Riassunto esame Miglioramento Genetico, prof. Lucchin

MARCATORI DEL DNA

trumenti permettono di analizzare la variabilità genetica a livello della sequenza del DNA.

un segmento di DNA, un tratto di cromosoma, fenotipicamente rilevabile e che permette di individuare un

ratto cromosomico ben definito.

quindi un locus genomico rilevabile con:

sonda specifica

un tratto di DNA a filamento singolo ibridato, va a cercare la sequenza complementare per formare il ponte

drogeno. Quindi attraverso la sonda si può individuare dove sta la sequenza complementare.

primer - innesco specifico

=corto oligonucleotide (10-30) a singolo filamento con un ossidrile libero che attaccandosi al filamento

stampo del DNA denaturato funge da innesco per la reazione di polimerizzazione di un nuovo filament

per opera della DNA polimerasi.

Quando nella provetta inserisco il pezzetto di DNA che funge da innesco, questo va a cercare la sequenza

omplementare alla quale si attacca e parte da DNA polimerasi. Quindi la sequenza dell’innesco permette d

dentificare con sicurezza il locus genomico che vado a replicare.

MARCATORE MOLECOLARE  frammento di DNA di dimensione variabile e riconducibile ad un locus genomico

ilevabile con sonde (probe) o inneschi (primer) che contraddistingue in modo caratteristico e inequivocabil

tratto cromosomico con il quale si identifica (a quel punto, possono fare il confronto tra individu

opolazioni, specie, confrontando quel tratto cromosomico) e le regioni che lo circondando alle estremità 5’ e

’.

er il tratto cromosomico, in realtà è la stessa cosa che faceva Mendel quando confrontava le piante di pisello

er il colore del fiore. Confrontava un tratto cromosomico, ossia il tratto cromosomico che codifica per

olore del fiore, andando a vedere il fenotipo morfologico. Noi facciamo gli stessi confronti andando però

edere il fenotipo molecolare e le regioni che lo circondando alle estremità 5’ e 3’.

Ciò significa che il locus genomico che si analizza è delimitato dalle regioni che hanno sequenza nota, ossia

uella degli inneschi che abbiamo immesso e che fiancheggia il tratto di DNA.

Mendel  carattere utile ed ereditabile SE esiste almeno in due forme (fenotipi)

Marcatori  fenotipo riconducibile ad un una forma alternativa di un gene specifica(allele) o parte del tratto

romosomico

Caratteri morfologici  un singolo fenotipo può dipendere da più geni.  MARCATORE MORFOLOGICO

Gene è polimorfico  se presenta almeno due alleli diversi  mutazioni

Gene è monomorfico  Ex. (tutti semi gialli) non è un carattere utilizzabile come marcatore perché g

ndividui per quel tratto di cromosoma sono tutti uguali.

Le due sequenze che fiancheggiano il cromosoma s

conoscono sempre perché sono quelle del primer. L

sequenza del frammento possiamo conoscerla o meno i

funzione della tecnica che usiamo.

I marcatori morfologici hanno dei limiti :

- è difficile in una specie trovare caratteri morfologici che s

presentano in forma alternativa chiaramente distinguibili;

- epistasi, penetranza incompleta. L’epistasi è un tip

’interazione intergenica per cui la situazione ad un locus condiziona la manifestazione di un altro (es: colore

ella zucca). Penetranza incompleta significa che tutti gli individui che portano un certo genotipo

manifestano quel carattere. Se un gene ha penetranza incompleta, l’analisi fenotipica è labile.

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è difficile risalire dal fenotipo al genotipo. È possibile solo per quei caratteri che vengono definiti mendelian

emplici, caratteri controllati da un solo gene. Per altezza, epoca di fioritura, contenuto oleico, produzione d

ranella, il passaggio da fenotipo a genotipo è impossibile perché i caratteri sono controllati da molti geni.

sono influenzati dall’ambiente. Due piante di genotipo identico coltivate in ambienti diversi, sono diverse tra

i loro.

Aspetti positivi dei marcatori molecolari:

Analisi fatta a livello di DNA  non vi sono interazioni dal parte dell’ambiente. Non vi sono differenza a livell

i fenotipo molecolare in funzione delle diverse condizioni (età, ambiente,…)

Si può analizzare qualsiasi parte del genoma permettendo confronti tra individui sia tratti di DNA che

ontrollano caratteri fenotipici più o meno importanti o regioni intergeniche non trascritte rilevando differenze

ra individui che sono geneticamente molto simili e fenotipicamente identici (es: si possono rilevare differenze

livello di regioni non trascritte, che non danno origine a proteine, ma che magari hanno funzione d

egolazione dell’espressione);

Si può distinguere la condizione eterozigote da quella omozigote in funzione della tecnica usata.

Uso dei marcatori molecolari

Analizziamo se nel tratto di cromosoma gli individui sono tutti uguali tra di loro (monomorfici) e in questo

aso non avremo nessuna informazione utile o se ci sono delle differenze (polimorfismi). I polimorfismi non

ono altro che la conseguenza di mutazioni. NB: gli allei diversi di Mendel, sono conseguenze di mutazioni da

n iniziale carattere unico. Quindi si analizzano polimorfismi in regioni omologhe del DNA ossia nello stess

ratto cromosomico d’individui diversi.

Non è detto che i marcatori molecolari siano riconducibili all’azione di un gene. Possiamo analizzare, infatti

n tratto cromosomico in regioni non codificanti (NB: nel genoma umano solo il 3% e codificante).

Quindi ci si basa, non su specifici geni, ma sulla rilevazione di differenze a livello di regioni della molecola d

DNA e la certezza di confrontare la stessa regione negli individui è data dal primer.

marcatori studiati si basano su una tecnica di base = Reazione a Catena della Polimerasi (PCR)

marcatori PCR - derivati.

PCR

a reazione a catena della polimerasi, utilizza l’enzima DNA polimerasi per replicare molte volte (amplificare

na delimitata regione del DNA, un determinato frammento del DNA, ossia quello delimitato dai primer.

Una volta partita la DNA-polimerasi che duplica quel frammento selezionato, questo a sua volta funge da

tampo per la sintesi di un nuovo frammento. Quindi ad ogni ciclo di replicazione raddoppia il numero di copie

el frammento (amplificazione esponenziale).

Affinché la DNA-polimerasi sia in grado di replicare il frammento, è necessario che il DNA si denaturi. Quest

i ottiene portando la provetta ad una certa temperatura piuttosto elevata che consenta la rottura dei legam

drogeno. Così facendo però denaturo anche la DNA-polimerasi stessa.

a scoperta che ha segnato una svolta è stata la Taq DNA polimerasi. È la polimerasi di un batterio (Thermu

cquasticus) che vive nelle acque termali a 72°C e in grado quindi di tollerare temperature elevate (fino 95°).

quindi necessaria questa DNA-polimerasi e che i primer selezionino il frammento. Questi primer saranno

ovviamente a singolo filamento (singola elica) perché solo in questo mod

si attaccheranno alla sequenza complementare permettendo alla Taq d

partire.

Come funziona la reazione a catena della polimerasi?

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Vengono messi all’interno della provetta: DNA dell’individuo da analizzare, Taq-polimerasi, primer, nucleotidi

si fa partire la reazione.

tutto avviene con una serie di cicli di cambio di temperatura mediante il termociclatore.

A) Avvenuta la denaturazione (94-95°C), appena le condizioni di temperatura della reazione lo permettono, s

ormano i ponti idrogeno (37°-55/60°C – in funzione di quanto lungo è il primer, delle basi azotate) e i primer

anno ad ibridare (attaccarsi) dove trovano la sequenza complementare.

A questo punto, con il primer che ha il carbonio 3’ con l’OH libero, può partire la DNA-polimerasi

nalogamente in entrambi i frammenti che si allungano uno verso l’altro (direzione 5’-3’). Vengono così

intetizzati i nuovi frammenti delimitati inizialmente dai primer.

B) Avviene nuovamente un ciclo e i nuovi frammenti avranno come stampi i due frammenti originali e i due

rammenti sintetizzati dagli originali dalla prima DNA-polimerasi (in tutto 4 molecole di DNA). Ad ogni ciclo si

addoppia la quantità di copie del frammento.

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a PCR dura di norma 25-30 cicli e avremmo 2 copie del frammento.

Fasi della PCR

) Denaturazione del DNA

Rottura dei ponti idrogeno tra i due frammenti complementari (94-95%);

) Annealing

bridazione dei primer con la sequenza complementare riformando i ponti idrogeni ad una temperatura che

uò andare dai 37 ai 60°C;

) Allungamento

Avviene a 72°C in funzione dell’enzima del Thermus aquaticus.

termociclatore opera questi cicli termici in maniera molto precisa poiché sbagliare anche di mezzo grado

uò compromettere l’efficienza della reazione (es: ibridazione anche con base errata).

ciclo dura di norma 2min:

30 sec. Denaturazione;

30 sec. Annealing;

1 min. Allungamento.

a variazione di temperatura deve essere pressoché immediata.

imiti della DNA-polimerasi:

necessità frammento stampo;

necessità innesco;

non riesce a replicare frammenti troppo lunghi.

a capacità di polimerizzazione è di circa 2000 paia di basi. Quindi può avvenire se i due primer trovano

innesco ad una distanza compatibile con la capacità di polimerizzazione. Se sono troppo distanti non vi

arebbe amplificazione.

Tipi di primer

Primers casuali

Utilizzo per fare analisi di variabilità genetica in una popolazione oppure per sapere se due individui sono lo

tesso clone o cloni diversi. In tal caso non interessa quale frammento amplifico. Mi basta che siano gli stessi

egli individui che vado a confrontare. Conosciamo la sequenza dei primer ma non dove andranno ad

mplificare.

- RADP (Rapid) - AFLP. 34

Primers specifici per un determinato sito

i utilizzo per amplificare frammenti specifici (primer di 25-25 nucleotidi).

- SSR, marcatori microsatelliti;

- SNP, marcatori che analizzano mutazioni di singoli nucleotidi.

Distiguiamo inoltre:

marcatori multilocus (primers a sequenza casuale)

ermettono di analizzare più loci alla volta (anche 100) che derivano dall’amplificazione di tratti cromosomic

on primer a sequenza casuale. Proprio perché sono più brevi, è verosimile che trovino più siti d’ibridazion

ma il loro numero non lo conosciamo a propri. Quindi saranno amplificati più frammenti. In questo modo però

urante la separazione dei frammenti mediante elettroforesi, non siamo in grado di distinguere quali son

llelici tra di loro e quali sono su loci diversi.

er questo li consideriamo dominanti: andremo a rilevare polimorfismi solo mediante la presenza o assenz

el frammento, ma non siamo in grado dire se deriva da una situazione di omozigosi o eterozigosi (la PCR non

quantitativa, non ci dice se l’amplificazione è partita da una sola molecola inziale o da due cromosom

mologhi). Es: marcat