Appunti di microbiologia applicata

Microbiologia applicata

Cellule eucariote e procariote

L'unità funzionale e strutturale fondamentale della materia vivente è la cellula: tutti gli organismi sono costituiti da cellule, tranne i virus che hanno dimensioni molto ridotte quindi visibili solo al microscopio elettronico. Le cellule si dividono in eucariote, tipiche di animali e piante, e procariote. Le prime hanno dimensioni maggiori e un DNA molto più lungo e complesso rispetto a quello delle cellule procariote. Inoltre, le cellule eucariote presentano un nucleo contenente il DNA organizzato in cromosomi e alcuni organelli (mitocondri, cloroplasti, apparato del Golgi e reticolo endoplasmatico). Altre differenze tra i due tipi di cellule sono: gli apparati per la replicazione del DNA, per la trascrizione e per la traduzione, oltre che anche la membrana cellulare e la parete cellulare (presente solo nelle piante e nei procarioti). Gli organismi eucarioti, inoltre, si dividono in pluricellulari (animali e piante) e unicellulari (protozoi, funghi, alghe e muffe).

I procarioti sono costituiti da cellule strutturalmente semplici e hanno un cromosoma chiuso e aggregato a formare una massa (nucleoide). A livello elementare ogni cellula procariota è formata da carbonio (50% che deriva dai composti organici e dalla CO₂), ossigeno (20% che deriva da composti organici, H₂O e dalla CO₂), azoto (14% che deriva da composti organici e dall’NH₃) e da idrogeno (8% che deriva dai composti organici e dall’H₂O). A livello molecolare, invece, una cellula procariota è costituita da grandi macromolecole (96%), monomeri e precursori (3%) e da ioni inorganici (1%). Si dividono in due sottotipi: i batteri e gli archea, che condividono la stessa struttura ma NON derivano da un progenitore comune quindi non costituiscono un gruppo filogeneticamente omogeneo. Da un progenitore iniziale derivano i bacteria e un altro progenitore, comune agli archea e agli eucarioti ma quindi non ai bacteria.

I bacteria, che si dividono in Gram negativi e Gram positivi, sono il gruppo più numeroso e includono i procarioti più importanti dal punto di vista medico, mentre non si conoscono archea patogeni. Essi possono avere forme diverse (cocchi, bastoncelli, spirilli…) e possono trovarsi isolati, come aggregati multicellulari (colonie, miceli, biofilm…) o come aggregati di poche cellule (sarcine, streptococchi). Poche specie vivono in ambienti estremi, a differenza degli archea, e nessuna specie nota produce metano, per la maggior parte di produzione degli archea. I bacteria includono inoltre tutte le specie che sono in grado di svolgere fotosintesi. Infine, tra archea e bacteria ci sono alcune differenze molecolari (diversa composizione della membrana citoplasmatica, della parete e degli apparati trascrizionali e traduzionali).

Cosa è la microbiologia applicata

La microbiologia applicata si occupa di organismi microscopici eucarioti e procarioti, ma anche di virus. Cerca quindi di comprendere i fenomeni della vita e le applicazioni di questi organismi a vantaggio dell’uomo o come difesa da altri microrganismi dannosi. La microbiologia consapevole nasce solo dopo l’invenzione del microscopio ottico, a opera di van Leeuwenhoek attorno alla fine del 1600 per osservare la composizione dei tessuti. Egli scopre così l’esistenza di numerosissimi microrganismi di specie diverse che non sono visibili a occhio nudo.

Inizialmente viene introdotta la teoria della generazione spontanea, secondo la quale i microrganismi originano da materiale organico e che si basa su alcune osservazioni sperimentali (del cibo lasciato all’aria per un certo tempo va incontro a putrefazione e risulta poi pieno di batteri, larve e vermi quindi si pensa che si originassero da materia organica). Redi poi smantella questa teoria per quanto riguarda gli organismi più grossi quando osserva che le larve di insetto originano dalla carne solo quando le mosche vi depositano sopra le uova.

Pasteur smantella definitivamente questa teoria verso la metà del 1800 quando svolge l’esperimento delle fiasche a collo di cigno. Egli versa e poi scalda, in modo da sterilizzare, del brodo non sterile all’interno delle fiasche a collo di cigno, fatte in questo modo perché facciano da sorta di “barriera meccanica” affinché i microrganismi presenti nell’aria non contaminino il brodo sterilizzato. Il liquido sterile viene poi messo a contatto con i microrganismi, che in poco tempo crescono e lo contaminano: Pasteur capisce quindi che i microrganismi non derivano dal materiale organico. Inoltre, smantella la credenza che la fermentazione di bevande alcoliche sia una trasformazione chimica spontanea, accorgendosi che invece è causata proprio da specifici microrganismi (lieviti). Egli scopre infatti che il vino diventa acido perché è contaminato da un batterio lattico che trasforma lo zucchero in acido lattico invece che in alcol. La soluzione che trova Pasteur è quella di riscaldare in modo selettivo il vino per uccidere il batterio lattico: questa procedura oggi prende il suo nome e viene chiamata “pastorizzazione”. Infine, Pasteur si rende anche conto che alcune malattie vengono causate da microrganismi, mentre altri microrganismi “attenuati” possono essere utilizzati per vaccinare.

Un altro importante microbiologo medico è Koch, che scopre due importanti batteri come agenti eziologici, isola l’agente responsabile della tubercolosi e introduce il concetto di “coltura pura”, originata da un solo tipo di batterio e che permette di studiare una particolare specie di batteri separandola e isolandola dalle altre specie. Egli dimostra che una goccia di sangue infetto iniettato in un individuo sano causa la contrazione della malattia. Nel 1881 Koch scrive i suoi 4 postulati:

• L’agente causale deve essere presente in tutti i casi della malattia di cui è ritenuto responsabile e deve essere assente negli individui sani.
• L’agente causale deve essere isolato dall’individuo affetto e in coltura dare origine a una popolazione cellulare omogenea.
• L’inoculo di una coltura pura dell’agente causale in individui sani deve dar luogo alla comparsa della malattia.
• L’agente causale può essere riisolato dall’organismo infettato sperimentalmente.

Lo studio dei microrganismi presenti nell’ambiente permette la nascita della microbiologia ambientale, che introduce il concetto di “coltura di arricchimento” per studiare la crescita di un particolare ceppo rispetto ad altre specie controllando in maniera selettiva la composizione di nutrienti e le condizioni di incubazione. Dunque questi terreni permettono la crescita di molti diversi batteri in cui la probabilità e la densità iniziale dei batteri determinano quale popolazione diviene dominante nella coltura. Successivamente, lo studio dei microrganismi permette anche il passaggio dalla biologia di base a quella molecolare, che permette per esempio di scoprire che il DNA è effettivamente il materiale ereditario: nel 1973 viene costruita in vitro la prima molecola di DNA funzionante grazie ad alcuni enzimi di restrizione, utilizzati dai batteri per degradare del DNA non appartenente al batterio stesso ma patogeno.

Il codice genetico, l’RNA e la traduzione delle proteine vengono poi scoperti e verificati grazie a numerosi esperimenti sul batterio Escherichia coli. A metà del 1900 quindi genetica e darwinismo entrano anche nel mondo dei batteri, grazie alla scoperta di alcuni mutanti batterici. Alla fine degli anni ’70 viene completato per la prima volta il sequenziamento del DNA, e poco dopo viene inventata, grazie allo studio del Thermus aquaticus, la tecnica della PCR per l’amplificazione di sequenze di DNA grazie a cicli di denaturazione e rinaturazione con alcuni enzimi polimerasi termostabili. Tutto ciò permette di giungere, nel 1995, al sequenziamento dell’intero genoma di un organismo.

Membrana citoplasmatica

Struttura e composizione

La struttura e la composizione della membrana citoplasmatica dei batteri è molto simile a quella degli eucarioti. È costituita dunque da un doppio strato di fosfolipidi, costituiti da una regione idrofoba (due acidi grassi) e una idrofila (glicerolo fosfato) legate tra loro da un legame estere. Nella membrana gli acidi grassi sono rivolti verso l’interno, mentre la parte idrofila è rivolta verso l’esterno, creando un mosaico fluido in cui le proteine possono muoversi. Le proteine sono integrali di membrana (cioè che attraversano entrambi gli strati fosfolipidici e costituite da α-eliche) oppure periferiche (cioè legate a proteine integrali o direttamente alla membrana, come nelle lipoproteine grazie a una coda lipidica che le ancora). A differenza delle cellule eucariote, nella membrana citoplasmatica dei batteri non ci sono steroli che danno rigidità ma sono presenti opanoidi.

La membrana citoplasmatica degli archea può assumere due conformazioni differenti: dieter (un legame eterico tra il glicerolo e 2 catene laterali idrofobiche costituite da unità ripetute di isoprene, idrocarburo a 5 atomi di carbonio) oppure tetraeteri di diglicerolo (un legame eterico tra 2 glicerolo e 4 catene laterali isoprenoidi). Se la membrana è costituita da dieteri del glicerolo si forma un doppio strato lipidico, se invece è costituita dai tetraeteri di diglicerolo si forma un solo strato lipidico. Le membrane a monostrato sono molto resistenti a rottura termica quindi sono presenti soprattutto negli archea ipertermofili.

Funzioni

• Fa da barriera di permeabilità, isolando quindi la cellula dall’ambiente extracellulare.
• Controlla gli scambi con l’ambiente cellulare grazie alle proteine di membrana.
• Accumula energia chimica ed elettrica e la trasforma in forza protonmotrice, che permette funzioni quali la respirazione o la fotosintesi. Trasforma inoltre l’energia luminosa in energia chimica (negli eucarioti ciò avviene sulle membrane interne dei cloroplasti) e la forza protonmotrice in energia chimica (negli eucarioti ciò avviene nei mitocondri) o cinetica.
• Trasmette segnali di variazioni ambientali ai sistemi metabolici, chemiotattici e genetici.
• Secerne prodotti extracellulari e costituenti delle strutture extracitoplasmatiche.

Trasporto attraverso la membrana

Il trasporto passivo avviene secondo gradiente di concentrazione e non richiede consumo di energia. Questo si divide a sua volta in diffusione semplice o facilitata. Nella diffusione facilitata ci sono proteine di trasporto (carrier proteins, come le porine) che aumentano la velocità di ingresso dei soluti, ma non ne consente l’accumulo.

Il trasporto attivo sfrutta invece energia metabolica per trasportare le molecole contro gradiente di concentrazione. Questo a sua volta si divide in trasporto primario (che utilizza energia metabolica primaria, come l’idrolisi dell’ATP) e secondario (che utilizza l’energia potenziale di un gradiente elettrochimico).

Un altro tipo di trasporto attraverso la membrana è la traslocazione di gruppo, in cui la sostanza viene modificata chimicamente, per esempio con una fosforilazione. Il trasporto viene poi azionato da un composto organico ricco di energia. Un esempio è il trasporto di zuccheri come fruttosio, mannosio e glucosio nell’Escherichia coli grazie al sistema della fosfotrasferasi (PTS). Questo è costituito da 5 proteine che vengono alternamente fosforilate e defosforilate con un meccanismo a cascata finché l’effettivo trasportatore (enzima II_c) fosforila lo zucchero.

I trasportatori di membrana sono costituiti da 12 α-eliche allineate tra loro in cerchio in modo da formare un canale che attraversa la membrana. Questi trasportatori sono altamente specifici e la loro biosintesi è regolata in funzione della loro concentrazione e della natura delle risorse disponibili in ambiente. Inoltre, se la concentrazione del substrato è tale da saturare il trasportatore, un suo ulteriore aumento non incide sulla velocità di trasporto.

Il trasporto può essere di 3 diversi tipi: uniporto (trasporto di un solo soluto in una direzione), antiporto (trasporto simultaneo di 2 soluti in direzioni opposte) o simporto (trasporto simultaneo di 2 soluti nella stessa direzione). Nella parete cellulare è presente anche uno spazio chiamato periplasma tra la membrana plasmatica e la membrana esterna in cui alcune proteine (proteine di legame periplasmatiche) svolgono funzione di trasporto ABC. In questo tipo di trasporto sono coinvolte anche una proteina di membrana che forma il canale e una proteina citoplasmatica che idrolizza ATP fornendo energia per il trasporto. Le proteine periplasmatiche hanno un’alta affinità per il substrato anche quando questo è presente in basse concentrazioni. Un esempio di sistema di trasporto ABC è il trasporto del maltosio nell’Escherichia coli.

Agenti antibatterici sulla membrana

• I detergenti distruggono la membrana citoplasmatica ma non hanno tossicità selettiva.
• I peptidi antimicrobici sono invece piccoli peptidi cationici (12-100 amminoacidi) che formano dei pori nella membrana destabilizzandola. Successivamente questi entrano all’interno della cellula dove alterano le funzioni vitali.
• Composti ionofori danneggiano tutte le membrane plasmatiche abbattendo il potenziale di membrana.
• Alcuni antibiotici danneggiano la membrana perché agiscono come deterrenti cationici interagendo con i fosfolipidi e aumentando la permeabilità cellulare. Gli antibiotici sono sostanze organiche a basso peso molecolare prodotte da altri microrganismi eucarioti o procarioti. A bassa concentrazione inibiscono la crescita di altri microrganismi e si dividono in batteri-cidi o batterio-statici a seconda che uccidano o blocchino la proliferazione dei batteri.

Parete cellulare

Struttura e composizione

La parete cellulare è una struttura rigida immediatamente esterna alla membrana cellulare. È presente in quasi tutti i batteri e serve per determinare la forma della cellula, le dà resistenza e la protegge dalla lisi osmotica. Alcuni procarioti possono avere ulteriori strati di rivestimento oltre la parete cellulare. Tra questi ricordiamo la capsula, uno strato lasso e amorfo che permette di evitare la fagocitosi, composto da polisaccaridi e a volte polipeptidi e connesso con la parete cellulare da legami ionici o covalenti. Gli strati S sono invece rivestimenti proteici con una struttura quasi cristallina.

In base alla risposta della cellula alla colorazione di Gram i batteri si dividono in Gram positivi e in Gram negativi. Questa risposta alla colorazione dipende in gran parte dalla struttura della parete cellulare. Per la colorazione di Gram bisogna mettere una goccia di acqua sul vetrino portaoggetti e stendere con un’ansa sterilizzata un microrganismo prelevato da una colonia, lasciare asciugare e passare sul bunsen. Ricoprire il preparato con cristal-violetto (tutte le cellule sono viola), aggiungere una soluzione di iodio (tutte le cellule rimangono viola) poi decolorizzare con etanolo (cellule Gram positive rimangono viola, quelle Gram negative si decolorano perché la parte esterna viene solvatata) e contrastare con safranina (cellule Gram positive rimangono viola, quelle Gram negative si colorano di rosa-rosso).

I batteri Gram positivi sono costituiti principalmente da peptidoglicano (90%) ma anche da polisaccaridi che rafforzano la parete, acidi teicoici che rendono carica negativamente la parete e acidi lipoteicoici che si formano quando gli acidi teicoici si legano covalentemente ai lipidi della membrana. Il peptidoglicano (mureina) è un polisaccaride costituito da due zuccheri sostituiti (N-acetilglucosammina e acido N-acetilmuramico) e da pochi amminoacidi (L-alanina, D-alanina, acido D-glutammico, L-lisina e acido diaminopimelico). Questi costituenti si assemblano formando il glican tetrapeptide, l’unità strutturale che costituisce il monomero del peptidoglicano. Presentano legami crociati tra amminoacidi e legami β-1,4-glicosidici tra gli zuccheri che danno rigidità alla cellula ma sono anche sensibili all’azione del lisozima che taglia questi legami e provoca la lisi della cellula. I vari monomeri sono uniti tra loro con un legame tra il gruppo carbossilico della D-alanina in posizione 4 e un gruppo amminico dell’acido diaminopimelico in posizione 3. I legami crociati del peptidoglicano nei batteri Gram positivi si formano attraverso un corto ponte peptidico.

Tra i Gram positivi ricordiamo i bacilli, i clostridi, i lattici, gli attinomiceti e i micobatteri.

Nei batteri Gram negativi, invece, il peptidoglicano costituisce una piccola frazione della parete e i legami crociati si formano direttamente. Essi sono costituiti per la maggior parte da una membrana esterna che funge da barriera di permeabilità e aumenta la resistenza ad agenti tossici. Ha una composizione asimmetrica perché è costituita da fosfolipidi nel foglietto interno e lipopolisaccaride in quello esterno. Il lipopolisaccaride (LPS) presenta un lipide A (regione idrofoba costituita da un dimero di glucosammina fosforilata a cui sono legati almeno 6 residui di acidi grassi saturi); un core (composto da eptosio e acido 2-cheto-3-deossiottonico) legato in posizione 6 del lipide A; e una catena laterale composta da polisaccaridi ripetuti. Serve per rinforzare la parete ed evitare la fagocitosi ma è tossico per gli animali (il lipide A è un’endotossina). La membrana esterna è permeabile a piccole molecole idrofile, ioni e proteine grazie alla presenza di proteine canale transmembrana (porine). Queste sono formate da un poro piccolo tra tre subunità identiche ciascuna costituita da un canale e si dividono in aspecifiche (formano canali in cui passa qualsiasi soluto).