridazion

ma il loro numero non lo conosciamo a propri. Quindi saranno amplificati più frammenti. In questo modo però

urante la separazione dei frammenti mediante elettroforesi, non siamo in grado di distinguere quali son

llelici tra di loro e quali sono su loci diversi.

er questo li consideriamo dominanti: andremo a rilevare polimorfismi solo mediante la presenza o assenz

el frammento, ma non siamo in grado dire se deriva da una situazione di omozigosi o eterozigosi (la PCR non

quantitativa, non ci dice se l’amplificazione è partita da una sola molecola inziale o da due cromosom

mologhi). Es: marcatori RAPD – amplificano circa una quindicina di geni alla volta e AFLP.

marcatori singolo locus (primers specifici)

ono marcatori che vanno ad amplificare un locus ben preciso e quindi analizzano un singolo locus alla volta

ono quelli che utilizzano primer specifici, ossia dei primer più lunghi perché identificare un locus ben preciso

n questo caso quando vado a separare i frammenti che ho amplificato, se l’individuo è omozigote per que

ocus amplifico un solo frammento e avrò una sola banda, mentre se è eterozigote ne amplifico due, avrò due

ande diverse e quindi conosco la situazione.

i dice che sono marcatori co-dominanti perché l’eterozigosi è riconoscibile. (Ex. RFLP, SSR, SNP)

marcatori RADP

ono marcatori multilocus il cui acronimo sta ad indicare “DNA polimorfico amplificato a caso” perché utilizza

solo primer a sequenza casuale.

a loro scoperta si basò sull’idea che:

e si devono usare dei primer casuali che non sappiamo dove vanno a ibridarsi, che senso ha metterne due?

’impiego di un solo primer permette di ottenere prodotto di amplificazione solamente se questo trova su

ue filamenti di DNA 2 sequenze uguali ma invertite e ad una distanza compatibile con la capacità d

olimerizzazione. Essendo corto (circa 10 nucleotidi), è in grado di trovare molti siti complementari d

ppaiamento nella sequenza stampo e quindi le possibilità che amplifichi sono alte. La numerosità d

olimorfismi RADP ottenibili varia da 6 a 12/primer, fino ad un massimo di 20, in funzione della sequenza de

rimer e della complessità genomica dell’organismo analizzato.

Dopo 20-30 cicli di PCR otteniamo i prodotti amplificati e li separiamo mediante elettroforesi. Per poter

edere, viene inserito nel gel un colorante specifico del DNA che ci permette di visualizzarne i frammenti (es

ybr Greeb).

e nel cromosoma omologo c’è un prodotto di amplificazione che differisce per dimensioni anche SOLO di u

ucleotide, abbiamo polimorfismo e la differenza si coglie. Se fosse uguale di dimensioni ma la differenza

tesse nella sequenza, non la si può vedere. Con i RADP si riconoscono polimorfismi dovuti soltanto all

imensioni.

MARCATORI MICROSATELLITI

SSR → Sequenza Semplice Ripetuta = 1 nucleotide di 2-5pb ripetuto in serie (microsatellite) e + polimorfism

ra individui diversi dovuti al numero di volte che il motivo di base è ripetuto.

STR → Sequenza Ripetuta in Tandem = sequenze nucletotidiche uniche nel cromosoma o nel genoma

onsiderato.

ono marcatori singolo locus, risultati dopo il sequenziamento del genoma umano nel quale sono stat

sservate quote molto ampie di sequenze ripetute. Sono quindi delle brevi sequenze, in regioni non

odificanti, di 2 o al massimo 4 nucleotidi che si ripetono moltissime volte (es: ACACACAC…).

35

ono marcatori molto informativi perché, essendo una serie ripetuta molto lunga, è molto facile che quando

DNA viene replicato vi sia un leggero errore (mutazione) che dà ad esempio una C in più o in meno e quindi

olimorfismi sono del numero di ripetizioni che hanno queste sequenze. Sono inoltre molto polimorfici.

ono considerati a livello internazionale il massimo dell’efficienza nel riconoscere le varietà di vite. Con 6 loc

n tutto si possono identificare quasi tutte le varietà di vite a livello internazionale.

ono marcatori co-dominanti, multiallelici e si distinguono in:

perfetti: senza interruzioni nella sequenza ripetuta;

imperfetti: con una o più interruzioni;

composti: più ripetizioni perfette e imperfette adiacenti tra loro.

MARCATORI SNPs (Polimorfismo di Singoli Nucleotidi)

ono marcatori a singolo locus, codominanti, basati sulla valutazione di polimorfismi riconducibili a differenze

i singoli nucleotidi in una sequenza genica.

ono molto presenti anche nelle regioni codificanti perché la sostituzione di un singolo nucleotide può anche

on alterare in maniera drastica la funzionalità di una singola proteina ( concetto di sinonimia -mutazion

ilenti e non sinonimia).

inonimia: la sostituzione non causa cambiamento amminoacidico nella proteina prodotta (mutazione

ilente).

Non-sinonimia: la sostituzione risulta un’alterazione dell’aminoacido codificato.

USO DEI MARCATORI MOLECOLARI

Fingerprinting molecolare

rofilo derivato dalla applicazione di determinati marcatori molecolari ad un genoma, al fine di renderl

iconoscibile e rintracciabile. È un’identificazione univoca dei segmenti di DNA che sono unici per que

articolare genotipo e ne consentono un’identificazione assoluta. Sono utilizzati ad es. per i test di paternità

n criminologia in genere.

Studio della diversità genomica

er il confronto tra ecotipi, varietà coltivate, specie diverse. È una valutazione relativa. Attraverso l

ostruzione di mappe di similarità, si trovano indici di similarità genetica (Dice). Se l’indice di similarità

mediato sui marcatori analizzati è = 1, indica identità; similarità = 0,96, incida similarità del 96% (i confront

evono essere eseguiti per essere attendibili su almeno 50 loci).

Diagnostica medica, animale e vegetale

er identificare ad esempio una malattia genetica, o nel caso di un fungo che infetta una pianta, dobbiamo

vere dei primer disegnati sul DNA del fungo per l’identificazione.

Mappe genetiche

er fare selezione

Aplotipo cultivar specifico

È un marcatore o più probabilmente una combinazione di marcatori che individuano in

maniera certa una varietà. Permette la tracciabilità dei materiali (vitigni). La tracciabilità dei

vini, invece, è più difficile per durante la fermentazione il DNA può frammentarsi e quindi è

possibile non trovare i marcatori (soprattutto per i vini “vecchi”).

Applicazione del fingerprinting genetico e delle stime di diversità genetica nel miglioramento

genetico

Costruzione di mappe genetiche

Mappaggio e selezione di QTL

Selezione assistita

Analisi sulla struttura genetica delle popolazioni

Indagini tassonomiche ed evoluzionistiche

Tipizzazione e identificazione varietale (applicazione caso di studio per le varietà di vite).

36

Studio dei sistemi riproduttivi

Costruzione di mappe genetiche

rappresentazione grafica dei singoli gruppi di associazione con indicazione dell’ordine e della posizione

elativa dei geni lungo il cromosoma determinata in base alle frequenze di ricombinazione. Anche fatte d

marcatori molecolari.

ono una rappresentazione grafica dei cromosomi della specie, intesi come gruppi di associazione nel senso

he tutti i geni che stanno sul cromosoma vengono ereditati in blocco perché i cromosomi passano interi ne

ameti e quindi tutti i geni che stanno sullo stesso cromosoma entrano nello stesso gamete.

Dobbiamo quindi costruire uno schema che rappresenti gli n cromosomi della specie e su questi cromosom

isporre, con le loro posizioni, tutti i marcatori che sono stati analizzati.

Gli altri n cromosomi portano gli stessi marcatori nella stessa posizione.

Nel caso del mais 2n=20, dovrò costruire tanti gruppi di associazione o gruppi linkage, quante sono le coppie

i cromosomi omologhi presenti nelle cellule somatiche della specie in esame ossia 10 gruppi di associazione

gruppi linkage di vite (2n=38, quindi ne dovremmo avere 19) con la posizione relativa dei diversi marcatori

iamo in grado di costruire mappe genetiche “sature”, ossia molto dense di punti che identificano framment

i DNA dei quali si riesce a stabilire la posizione sui diversi cromosomi in base alla posizione dei marcator

molecolari.

Vengono costruite, come faceva Morgan, in funzione della frequenza di ricombinazione.

n base al secondo principio di Mendel della segregazione indipendente: quando due geni stanno s

romosomi diversi, ricombinano con una frequenza del 50%. Se la frequenza di ricombinazione è più bassa

ignifica che quei due stanno sullo stesso cromosoma (sono “associati”) e vengono ereditati in blocco a meno

he a non avvenga crossing over e i due omologhi si scambino tratti di cromatidi. In tal caso ricombinano e la

requenza con cui ricombinano è proporzionale alla distanza che c’è tra quei due geni.

a frequenza di ricombinazione dei geni associati è dunque utilizzata per stimare la distanza di mappa

Un’unità di mappa, un centiMorgan (cM), è quella distanza genetica che consente un 1% di ricombinazione.

Nel momento in cui si riesce a mappare dei caratteri d’interesse agronomico, posso selezionare per un gene

’interesse attraverso il marcatore che mappa vicino ad esso anche se non conosco la sequenza del gene.

a mappa è uno strumento per poter selezionare i QTL

Mappaggio e selezione di QTL

ono loci che controllano caratteri quantitativi. La maggior parte dei caratteri d’interesse agronomico non

ono mendeliani semplici e controllati da un singolo gene o da comunque pochissimi seme, ma hanno un

ontrollo poligenico (carattere produzione granella/pianta o peso unitario delle cariossidi,…) e quindi non

engono trattati con i metodi dell’analisi mendeliana perché non possiamo risalire dal fenotipo al genotipo

diversamente dal colore piselli di Mendel – caratteri qualitativi). Perciò questi caratteri definiti quantitativ

perché sono espressi come quantità) vengono gestiti con strumenti di analisi statistica. L’obiettivo è quello d

dentificare questi QTL, quelle regioni/tratti cromosomici, nei quali ci siano geni importanti per la

manifestazione di un carattere. La costruzione della mappa è dunque il primo passo per risalire a caratter

’interesse che per la maggior parte sono quantitativi e fare….

SELEZIONE ASSISTITA (MAS) = selezione assistita da marcatori molecolari

elezione dei genotipi che determinano un fenotipo desiderabile condotta basandosi sull’analisi di marcator

molecolari strettamente associati a caratteri quali-quantitativi d’interesse.

Nel caso di un transgene è molto semplice perché, avendolo introdotto, ne conosciamo le caratteristiche

uindi è sufficiente fare un primer sulla sequenza della stesso o sul promotore.

Due linee di frumento scelte perché portano ciascuna una resistenza ad un diverso ceppo di un patogeno.

genitore 1 (AAbb) porta la resistenza (AA) alla razza 1 e il genitore 2 (aaBB) porta la resistenza (BB) alla

azza 2. L’obiettivo dell’incrocio è quello di creare ricombinazione al fine di trovare tra le discendenze delle

nee che ricombinino la resistenza al ceppo 1 e al ceppo 2 (AABB). Possiamo dunque incrociare e andare a

37

elezionare. Dall’incrocio otteniamo il diibrido (AaBb). Con una procedura tradizionale di selezione, nella F2 ho

a massima variabilità (tutte piante eterozigoti al 50% perché da F1 a F2 metà geni si fissano). Procedendo

er autofecondazione perdo eterozigosi.

Con una procedura tradizionale di selezione, non faccio selezione perché l’eterozigosi è molto alta. Tra le

ltre, vi saranno piante che dal punto di vista fenotipico sembra abbiano ricombinato le due resistenze

Continuo con queste piante fino alla F5-F6 per avere una quota di omozigosi che mi dia una certa sicurezza (è

ossibile comunque l’errore per errata inoculazione o per inoculo non correttamente funzionante per le

ondizioni ambientali).

Utilizzando i marcatori molecolari si può supportare la selezione. Dovrò naturalmente avere dei marcator

isegnati sulle resistenze o comunque strettamente associati ai geni di resistenza.

Marcatore associato alla resistenza al ceppo 1. Dall’autofecondazione dell’F1 avremo piante omozigoti per la

esistenza o la suscettibilità oppure eterozigoti. Cercherò quindi tra quelle resistenti su basi fenotipica le

iante omozigoti per la resistenza (per il gene A) (1-6-9-12-15-20).

Marcatore associato alla resistenza al ceppo 2. Cercherò tra quelle omozigoti resistenti al ceppo 1, quelle

mozigoti per la resistenza 2 e che quindi avranno ricombinato entrambi i caratteri di resistenza (15).

’omozigote (AABB) per entrambi i geni di resistenza può quindi essere selezionato già in F2.

Studio dei sistemi riproduttivi --> attraverso i marcatori molecolari possono analizzare qual è il tasso di auto

allogamia. Questo è utile, oggi come oggi, per verificare ad esempio l’inquinamento genetico da transgeni e

er verificare quali sono le distanze di isolamento da tenere affinché non vi sia inquinamento genetico.

Presupporti su cui si basa la costruzione di una mappa genetica

Ogni cromosoma è considerato un gruppo di associazione (gruppo linkage);

Dal momento che è stabile, tutti i geni che stanno sullo stesso cromosoma tendono a rimanere associati;

I geni associati possono separarsi durante la meiosi e ricombinare se avviene crossing over;

I meccanismi genetici di ricombinazione sono:

o

1) assortimento casuale dei cromosomi materni e paterni in metafase I che rimescola i

o

cromosomi; o

2) crossing-over. Rimescola i geni all’interno del cromosoma.

Se c’è la possibilità, la frequenza con cui si verifica il crossing-over tra due geni è funzione della loro

istanza. La frequenza, dunque, può essere utilizzata per stimare la posizione reciproca dei due geni.

a distanza tra geni può essere calcolata utilizzando appropriate popolazioni segreganti mediante test a due

unti o test a tre punti.

er la costruzione della mappa devo quindi prendere una popolazione di mappaggio costruita appositamente

ttraverso incrocio che ci dia una popolazione segregante nella quale siamo in grado di valutare la

icombinazione rispetto ai genitori.

NB: il reincrocio è l’incrocio di un ibrido con un omozigote recessivo. L’omozigote recessivo fa tutti gamet

ecessivi che sono ininfluenti ai fini del fenotipo e quindi permettono di vedere quale gamete ha fatto l’altro

enitore.

Cis: un genitore porta due dominanti e l’altro due recessivi

rans: un genitore porta un dominante e un recessivo e l’altro porta un recessivo e un dominante

TEST A DUE PUNTI

Metodo migliore per stabilire se due caratteri sono controllati da geni che si trovano sullo stesso cromosoma e

tabilire la loro distanza reciproca e il reincrocio.

Valuta tutti i valori di ricombinazione tra coppie di marcatori.

Analizzando la popolazione di mappaggio (almeno 100 piante) per 100-200-500 marcatori valuto 1° e 2°, 1

3°, 1° e 4° se segregano in maniera indipendente o se sono associati.

38

e segregano in maniera indipendente, la frequenza di ricombinazione è il 50% (2° principio di Mendel) a

meno che non si trovi un gene intermedio associato ad entrambi.;

° e 2° → ricombinano al 50% → sono su due cromosomi diversi

° e 3° → ricombinano al 50% → sono su due cromosomi diversi

° e 4° → ricombinano al 20% → il 4° sta a 20 cM dal 1°

Dopo che:

° e 4° → ricombinano al30% → allora anche il 2° è nello stesso cromosoma del 1° ma era così lontano che

ava ricombinazione 50%.

n° dei test a due o tre punti da fare è elevatissimo.

a distanza di mappa così trovata viene resa più precisa mediante test a tre punti che tengono conto de

oppi crossing-over.

a distanza di mappa tra due marcatori è definita come il numero di eventi di ricombinazione meiotici in

uella data regione. L’unità di matta è espressa in cM. Per convenzione un cM corrisponde ad una frequenza

i ricombinazione dell’1%, ossia la distanza che fa ottenere un gamete ricombinante ogni 100 prodotti dalla

meiosi (1 crossing-over ogni 25 meiosi perché ogni meiosi produce 4 gameti).È una distanza genetica e non

sica perché le frequenze di ricombinazioni sono diverse sul cromosoma (nella zona del centromero

vvengono meno).

Necessità di popolazioni di mappaggio segregante

se abbiamo una specie autogama, dobbiamo andare in F2 perché c’è segregazione o in un reincrocio (BC1);

se abbiamo una specie allogama, per cui i genitori sono già eterozigoti, l’F1 è già in segregazione.

e popolazioni di mappaggio per eccellenza sono quelle da reincrocio, ottenute incrociando una F1 con un

enitore omozigote recessivo. Però, anche la F2 è una popolazione segregante utilizzata per la mappatura.

Una volta fatta la mappa, l’obiettivo è quello di mappare cioè inserire nello schema dei geni di interesse de

oci che abbiamo un significato agronomico perché i marcatori sono dei loci anonimi, il cui significato

unzionale non è noto e molto spesso non lo hanno nemmeno.

Una volta che abbiamo inserito un gene d’interesse (es: gene di resistenza ad una malattia)e sappiamo ch

uesto si trova in una certa regione del genoma vicino ad un certo marcatore, possiamo selezionare per que

marcatore (che è sempre rilevabile a qualsiasi stadio di sviluppo della pianta e in qualsiasi condizione

mbientale) portando il gene di interesse che mappa vicino a meno di un crossing-over tra i due.

Selezione assistita (MAS)

’aspetto interessante è che mediante la MAS faccio selezione a livello genotipico, usando marcatori del DNA

trettamente associati a geni che controllano caratteri qualitativi (o monogenici) importanti, come ad

sempio quelli responsabili di molte resistenze a organismi patogeni. Se c’è il marcatore, sono sicuro che c’è

nche il gene di interesse a meno della probabilità di crossing-over.

QTL

oci in senso stretto, cioè geni che occupano precise posizioni ma loci intesi come tratto cromosomico che

ontrolla un carattere quantitativo, dove ci sono dei geni che hanno ruolo significativo perché fanno variare in

modo apprezzabile la manifestazione fenotipica del carattere.

e procedure di mappaggio per individuare e localizzare i QTL sono dette QTL mapping.

dunque un tratto cromosomico al cui interno non sappiamo cosa ci sia, ma verosimilmente potrebbe

rattarsi di più geni. Non si potrebbe individuare il tratto cromosomico andando ad analizzare la popolazione

d esempio per il peso del frutto perché questo ha un a variazione di tipo continuo.

39

ono identificabili, invece, attraverso l’associazione con i marcatori molecolari che variano in maniera

iscreta.

a mappatura di QTL può essere fatta solamente attraverso l’analisi della segregazione con marcator

molecolari. Si basa sulla co-segregazione (trasmessi assieme) fra i geni che controllano il tratto quantitativ

QTL) e uno o più marcatori molecolari.

Una volta identificato il QTL, posso isolare la regione del genoma, clonarla, sequenziarla e cercare di capire

uali geni ci sono e qual è il loro ruolo sul carattere di interesse.

Passaggi per mappare QTL

costruzione della mappa dei marcatori molecolari;

raccolta dei dati fenotipici sulla stessa popolazione per tutti i caratteri da mappare;

analisi che consente di mettere in evidenza la co-variazione del carattere fenotipico di interesse agronomico

on i marcatori.

Così facendo, individuiamo delle regioni cromosomiche. Pertanto non è una procedura precisissima come

uando si mappano geni singoli, ma viene valutata l’associazione con marcatori sulla base di un coefficient

i correlazione. Possono individuare delle regioni a volte anche molto grandi per cui il passaggio da QTL a

eni singoli non è semplice e immediato (es: in Arabidopsis 10 cM corrispondono circa a 440 geni).

Associazione tra un QTL e un marcatore

L’associazione si valuta attraverso un coefficiente di correlazione r ch

valuta la co-variazione lineare di due variabili e varia da più uno a meno. A

crescere dell’una cresce anche l’altra (+1), al diminuire dell’una diminuisc

anche l’altra(-1) o se variano in maniera dipendente(0). Può numerosa è l

popolazione di mappaggio e più affidabile è il valore.

e si riesce ad individuare più marcatori associati, la valutazione sarà più

precisa.

er l’individuazione dei QTL è necessario disporre di una mappa di marcatori molecolari quanto più densa

ossibile. Per ogni cromosoma devono essere presenti molti marcatori molecolari ad una distanza

referibilmente di non più di 10cM.

Due genitori omozigoti; l’F1 è eterozigote produce gameti che sono la ricombinazione dei due cromosomi

materno e paterno perché sono avvenuti molti crossing-over. I gameti si dice sono un “mosaico” di

romosomi materni e paterni.

Nella F2 cerchiamo i marcatori che co-segregano con il carattere altezza delle piante. Sono dunque marcatori

he hanno una certa variante allelica quando le piante sono alte e l’altra variante allelica quando le piante

ono basse. 40


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kristo89

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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in scienze e tecnologie agrarie
SSD:
Università: Padova - Unipd
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher kristo89 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Miglioramento genetico e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Padova - Unipd o del prof Lucchin Margherita.

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