Microbiologia II

Microbiologia II

I fagi della classe T sono i piu’ studiati (tra questi quelli piu’ conosciuti sono il T4 e il T7), la

lunghezza della ORF e’ arbitraria, nei procarioti non esiste la TATA-box ma la Pribnow box a -10 o

-35 a cui si lega il fattore sigma, a -6 rispetto all’ATG troviamo una sequenza piu’ o meno

degenerata AGGAGG definita ribosome binding site, la sequenza TATAAT e’ quella a massima

efficienza ma non si trova quasi mai e presenta sempre delle modiche nucleotidiche, a monte del

promotore e’ presente una sequenza UP ricca in AT che e’ riconosciuta dalla subunita’ alfa della

RNAP (come tutte le sequenze ricche in AT) e stabilizza il complesso per la trascrizione, il DNA del

nucleoide presenta delle proteine simili agli istoni (HLP) che ripiegano l’acido, il numero delle anse

dipende dalle condizioni ambientali e dallo stadio di sviluppo (nucleoide struttura dinamica), la

parete cellulare e’ composta da peptidoglicani (presente anche nella cartilagine ialina ed e’

correlato ad alcune malattie immunitarie), anche nell’actina esiste un meccanismo di

polimerizzazione e depolimerizzazione caratteristico dei microtubuli (l’actina utilizza ATP mentre i

microtubuli il GTP), il mutante del Coli e’ dato da una forma arrotondata (morfologicamente simile a

un cocco) che e’ causato da un’alterazione nel gene mreB (proteina simile all’actina, ALP), lo

stesso gene mutato in un cocco fa assumere al microrganismo una forma a bastoncello, questa

proteina si dispone longitudinalmente a forma elicoidale lungo tutto il Coli e durante la replicazione

la fase di allungamento del bastoncello e’ preceduta da una sintesi elevata di MreB che si dispone

sempre elicoidalmente (accrescimento dell’elicoide), la proteina simile all’actina ParM, insieme a

MreB, ha subito un processo di evoluzione convergente (in quanto e’ costituita da sequenze

completamente diverse dall’actina e con aa diversi da quelli che compongono l’actina ma la sua

struttura e’ simile a quest’ultima e anche il suo ruolo), la crescentina, precisamente la CreS, si

dispone su un lato dell’organismo in cui e’ presente, il caudobacter crescentus, se viene mutata

porta alla morfologia a bastoncello del mutante (il caudobacter e’ a forma di bastoncello ripiegato

poiche’ l’unico flagello presente puo’ essere sfruttato maggiormente nel movimento in quanto

permette di ruotare anche il batterio), questo batterio presenta sia una forma sessile che flagellare

(batterio migrante), con la microscopia confocale ci permette di osservare strutture citoscheletriche

e proteine, il citoscheletro batterico e’ utile conoscerlo per un eventuale target di un antibiotico

contro una proteina del microrganismo, FtsZ (simile alla tubulina o TLF, costituito da un singolo

filamento lineare) che formera’ un anello (anello Z) che si produce durante la fissione al centro

della cellula in divisione in una zona detta setto di scissione, in questa regione avviene la

spartizione del nucleoide duplicato nelle figlie e alla fine il setto si richiude, la divisione canonica

comprende una cellula madre che si divide in due cellue figlie, in alcuni batteri come Pirella e

Blastobacter esiste la gemmazione in cui una madre invecchiata produce una figlia da una parte di

citoplasma che puo’ essere adiacente alla cellula madre o separate da una lunga protrusione

citoplasmatica detta ifa, oppure come il caudobacter sul suolo risiede una cellula madre che una

volta che consuma tutte le risorse nutritive in loco si divide in una cellula flagellata, curva di

crescita dei batteri e’ data dalla N(t)=N*2^(t/td) (t=istante t, td=tempo di scissione), questa e’una

curva ideale che non risponde alla realta’ in quanto ogni batterio presenta una curva differente e la

velocita’ con cui una divisione avviene e’ dipendente dalle condizioni di vita dell’organismo, i

mutanti che influenzano la divisione cellulare (mutanti filamentating temperature sensitive)

possono essere classificati in base alle modalita’ di mutagenizzazione: ftsZ (proteina essenziale

per il setto), in cui si assiste alla formazione di batteri lineari senza setto, ftsA, in cui i mutanti

lineari formano setti iniziali, ftsI, in cui vanno incontro a lisi (gene che e’ coinvolto nella sintesi di

peptidoglicano durante la divisione e in particolare degrada peptidoglicani per l’allungamento e per

permettere la sintesi di nuovi peptidoglicani, la mutazione provoca fratture nella maglia glicanica e

l’acqua entra per osmosi), ftsZ e’ una GTPasi e prima componente del divisoma e permette

l’invaginazione del setto, due ipotesi sulla formazione del setto: ipotesi del PUSH in cui il

peptidoglicano in sintesi spinge dentro ftsZ e quella del PULL in cui ftsZ tira il peptidoglicano

all’interno dell’invaginazione (quella piu’ accreditata), un residuo detto T7 loop si inserisce in una

tasca in cui risiede il nucleotide del monomero successivo una volta avvenuta la fosforilazione del

GDP, in seguito a defosforilazione del sito ogni monomero non si stacca immediatamente, come la

tubulina, ma forma delle strutture ripiegate che risultano macroscopicamente nell’insieme una

struttura circolare e dopo alcuni minuti si allontanano, l’anello Z dopo la divisione si sposta

immediatamente al centro della cellula figlia nuovamente in divisione, ftsA mutata stabilizza i

filamenti e non si possono defosforilare, probabilmente ftsZ puo’ intervenire nella formazione

dell’anello Z per mezzo di monorotaie fatte di MreB, formazione dell’anello 3 ipotesi: 1. ftsZ, libere

nel citoplasma, in risposta a segnali molecolari, polimerizzano un unico filamento al centro della

cellula o direttamente in loco o formando dei filamenti nel citoplasma che si appaiono a livello dello

Z-ring, 2. FtsZ si appaiono in protofilamenti affiancati e legati tramite proteine SlmA, 3. ftsZ non

deve essere polimerizzata ma esiste sottoforma di spirale e durante la citochinesi si comprime per

mezzo dello scorrimento dei filamenti l’un l’altro con la sottrazione di monomeri, posizionamento

dell’anello Z: 1. Grazie a un localizzatore topologico proteico (ZipA, dedotta dal fatto che e’ una

proteina transmembrana), 2. Esistono degli anelli perisettali, ovvero delle tracce di maglie al centro

della membrana in cui i 3 componenti della membrana sono fusi tra loro (solo nei bacilli), 3.

Occlusione del nucleoide, in cui la proteina SlmA, legata al DNA, rapisce ftsZ e non permette lo Z-

ring al centro, una volta che il nucleoide si e’ diviso il DNA non e’ piu’ situato al centro e SlmA non

si lega piu’ al DNA e lascia libera ftsZ a formare lo Z-ring, modello MinCDE, in cui i mutanti

avevano il setto ad un’estremita’ e si formavano una macrocellula, che presentava due nucleoidi e

il plasmide inserito, e una minicellula senza DNA ma con tutte le proteine dei geni housekeeping e

il plasmide (utili per la purificazione di plasmidi), i geni coinvolti sono minC minD minE, i mutanti

minD (ATPasi nel citosol che si attacca alla membrana in un punto aspecifico e si lega a minC, a

questo punto il complesso minCD-ATP determina l’inibizione della formazione dell’anello da parte

di ftsZ) vanno incontro a formazioni del setto anomale formando minicells, la delezione dell’intero

locus determina il medesimo fenotipo, minE interagisce con il complesso stimolando l’attivita’

ATPasica inibendo l’interazione tra minC e minD e dissocia minD dalla membrana, minE e’

concentrato nella regione centrale della cellula e si sposta oscillando verso un’estremita’ della

cellula per poi scomparire e ricomparire al centro della cellula e di qui si sposta nuovamente verso

il polo opposto, il moto della proteina e’ continuo e in stato di non attiva proliferazione e’ rallentato,

anche minC e minD oscillano e sembrano spinti da minE in quanto il suo movimento e’ in ritardo

rispetto ai primi due, in quanto minE deve provocare l’inibizione del complesso ATPasico, e questo

moto oscillatorio provoca una maggiore probabilita’ di formazione dell’anello al centro, forse minCD

si forma su MreB e lo usa come binario quindi tutti i componenti fin’ora esposti viaggiano sulle

monorotaie di MreB, il citoscheletro batterico quindi e’ coinvolto nel trasporto dei componenti del

batterio, per mutare organismi bisogna indurli a vivere in condizioni sfavorevoli rendendoli mutanti

condizionali (ad esempio mutazioni temperatura sensibili), la divisione cellulare manifesta

un’apprezzabile correlazione con la replicazione del DNA e con il partitioning, la divisione cellulare

si blocca, in particolare, quando la cellula riporta alcuni danni al proprio DNA, questo fenomeno e’

ben conosciuto ed e’ dato dal sistema genico SOS che non viene espresso a causa del repressore

lexA, in caso di stress recA, stimolato da un DNA tronco a singolo filamento, interagisce con lexA

che induce la sua degradazione per mezzo del suo sito di autodegradazione, a questo punto sulA

viene espresso e inibisce la polimerizzazione di ftsZ, il plasmide F presenta delle proteine che

mascherano le estremita’ che entrano e non vengono riconosciute mentre il batteriofago una volta

entrato produce proteine simili a lexA che reprimono il sistema SOS, sulA forma un dimero e lega

ftsZ in cui risiedono 2 subunita’ T7-loop a cui si legano ftsZ impedendo la polimerizzazione, Cairns

scopri’ l’esistenza delle forche replicative con l’induzione della radioattivita’ del DNA per creare una

fluorescenza che si distingue su uno sfondo oscurato di una microfotografia del vetrino cosparsi di

gelatina tipica delle macchinette kodak, ad ogni forca corrispondeva una bolla replicativa che si

generava in seguito alla replicazione, il nucleoide batterico e’ costituito da numerose anse (circa

100 nell’E.Coli) che si collegano a un nucleo proteico la cui composizione e’ ancora sconosciuta, il

DNA batterico si denatura subito in seguito alla lisi, il DNA di natura possiede un

superavvolgimento negativo per la compattazione istonica, i superavvolgimenti negativi sono

permessi grazie alle topoisomerasi, ogni ansa possiede un superavvolgimento indipendente

topologicamente dalle altre, anche per lo studio della replicazione bisogna utilizzare l’approccio

genetico: Selezione di mutanti condizionali letali per i geni coinvolti nella replicazione attraverso:

screening di mutanti incapaci di incorporare 3H a temperature non permissive (verrano incorporati

solo da quelli che hanno una replicazione normale), selezione di cloni insensibili (piu’ efficiente)

all’infezione di alcuni fagi a temperature non permissive (verrano uccise le cellule che non avranno

una replicazione effettiva), selezione di cloni resistenti a mutageni a dosi letali a temperature non

permissive (solo quelli che hanno un macchinari di replicazione attivo potranno essere

mutagenizzati (es. 5-Br-U-OH), sono stati anche utilizzati approcci biochimici-fisiologici attraverso

una selezione di frazioni proteiche e proteine in grado di complementare, in vitro, la mancanza di

fattori essenziali alla replicazione su un disco di cellophane di bonhoffer o su un sistema in vitro di

kornberg, la replicazione batterica inizia in un unico punto ai poli opposti, l’origine di replicazione e’

stata ottenuta mediante: analisi di delezione (la regione responsabile della replicazione non puo’

essere deleta), analisi dei geni localizzati nei pressi dell’ipotetica origine di replicazione (sono

maggiormente espressi perche’ presenti in un numero di copie maggiore), una forca replicativa

batterica di una cellula in attiva proliferazione parte ogni 20’ (piu’ di una bolla replicativa) mentre si

divide ogni 40-45’ (non si puo’ dire con certezza che un batterio sia aploide), un altro strumento

d’analisi puo’ essere il clonaggio della regione d’inizio della replicazione in un plasmide privo di

proprio replicone (solo in questo modo sara’ stabilmente mantenuto in una cellula batterica ed e’

l’unica caratteristica che fa di questa struttura un plasmide), esistono anche plasmidi lineari,

l’origine di replicazione di Coli si chiama oriC, una volta frammentato il nucleoide tramite enzimi di

restrizione (es. BamH1) si formeranno frammenti, in uno di questi ci sara’ l’ori, con cui verrano

legati tramite ligasi a un plasmide frammentato a sua volta con la resistenza all’ampicillina, in

seguito si e’ scoperto l’origine di replicazione e l’unita’ minima di replicazione (245bp) ricca in AT

con 8 regioni di legame per la DnaA di cui 3 ad alta affinita’ (R1, R2, R4 a cui si lega

indipendentemente dalle situazioni in cui si trova), 2 a minore affinita’ (R3, R5) e 3 ad affinita’

specifica in quanto vengono legati solamente quando DnaA si lega ad ATP (I1, I2, I3) e cio’

favorisce un legame cooperativo, ovvero il legame della DnaA ai siti R3-5, infine un sito per IHF e

uno per FIS, sono presenti sequenze GATC sensibili alla metilasi dam (metilazione della A nel

filamento parentale durante la replicazione), la DnaA interagisce con la N-terminale lega l’elicasi e

la C-terminale alla DNA pol, con la parte centrale si lega all’ATP essa ha una struttura elicoidale e

costituisce un rocchetto per il DNA inducendo uno stress torsionale negativo e aprendo per prima

la sequenza ricca in AT per poi arrivare l’elicasi, caricatore della pinza gamma (un dimero che

circonda il DNA), pinza beta e gli altri componenti, esistono vari modelli dei regolatori della

replicazione (firing): titolazione della forma libera della proteina DnaA da parte del sito datA ,

regolazione trascrizionale di DnaA, sequestro dell’origine di replicazione da parte della membrana

di SeqA (le regioni oriC e’ ricca di sequenza GATC che possono essere metilate dalla dam metilasi

sull’A, la natura della replicazione di tipo semiconservativa determina un DNA neosintetizzato di

tipo emimetilato, il DNA viene rimetilato in circa 3’ e quello della regione oriC impiega 12-13’,

questo ritardo e’ dovuto al legame di questa regione della proteina SeqA che si lega saldamente al

DNA emimetilato, la proteina DnaA si lega al DNA della regione oriC quando questo e’

completamente metilato), si dice che SeqA si lega alla forca e la porta sulla membrana, ipotesi del

controllo mediato: DnaA-ATP interagisce con la membrana in base alla composizione della

membrana si puo’ misurare l’attivita’ della proteina (se la membrana e’ composta prevalentemente

di fosfolipidi basici, come lisilfosfatidilglicerolo il complesso con ATP e’ stabile mentre se troviamo

fosfogliceridi acidi, come cardiolipina e fosfatidilglicerolo, perche’ si sta accrescendo si favorisce la

defosforilazione dell’ATP, controllo RDA in cui l’allungamento e’ favorito dalla proteina Hda che si

fissa sull’eicasi ed espone Dna-ATP ne induce la defosforilazione che fa sciogliere il toroide (la

struttura dell’enzima) cosi’ l’elicasi puo’ svolgere la doppia elica, la concentrazione della proteina

DnaA e’ importante affinche’ avvenga la replicazione, l’ori di un genoma batterico si trova a circa

15’ mappa, al 1’ si trova il primo aa che e’ stato trasdotto nel Coli (thr), le due forche si incontrano

non al polo opposto ma e’ un po’ piu’ spostato ed esiste un meccanismo di regolazione in regioni

ter in cui si legano due proteine Tus (E.Coli) e RPT (B.Subtilis) che interrompono il procedere della

forca interagendo probabilmente con l’elicasi, esistono almeno 6 siti ter e funzionano in modo

unidirezionale, e’ un monomero che si lega o in un modo o nell’altro in base alla disposizione della

sequenza ter, sono sequenze altamente analoghe e non sono palindromiche, nel Coli le due forche

replicative si incontrano nella regione compresa tra terC e terA nel 99% dei casi, nell’1% terC viene

oltrepassata e si incontrano in terB, a ridosso del punto opposto all’ori, una volta che si arriva a

questa sequenza il replisoma si blocca, gli altri ter vengono oltrepassati in quanto non presentano

la sequenza direzionalmente corretta, l’elicasi e’ costituita da 6 subunita’ con siti ATPasici ed esiste

un’asimmetria nelle subunita’ e si susseguono i seguenti stati: ATP, ADP, vuota, ogni subunita’

vuota ha davanti a se’ una subunita’ con ATP e anche le altre allo stesso modo, ad ogni ciclo le

subunita’ cambiano lo stato in maniera sistematica e questo cambiamento di stato asimmetrico

provoca un meccanismo ballerino che permette la denaturazione del DNA e la scomposizione delle

due eliche, Tus agisce inibendo l’azione di ciascuna subunita’ una alla volta provocando

un’aterazione della funzione sempre maggiore finche’ l’elicasi non smette di funzionare,

cromosomi lineari li hanno Borrelia, streptomyces, rhodococcus fascians e agrobacterium

tumefaciens (che modifica lo stato della pianta grazie all’iniezione del DNA nella pianta ed e’ stato

motivo di numerosi esperimenti di ingegneria genetica vegetale), i procarioti non hanno le

telomerasi e utilizzano diversi meccanismi ipotizzati:1. nella parte terminale sono presenti

sequenze palindromiche che ripiegano la terminazione e in questo modo la DNAP ricopre il

frammento di Okazaki, in seguito una nucleasi taglia il ripiegamento offrendo al di sotto un 3’OH e

la DNAP ricopre anche quel frammento, 2. prevede una struttura a doppio ripiegamento e si ha

una collaborazione tra DNAP e nucleasi, 3. Una proteina ad RNA che si lega a una sequenza

specifica e fornisce il primer alla polimerasi, il replisoma si ancora alla regione centrale delle cellula

mentre i cromosomi neosintetizzati migrano alle estremita’ polari con l’origine di replicazione e

l’ultima regione a essere replicata e’ la sequenza ter, si pensava che l’allungamento fosse dato

dall’ori, ancorata alla membrana, che veniva trascinata ai due poli in proporzione alla replicazione

del nucleoide, in realta’ non e’ vero in quanto il nucleoide si replica molto piu’ velocemente di

quanto la membrana si sintetizza, la ghigliottina data dal setto dei mutanti delle cellule cade nei siti

ter, locus