Microbiologia farmaceutica

Microbiologia

Professoressa: Francesca Lembo

Classificazione degli organismi

I batteri

I batteri sono microrganismi unicellulari che presentano una parete cellulare rigida e si dividono per scissione binaria. I batteri in natura sono molteplici e solo l’1% di essi è patogeno per l’uomo, portando malattie, mentre il restante 99% è utile a diversi meccanismi: aiutano nella fotosintesi per le piante, riciclano la biomassa portando un equilibrio nell’ecosistema o ancora si trovano sia sulla superficie cutanea dell’uomo o in diversi distretti anatomici di esso costituendo delle colonie batteriche, che interagiscono tra loro, dette ‘microbiota’, costituendo una risorsa fondamentale quando insorgono patologie. Sono dotati di un proprio apparato metabolico ed enzimatico riuscendo a sopravvivere da soli.

Archeobatteri

Sono organismi meno complessi dei batteri perché non possiedono né nucleo né clorofilla ma sono dotati sia di una parete rigida esterna che di una membrana cellulare. Non sono causa di patologie, ma anzi sono benefici all’ambiente e all’ecosistema soprattutto per il loro carattere ‘estremofilo’, cioè la capacità che possiedono di vivere in condizioni estreme di pH, salinità, temperature ecc. Alcuni membri hanno capacità fotosintetiche nonostante siano privi di clorofilla.

Protozoi

Sono organismi pluricellulari che non possiedono una parete cellulare ma sono utili al mantenimento dell’ecosistema anche se sono causa di alcune patologie nell’uomo. Molti vivono per ingestione in altri microbi o particelle della biomassa. Non hanno ruoli fotosintetici.

Funghi

Sono organismi sia unicellulari (lieviti) sia pluricellulari (muffe). Possiedono una parete cellulare rigida. Si dividono per gemmazione. Riciclano la biomassa e sono molto utili nella crescita delle piante. Possono causare patologie, specialmente nei soggetti immunocompromessi anche a causa della liberazione di sostanze tossiche.

Alghe

Sono organismi sia unicellulari che pluricellulari, dotati di parete rigida e forniscono il 70% dell’ossigeno presente nel nostro pianeta grazie alla loro azione fotosintetica. Non causano patologie nell’uomo.

Specie che causano processi infettivi

• Elminti: Parassiti infettivi abbastanza grandi.
• Prioni: Sono estremamente piccoli e non possono definirsi degli organismi perché sono fondamentalmente proteine modificate parassitanti e, quindi, non viventi.
• Virus: Anch'essi non sono organismi, visibili solo al microscopio ottico, ma parassiti intracellulari obbligati, cioè filamenti di acidi nucleici che parassitano delle cellule viventi utilizzando il loro apparato metabolico per riprodursi portando la cellula ad assumere un carattere patogeno e poi andare in lisi. Se non sfruttano il metabolismo di un altro organismo, infatti, muoiono.

Tassonomia

La tassonomia, cioè la scienza che si occupa di classificare le specie esistenti, fu analizzata già da Aristotele nel 348 a.C. per cercare di trovare una serie di fattori comuni che potessero mettere in relazione le varie specie esistenti e classificarle in base agli aspetti comuni e non. Dopo essere stato lo studio di altri scienziati come Linneo, Haeckel e Whittaker che diedero comunque il loro contributo al fine di delineare sempre più quest’albero genealogico, il metodo di classificazione attualmente utilizzato fu proposto da Carl Woese nel 1990. Questo propone l’esistenza di 3 domini: batteri, procarioti ed eucarioti che sono tutti accomunati da un fattore fondamentale: la possibilità di sintetizzare proteine utili alla sopravvivenza del microrganismo e alla sua riproduzione. Infatti, nelle cellule di questi organismi è possibile trovare il ribosoma, un organello utile alla sintesi proteica, formato da rRNA e proteine.

Nell’albero filogenetico è possibile vedere varie ramificazioni che partono da ogni singolo dominio che stanno ad indicare le differenziazioni nate successivamente grazie a processi di evoluzione. Tanto più è lunga la ramificazione e tanto più saranno distinti le caratteristiche comunitarie tra i gruppi.

La classificazione dei vari sottogruppi dei domini segue la scala:

1. Dominio
2. Regno (sottoregno, superphylum)
3. Phylum (sottophylum, infraphylum, superclasse)
4. Classe (sottoclasse, infraclasse, superdine)
5. Ordine (sottordine, infraordine, parvordine, superfamiglia)
6. Famiglia (sottofamiglia, tribù, sottotribù, infratribù)
7. Genere (sottogenere)
8. Specie (sottospecie, forma o varietà, clade o coorte)

La cellula batterica

Come sappiamo, i batteri sono organismi unicellulari capaci di autoreplicarsi e, nonostante siano degli organismi primitivi rispetto all’uomo, la loro cellula dispone di tutte le funzioni necessarie per consentire il proseguimento della specie, l’adattabilità dell’organismo ai vari ambienti esterni e le funzioni vitali necessarie al fine di far sopravvivere la cellula.

I batteri, a prima vista, possono già essere classificati per dimensioni e forma prima che di struttura. La loro dimensione non supera l’1µn. I batteri che rivestono la superficie dell’apparato polmonare, oculare ed urinario arrivano ad un massimo di 0,2µn di diametro. In più, per quanto riguarda la forma, si possono classificare in:

• Bacilli: hanno forma cilindrica con i poli di diversa forma che ci permettono di collocare questi batteri nelle varie specie.
• Cocchi: hanno forma sferica.
• Coccobacilli: hanno una forma variabile che può andare dalla sferica all’allungata ed affusolata.
• Vibrioni: sono bastoncelli ricurvi simili ad una virgola.
• Spirilli: sono ricurvi su più piani, a formare una spirale.

DNA batterico

Per quanto riguarda il materiale genetico, questo non è racchiuso in una membrana nucleare come accade per le cellule eucariotiche ma si trova nel citoplasma in una zona detta ‘nucleoide’, una zona elettrodensa posta genericamente al centro. Tale materiale è costituito da un solo cromosoma chiuso ad anello grazie a proteine dette ‘simil-isotoniche’ che, avendo una carica positiva, interagiscono con le basi nucleotidiche negative del DNA, consentendo di creare anse in cui il DNA è meno compatto ed è possibile la trascrizione. In più è ancorato alla membrana cellulare grazie ai ‘mesosomi’ che aiutano a ripartire il materiale genetico durante la duplicazione. Oltre al nucleoide, una zona batterica dove è depositato parte del DNA sono i ‘plasmidi’, cioè frammenti di DNA che consentono al batterio di disporre di funzioni secondarie: un’ulteriore sequenza genetica e un carattere di maggiore resistenza all’ambiente circostante o a farmaci. Infatti, sono fondamentali nei processi di mutazione grazie alla capacità di alcuni di penetrare nelle cellule batteriche circostanti.

Citoplasma batterico

Nel citoplasma batterico non troviamo una compartimentalizzazione data dai vari organelli che svolgono le varie funzioni perché il batterio è costretto a vivere in condizioni più avverse rispetto alle cellule eucariotiche e deve necessariamente rispondere in maniera repentina nel caso di attacchi o cambiamenti esterni. Quindi occuparsi della disposizione e della funzione dei vari compartimenti causerebbe al batterio una perdita di tempo ed energie. Ciò che quindi troviamo unicamente nel citoplasma sono:

• Ribosomi: utili alla sintesi proteica e che tendono ad addossarsi alla membrana citoplasmatica a causa dell’assenza del reticolo endoplasmatico.
• Enzimi: utili alla sintesi di sostanze necessarie alla sopravvivenza e duplicazione del batterio.
• Materiali meno abbondanti e facoltativi come glicogeno (riserva), polisaccaridi e vari granuli.
• Plasmidi: frammenti di DNA extra cromosomico libero nel citoplasma.

Le sue principali funzioni sono quelle di difendere il batterio dagli attacchi esterni, di consentire l’accesso ai nutrienti grazie a proteine veicolari, di escrezione e trasporto di elettroni, e di conservazione di energia grazie agli enzimi posti su di essa utili alla respirazione cellulare.

Membrana citoplasmatica

Come sappiamo, la membrana è formata da un doppio strato fosfolipidico caratterizzato da teste polari che sono a contatto con i liquidi intra ed extra cellulari e delle code apolari a contatto tra loro nello spazio intermedio della membrana. Questa è anche detta ‘modello a mosaico fluido’ perché è caratterizzata da una fluidità data dagli stessi lipidi e da una leggera rigidità, anche se in questo tipo di membrana sono assenti steroli.

Parete cellulare o cell wall

È una struttura fondamentale che deriva da PBP, cioè ‘proteine leganti della penicillina’ che ne producono il principale costituente: il peptidoglicano. Un batterio può non essere dotato di parete, come accade per i ‘protoplasti’ che per questo hanno scarse capacità di sopravvivenza, o ‘sferoplasti’ con solo pochi frammenti di esso. Le principali funzioni di questo strato che va a ricoprire la membrana plasmatica sono:

• Protezione meccanica
• Protezione chimica
• Protezione osmotica
• Trasporto
• Funzione immunitaria
• Funzione virulenta
• Funzione di ancoraggio
• Funzioni metaboliche

La parete cellulare ci consente di distinguere due classi di batteri: i Gram-positivi ed i Gram-negativi. I primi hanno uno strato più doppio di peptidoglicano, i secondi uno strato più sottile. Questa differenza li consente di interagire anche diversamente con la cellula ospite e di assumere colorazioni diverse quando ne sono sottoposte al fine di catalogarle. Il peptidoglicano è composto dall’alternanza da due amminozuccheri: N-acetil-muramico (NAM) e l’N-acetil-glucosammina (NAG) legati tra loro da un legame β-1,4-glicosico. Il legame di queste due catene è di tipo crociato creando delle maglie, al fine di dare resistenza e solidità all’intera cellula.

Il gruppo carbossilico sul NAM è legato a 5 amminoacidi diversi:

1. L-alanina
2. Acido D-glutammico
3. L-lisina (o DAP)
4. D-alanina
5. D-alanina

Questi fasci di peptidoglicano sono legati a loro volta ad altre molecole che, a seconda se siano G+ o G-, formano strutture diverse facendoci anche capire quale batterio stiamo analizzando. Per i G+, questo lega D-alanina ed L-lisina. Per i G- entra in gioco l’acido meso-diaminopimelico (DAP) che si lega alla D-alanina. Gli enzimi utili alla formazione del legame, che avviene a livello della membrana grazie le PBP, sono detti ‘transpeptidasi’ e provvedono all’allungamento della catena composta da amminozuccheri. Nei G- il legame avviene tra DAP di un peptide e la D-alanina di un altro adiacente. Nel caso dei G+ questo avviene tra la L-lisina e la D-alanina con ponti pentaglicinici.

Gli acidi teicoici sono spesso legati al peptidoglicano e sono polimeri di alcoli polivalenti esterificati con acido fosforico, monosaccaridi e amminoacidi. Si pensa provvedano alla sopravvivenza del batterio riuscendo ad incrementare la sua adesività ed il rilascio di citochine e monochine.

Cosa differenzia inoltre i Gram-positivi dai Gram-negativi?

• Gram-positivi: hanno la parete cellulare ricca di lipoteicoci (LTA) che consentono alla cellula di aderire sulle superfici e, quando questo tipo di batteri infettano l’organismo, queste molecole producono l’infiammazione grazie alla secrezione di citochine.
• Gram-negativi: oltre alla parete cellulare, un ulteriore doppio strato fosfolipidico riveste la cellula esternamente: l’LPS, con funzione di ancoraggio e passaggio di sostanze attraverso le ‘porine’, cioè proteine trans membranali utili al passaggio di composti molecolari. È definita come una endotossina rilasciata nel momento in cui il batterio va in contro a lisi causando anch’essa l’infiammazione. È costituito da tre componenti: l’antigene O (che si trova più esternamente), il core (che si trova al centro) ed il lipide A (e si trova più internamente).

Antigene O: catena centrale costituita da una ripetizione di 20-50 unità di zuccheri diversi quali glucosio, galattosio e mannosio.

Core: è una struttura di tipo polisaccaridico composta da 9 a 12 unità di zuccheri.

Lipide A: è formata dall’esterificazione della glucosammina con acidi grassi saturi. È causa della tossicità del lipopolisaccaride.

Come nasce? Nasce dal trasporto del pactoprenolo, uno zucchero, di NAM e NAG dalla cellula madre che, attraverso una lisi controllata, trasporta questa struttura alle cellule figlie. Enzimi specifici (trans-glicosidasi e trans-peptidasi) creano i legami glicosidici e aiutano a comporre tale struttura. Queste due diverse strutture ci consentono di distinguere le due classi di batteri anche attraverso una colorazione, che sarà diversa proprio grazie alle diverse pareti cellulari. Questa è conosciuta come colorazione di Gram, in onore allo scienziato che la sperimentò.

Questo processo prevede l’utilizzo di due coloranti di contrasto:

1. Somministrazione del colore ‘cristal violetto’ che colora le cellule di viola.
2. Viene utilizzato un mordenzante per far assorbire meglio il colore.
3. Viene decolorata la cellula attraverso alcol o acetone e viene aggiunto il secondo colorante rosso safranina.

Per i batteri Gram positivi, grazie alla spessa parete cellulare, il primo colore non riuscirà ad essere decolorato e la cellula non assumerà la seconda colorazione mentre, per i Gram negativi, la decolorazione sarà efficace ed il rosso può facilmente andare a colorare la cellula di tale tonalità.

Strutture secondarie

Sono tutte quelle strutture facoltative che non fanno parte di tutti i batteri ma che ne aumentano la patogenicità e l’adattabilità all’ambiente circostante con un maggiore capacità riproduttiva.

• Mesosomi: invaginazioni di membrana per i Gram positivi aumentando le attività metaboliche legate ad essa e portando una maggiore energia al nucleoide. Ha una forma vescicolare e sono sezioni meno ricche di enzimi, proteine e fosfolipidi. Intervengono durante la replicazione del DNA, lo trasportano ai due poli della cellula nella fase immediatamente precedente alla formazione delle due cellule figlie ed intervengono nella formazione delle spore.
• Flagelli: è una struttura formata dalla ripetizione di monomeri di flagellina che si estroflette dalla cellula consentendole di stabilizzarsi in vari ambienti. La propulsione data da questo filamento consente al batterio di muoversi verso i nutrienti ed allontanarsi da sostanze tossiche. Quest'ultimo è definito ‘movimento chemiotattico’. Hanno forme diverse e possono essere: monotriche (con un solo flagello posizionato su un polo), peritriche (flagelli tutt’intorno la cellula), lofotriche (ciuffo di flagelli che si muovono in maniera sincrona. Anch’essi localizzati su un polo). La rotazione del flagello è alterata in base alla direzione. Ciò che stimola il movimento flagellare è un segnale esterno che viene trasdotto all’interno grazie a specifiche proteine sensore poste all’esterno che attraverso un cambio conformazionale contattano le quelle intra-citoplasmatiche con l’idrolisi di ATP. Il tutto porta l’attivazione del motore flagellare al fine di far spostare la cellula da un ambiente pericoloso per essa.
• Muco: questo è un ulteriore metodo che utilizzano le cellule per muoversi in caso siano sprovviste di flagello, perché consente lo scivolamento della cellula sulla mucina secreta.
• Fimbrie e pili: sono strutture di adesione che consentono alla cellula di aderire in maniera più efficace ad una superficie, colonizzandola. Grazie alle proteine posizionale sull’estremità del pilo, che sono l’adesina e la pilina, il batterio riesce ad interagire a livello molecolare con i recettori specifici presenti sulla cellula ospite.
• Capsula batterica: i batteri con questa struttura sono più patogeni rispetto a quelli che ne sono sprovvisti in quanto è costituita da polisaccaridi con 10 amminoacidi che ne aumentano l’adesività, riescono ad assumere grandi quantità di antibiotico e rende i batteri invisibili ai fagociti umani.

Crescita batterica

Ora che abbiamo capito che struttura hanno i batteri è necessario analizzare anche il loro comportamento una volta che hanno colonizzato un distretto, e quindi come crescono. Il grafico successivamente riportato raffigura rappresenta la curva di crescita batterica se questi microrganismi vengono posti su un terreno di coltura che consente loro di disporre dei nutrienti necessari e con condizioni climatiche ottimali per la loro riproduzione.

Come è possibile vedere dall’immagine, gli assi cartesiani implicano una crescita in funzione del numero di cellule che si formano e del tempo in cui questo avviene. Generalmente si utilizza il log in base 10 per la concentrazione batterica. Osservandolo, quindi, possiamo individuare diverse fasi:

• Fase di latenza: la concentrazione batterica è estremamente bassa ed aumenta in funzione del tempo in minima misura. Infatti, in questa fase, c’è un adattamento fisiologico all’ambiente circostante.
• Fase esponenziale: le cellule iniziano a riprodursi portando, attraverso la scissione binaria, ad un aumento esponenziale di microrganismi in un piccolo intervallo di tempo, che terminerà nel momento in cui si saranno accumulati elementi tossici del metabolismo e l’esaurimento dei nutrienti.
• Fase stazionaria: il numero totale di cellule presenti è fisso, stazionario poiché le cellule che si riproducono sono quantitativamente uguali a quelle che muoiono.