Microbiologia - risposte per esame scritto

Domande a risposta estesa: gruppo 11

La microbiologia come disciplina scientifica

Descrivere l'evoluzione delle conoscenze della microbiologia a partire dalla costruzione dei primi microscopi; la disputa sulla generazione spontanea; il contributo di Koch e Pasteur e la scoperta della biodiversità microbica.

La microbiologia è una disciplina giovane, infatti solo dalla seconda metà del XIX secolo fu possibile iniziare a studiare microrganismi in laboratorio. La prima rivoluzione tecnologica è stata sicuramente l'avvento del microscopio nel XVII secolo, Robert Hooke nel 1665 pubblicò l'esatta descrizione di un microscopio con una sola lente e disegni di corpi fruttiferi di funghi. Si attribuisce tuttavia l'inizio della microbiologia come disciplina a un commerciante di stoffe in Olanda, Antonj van Leewenhoek, che fu il primo a descrivere batteri, lieviti e protozoi. Si era infatti appassionato alla costruzione di microscopi che potevano raggiungere ingrandimenti di circa 50-300 volte. Nel 1676 descrisse e disegnò le cellule di alcuni 'animalcules' (batteri e lieviti) in acqua. Dopo queste iniziali scoperte, lo studio del mondo microbico si è arrestato per circa cento anni.

L'idea della generazione spontanea di organismi viventi è antica; dal cibo in putrefazione "nascono" le larve di vari insetti, dalle acque stagnanti insetti o girini, e perfino topolini delle derrate alimentari. La vita di questi organismi si pensava potesse essere spontanea e generata dalla sostanza inanimata. Il dibattito scientifico e filosofico sulla generazione spontanea è durato fino alla fine del XIX secolo, quando venne confutata, dopo i tentativi di Redi e Spallanzani, dal chimico francese Pasteur, che fornì una spiegazione definitiva modificando l'esperimento di Spallanzani.

Pasteur raggiunse molti altri successi in microbiologia e medicina, quali lo sviluppo dei vaccini per l'antrace, il colera aviario e la rabbia. I successi di Pasteur in ambito medico e veterinario contribuirono all'affermazione del concetto di teoria microbica delle malattie, sviluppata da Robert Koch. I primi esperimenti di Koch riguardavano l'antrace, una malattia del bestiame che poteva occasionalmente trasmettersi all'uomo; isolò per la prima volta un microrganismo causa di malattia e dimostrò che Bacillus anthracis è l'agente eziologico del carbonchio (antrace). Robert Koch sviluppò un metodo per coltivare i microrganismi su terreno solido attraverso l'uso di gelatina o di fette di patate sulla cui superficie potevano crescere microrganismi formando delle specie di colonie, questo permise di separare colonie microbiche diverse tra loro per poterle studiare meglio. Isolò Mycobacterium tuberculosis e il vibrione del colera (Vibrio cholerae). Sviluppò i criteri generali/sperimentali per definire se un determinato agente biologico è causa di una malattia – i postulati di Koch.

Sergej Vinogradskij e Beijerinck furono tra i primi grandi microbiologi a studiare i microrganismi dell'ambiente e fare ricerche sulla biodiversità microbica di suolo e acque. Beijerinck sviluppò la tecnica delle colture di arricchimento; la colonna di Vinogradskij è un esperimento che ha permesso di studiare in maniera approfondita i processi di autotrofia e coniò anche il termine di chemiolitotrofia, ad indicare gli organismi in grado di fissare l'anidride carbonica. La scoperta della grande variabilità microbica portò alla necessità di definire metodi di classificazione dei microrganismi.

L'evoluzione della vita

La comparsa della vita sulla Terra; i processi evolutivi dei microrganismi e la sistematica molecolare.

La Terra ha 4,6 miliardi di anni e le evidenze dimostrano che le prime cellule microbiche sono comparse fra i 3,8 e i 3,9 miliardi di anni fa. Nei primi 2 miliardi di anni la Terra ha avuto un'atmosfera anossica (priva di O₂); erano presenti solo azoto (N₂), diossido di carbonio (CO₂), e pochi altri gas. Queste condizioni erano favorevoli solamente allo sviluppo di cellule capaci di un metabolismo anaerobico. L'evoluzione degli organismi fototrofi, in grado di ottenere energia dalla luce solare, ha impiegato un miliardo di anni dalla nascita della terra. I primi fototrofi erano organismi relativamente semplici. I fototrofi aerobi, cianobatteri, si sono evoluti circa un miliardo e mezzo dopo rispetto ai fototrofi anaerobi e hanno cominciato il lento processo di immissione di ossigeno nell'atmosfera terrestre.

Stimolata dall'aumento di ossigeno nell'atmosfera, la vita multicellulare ha cominciato a evolversi e a farsi sempre più complessa, fino ad arrivare alle piante e agli animali che conosciamo oggi, che però esistono solo da circa mezzo miliardo di anni. La linea temporale della vita sulla Terra mostra come l'80% della storia della vita è stata esclusivamente microbica, e quindi, per molti versi, la Terra può essere considerata un pianeta microbico.

Nel corso dell'evoluzione si evidenziarono tre principali linee di cellule microbiche (domini): Bacteria, Archea ed Eukarya. Per accertare la storia filogenetica del mondo microbico e svelarne la sua reale diversità si è dovuto attendere finché si sono resi disponibili gli strumenti adatti per questo compito. A differenza di animali e piante per i quali ossa, foglie e fossili possono essere utilizzati per contribuire a ricostruirne la filogenesi, per orientare la costruzione di un albero evolutivo microbico questi non erano disponibili. Le scoperte degli ultimi 40-50 anni, in primis nel 1970 Carl Woese, hanno dimostrato che ogni cellula contiene nei suoi geni una documentazione della sua storia evolutiva, in particolare i geni che codificano gli RNA ribosomiali sono emersi come ottimi indicatori della diversità microbica. Appena è stato tracciato l'albero filogenetico basato sull'rRNA, esso ha dimostrato l'esistenza di migliaia di specie di Bacteria e Archea, nonché di centinaia di specie di Eukarya microbici; ha anche rivelato due fatti importanti: (1) Bacteria e Archea sono filogeneticamente distinti pur condividendo molte caratteristiche strutturali; (2) gli Archea sono più strettamente correlati agli Eukarya rispetto che ai Bacteria.

La sistematica collega la filogenesi alla tassonomia, la scienza in cui gli organismi sono caratterizzati, nominati e classificati secondo diversi criteri definiti. La tassonomia batterica utilizza un approccio polifasico con tre tipi di metodi per l'identificazione e la descrizione dei batteri: fenotipici, genotipici e filogenetici. Per la tassonomia batterica sono utilizzate varie tecniche: Sequenziamento genomico (famiglia, genere, specie, subspecie e ceppo); 16S rRNA (solo per la risoluzione di famiglia e genere); Multilocus sequence typing (specie, subspecie e ceppo); SNP analysis (specie, subspecie e ceppo) o Genomic fingerprinting (specie, subspecie e ceppo). In particolare, il gene 16S è fondamentale perché non è soggetto a mutazioni ed evolve lentamente, quindi risulta molto utile per capire la filogenesi. Se in due microrganismi le regioni conservate di geni sono molto simili fra loro vuol dire che sono vicini evolutivamente. Se due organismi hanno un elevato numero di differenze nucleotidiche vuol dire che sono lontani evolutivamente. In alcuni casi se la similitudine del gene 16S è maggiore del 97% anche la similitudine dell'identità genomica è maggiore del 70%. In altri casi, invece, anche se il gene 16S è uguale fra i due microrganismi, l'identità genomica è molto diversa. Il motivo principale è il trasferimento genetico orizzontale, ossia i rami degli alberi genetici si mischiano fra loro e quindi i batteri hanno genomi differenti.

La cellula dai procarioti

La struttura cellulare dei batteri monodermi e didermi. Descrivere la struttura e le funzioni di membrana plasmatica, parete ed eventuale membrana esterna in Batteri e Archea.

La struttura della cellula procariote ha due caratteristiche principali che la distinguono da quella eucariote: l'assenza di nucleo e la presenza di parete cellulare. La cellula procariote è più piccola di quella eucariote, in genere va da 0,2 a 2 micron. Le dimensioni ridotte offrono un vantaggio alle cellule che hanno così un maggior rapporto superficie/volume: questo porta una maggior efficienza per gli scambi molecolari tra cellula e ambiente, ad esempio per il trasporto di nutrienti e per la crescita.

Esistono varie morfologie di una cellula procariote come ad esempio cocco, bastoncello, bacillo o spirillo. È una caratteristica non casuale poiché ha un impatto sullo stile di vita e deriva da una struttura rigida, la parete cellulare, ed enzimi che nella costruzione della parete ne danno la forma. La colorazione di Gram ha permesso di differenziare due grossi gruppi di microrganismi: i gram negativi (didermi) e i gram positivi (monodermi). I didermi hanno due membrane, una citoplasmatica e un'altra membrana esterna costituite da foglietti fosfolipidici. La parte tra queste due membrane viene chiamata periplasma e può in alcune circostanze costituire buona parte della cellula. Ha una funzione importante essendo sede di numerose proteine e contiene uno strato sottile di peptidoglicano. Presenta una membrana esterna che funge da: barriera di permeabilità in grado di impedire l'ingresso dei sali biliari (composti tossici) e altri composti tossici, e fattore di virulenza in grado di evadere le difese aspecifiche dell'ospite come la fagocitosi.

I monodermi rispondono in maniera positiva alla colorazione di Gram. Sono costituiti da una membrana sola e lo strato di peptidoglicano è più spesso. La membrana plasmatica delimita il contenuto cellulare in uno spazio definito e separa la cellula dall'esterno. Ha diverse funzioni quali contenere macromolecole/strutture citoplasmatiche (DNA, RNA, ribosomi…), mantenere l'omeostasi: acquisire nutrienti, eliminare sostanze di rifiuto o secernere molecole specifiche, è sede di importanti processi metabolici (negli eucarioti sono deputati specifici organelli all'interno della cellula) quali respirazione, fotosintesi, biosintesi di lipidi, inoltre ha la funzione di recepire e rispondere adeguatamente ai diversi stimoli ambientali.

La membrana plasmatica di batteri ed eucarioti ha la stessa composizione: fosfolipidi con D-glicerolo 3-fosfato esterificato in C1 e C2 con due molecole di acidi grassi non ramificati e saturi. Vi è una differenza tra eucarioti e batteri nella presenza di molecole che si intercalano nella parte idrofobica del foglietto fosfolipidico: gli steroli (colesterolo) sono presenti nelle membrane degli eucarioti; mentre gli opanoidi sono presenti nelle membrane dei batteri. Analoga struttura degli steroli ad eccezione del fatto che sono costituiti da cinque anelli (e non quattro) e hanno la stessa funzione cioè stabilizzare la struttura del doppio foglietto fosfolipidico.

Il foglietto fosfolipidico degli Archea si differenzia in modo sostanziale da quello dei batteri ed eucarioti:

• La chiralità del glicerolo, gli acidi grassi sono legati in posizione 2 e 3 quindi donano una chiralità di tipo L al glicerolo
• Il legame tra catene alifatiche e glicerolo, il legame etere è caratteristico nei lipidi degli Archea, quello estere nei lipidi dei Batteri
• La struttura delle catene alifatiche sono catene isoprenoidi, quindi ramificate.

I lipidi degli archea possono essere dieteri di glicerolo o tetraeteri di glicerolo; possono contenere anelli ciclopentoici. La struttura lipidica determina la viscosità alle differenti temperature.

La parete batterica, costituita prevalentemente da un'unica molecola polimerica chiamata sacculo di mureina o peptidoglicano, è una parete rigida posizionata esternamente alla membrana cellulare, difendendo la cellula da variazioni di pressione osmotica. Pur essendo rigida può espandere il proprio volume fino a tre volte. Il peptidoglicano è un polimero costituito da monomeri di glicante-tetrapeptide, questo monomero è formato da due amminozuccheri, l'N-acetil-glucosamina (NAG) e l'acido N-acetil-muramico (NAM). Al NAM è legato un tetrapeptide che lega le altre catene, tramite dei ponti interpeptidici. La struttura è quindi tridimensionale. Il disaccaride è costituito da NAM e NAG legati da legami β-1,4 glicosidici. Al NAM, tramite un residuo di acetil-lattato sono uniti quattro amminoacidi a formare il tetrapeptide, formato da L-alanina, acido-D-glutammico, o acido diamino-pimelico (prevalentemente nei gram negativi) o un altro diaminoacido Lisina (presente nei gram positivi), e D-alanina.

Lo spessore di peptidoglicano è differente tra i due grossi raggruppamenti dei microrganismi: i microrganismi gram positivi posseggono uno strato molto spesso di mureina che di fatto costituisce la parte più esterna dei microrganismi; i microrganismi gram negativi hanno invece uno strato di peptidoglicano più sottile che si trova all'interno dello spazio periplasmatico, quindi all'esterno del sacco mureinico c'è un'ulteriore membrana chiamata membrana esterna.

Un'altra differenza tra i gram positivi e gram negativi sta nel legame che intercorre tra i due tetrapeptidi, in particolare nei gram negativi avremo il DAP (acido diamino-pimelico) legato alla D-Ala (D-alanina), detto legame crociato 3-4 diretto. Nei microrganismi gram positivi, frequentemente, è presente la L-Lys (lisina) che non fa un legame diretto con D-Ala ma è mediato da un ponte interpeptidico normalmente di glicine.

Un aspetto importante dello strato mureinico è che questo polimero è sensibile all'enzima lisozima, che idrolizza il legame tra NAM e NAG e di fatto destabilizza la struttura di parete, permettendo così di rilasciare una cellula, completamente ricoperta da membrana citoplasmatica, che prende il nome di protoplasto. Il destino del protoplasto è strettamente collegato alle condizioni osmolari del mezzo in cui si trova: se il mezzo è una soluzione isotonica, il protoplasto sarà in equilibrio osmotico con la soluzione; se il protoplasto viene rilasciato in una soluzione ipotonica o ipertonica, questo ha delle conseguenze negative per il protoplasto, nel caso di soluzione ipotonica tenderà a ingrossarsi per l'ingresso di acqua all'interno.

Nella parete degli Archea non è presente peptidoglicano, ma pseudomureina costituita da N-acetilglucosamina e acido N-acetiltalosaminuroico. I legami glicosidici tra i derivati degli zuccheri sono β-1,3 e non β-1,4. Non contenendo peptidoglicano nella loro parete, gli Archea sono resistenti all'attività dell'enzima lisozima e dell'antibiotico penicillina. Il tipo più comune di parete cellulare fra gli Archea è lo strato S, ossia uno strato paracristallino e autoassemblato formato da proteine e glicoproteine. Esso è legato non covalentemente alla parete. In alcuni casi può essere anche presente solo lo strato S e non la parete, sono infatti abbastanza forti da opporsi alla lisi osmotica. Infine, non possiedono membrana esterna.

Struttura e biogenesi della parete dei batteri

Descrivere la struttura e la biogenesi della parete dei batteri indicando i principali target delle molecole antibatteriche.

La parete batterica, costituita prevalentemente da un'unica molecola polimerica chiamata sacculo di mureina o peptidoglicano, è un polimero costituito da monomeri di glicante-tetrapeptide, questo monomero è formato da due amminozuccheri, l'N-acetil-glucosamina (NAG) e l'acido N-acetil-muramico (NAM). Al NAM è legato un tetrapeptide che lega le altre catene, tramite dei ponti interpeptidici.

Le fibre di glicano si ripiegano a spirale formando cavi di peptidoglicano che si avvolgono attorno alla cellula ricoprendola completamente. La biosintesi del peptidoglicano si divide in tre fasi:

Fase 1 - Stadio citoplasmatico

• Avviene nel citoplasma e permette la formazione dei precursori del polimero UDP-NAG e UDP-NAM-5aa (pentapeptide).
• Il primo che viene prodotto è l'UDP-NAG che avviene sfruttando il fruttosio-6-P e UTP.
• Dall'UDP-NAG si forma l'UDP-NAM.
• All'UDP-NAM vengono legati gli amminoacidi sia L (che derivano dalle vie normali anaboliche) che D (prodotti da enzimi specifici).
• Tutti i processi che portano dall'UDP-NAG all'UDP-NAM-5aa sono catalizzati da una serie di enzimi che vengono chiamati Mur:
  • MurA + PEP UDP-NAG enolpiruvato → MurB UDP – NAM → MurC UDP – NAM – L-Alanina → MurD UDP – NAM – L-Alanina – D-Glutamato → MurE UDP – NAM – L-Alanina – D-Glutamato – m-DAP → MurF UDP – NAM – L-Alanina – D-Glutamato – m-DAP – D-Alanina – D-Alanina (aggiunte come dipeptide)

Fase 2 - Stadio di membrana

• I due precursori vengono legati tra loro e avviene il trasporto del glicano pentapeptide all'esterno della membrana citoplasmatica. Per questo trasferimento si utilizza un alcol a 55 atomi di carbonio, il bactoprenolo.
• Il NAM-pentapeptide si lega al bactoprenolo (perdendo UDP) lipide I → al lipide I si lega il NAG (perdendo UDP) lipide II → il glicano pentapeptide viene trasportato nel periplasma (nei gram negativi) e all'esterno (nei gram positivi).
• Il bactoprenolo, dopo aver rilasciato il glicano pentapeptide all'esterno, viene defosforilato e questo provoca il ribaltamento della molecola di nuovo verso l'interno.

Fase 3 - Stadio di parete

• Si formeranno i legami glicosidici e peptidici.
• Finito il trasporto del glicano pentapeptide all'esterno della cellula fino al punto di crescita della parete cellulare.
• Insieme ai processi di genesi di nuovo peptidoglicano devono necessariamente essere coinvolti e coordinati temporalmente e spazialmente anche i processi di rottura del peptidoglicano che è presente interno alla cellula; le autolisine (Muramidasi, legame ...).