Microbiologia I (batteriologia)

Microbiologia e microbiologia clinica I

Organizzazione del corso

Docenti: prof. Rossolini e prof.ssa Torcia

Microbiologia e microbiologia clinica I (II semestre II anno):

• 40 ore di lezione frontale
• 20 ore di e-learning

Microbiologia e microbiologia clinica II (I semestre III anno):

• 40 ore di lezione frontale
• 20 ore di e-learning

L'esame è unico alla fine del corso. Si tratta di una prova scritta con 62 domande a scelta multipla (al computer). In caso di fallimento o di rifiuto del voto, si passa all'esame orale. C'è la possibilità di sostenere una prova in itinere alla fine del primo modulo (35 domande) con successivo completamento del secondo modulo alla fine del I semestre del III anno (35 domande). Il voto finale deriva dalla media dei due voti. In caso di fallimento/rifiuto della prova in itinere, si può comunque dare l'esame scritto al termine del C.I.

Introduzione alla microbiologia

La microbiologia si occupa dello studio dei microrganismi, che hanno dimensioni piccole o molto piccole (non sono visibili ad occhio nudo). Esistono molte sottodiscipline:

• Microbiologia medica/clinica: studio dei microrganismi patogeni per l’uomo e dell’uso dei microrganismi come potenziale terapia
• Microbiologia veterinaria
• Microbiologia agraria
• Microbiologia ambientale
• Microbiologia industriale

Esistono vari tipi di microrganismi:

• Batteri (a struttura cellulare procariota, prevalentemente unicellulari)
• Virus (agenti subcellulari)
• Prioni (agenti subcellulari)
• Miceti (a struttura cellulare eucariota, unicellulari o pluricellulari)
• Artropodi/parassiti (a struttura cellulare eucariota, unicellulari o pluricellulari)

Nel corso di microbiologia I tratteremo la batteriologia. Il corso di microbiologia II, invece, affronta gli altri tre gruppi.

Esempi di malattie umane causate da batteri

Malattie come pertosse, meningite batterica, ulcera gastrica, colera, antrace, faringo-tonsillite, impetigine, lebbra sono causate da batteri. Ad esempio, faringo-tonsillite e impetigine spesso hanno lo stesso agente eziologico, lo Streptococcus pyogenes.

Nomenclatura batterica

I batteri si denominano con un doppio nome in latino, che indica genere e specie. Ad esempio, l’agente eziologico della lebbra si chiama Mycobacterium leprae, mentre quello del colera – una grave malattia diarroica – è detto Vibrio cholerae. La sifilide, invece, è causata dal Treponema pallidum, mentre il tifo esantematico dalla Rickettsia prowazekii.

Il microbiota

Non tutti i batteri sono patogeni. Nel nostro organismo vivono molti batteri non patogeni da subito dopo la nascita: appena il neonato viene esposto all’ambiente esterno, alcuni distretti del suo corpo vengono colonizzati da specie batteriche diverse, andando a comporre il microbiota normale dell’organismo umano. Si tratta di una popolazione batterica molto varia, i cui membri intrattengono in genere con l’ospite un rapporto di commensalismo o di mutualismo. Nel caso del mutualismo, si trae dalla convivenza un’utilità reciproca o almeno di uno, senza comunque arrecare danno all’altro. Nel caso del commensalismo, invece, si assiste ad una convivenza senza danno né utilità per nessuno dei due “conviventi”.

Cellule umane e microbiota

Le cellule umane che compongono il nostro organismo sono in numero dell’ordine di 3 x 10¹³. Il nostro corpo, però, è composto anche dalle cellule del microbiota, che sono dell’ordine di 10¹⁴. In percentuale, infatti, il corpo umano è costituito per il 75% da cellule batteriche (solo 1/5 sono cellule umane): le cellule microbiche che abitano il nostro organismo pesano in tutto ca. 1 kg. Dal punto di vista genomico, i geni umani nel nostro organismo sono ca. 20 000, mentre quelli appartenenti al microbiota sono ca. 2 000 000. Alla luce di queste considerazioni, il microbiota viene oggi considerato come un ulteriore apparato del nostro organismo, che, come tutti gli altri, può essere affetto da patologie.

Batteriologia medica

La batteriologia medica è suddivisibile in due sezioni:

• Parte generale, che consta di vari argomenti:
  • Struttura della cellula batterica, suoi componenti e loro funzioni
  • Crescita e moltiplicazione dei batteri
  • Coltivazione dei batteri (a scopo diagnostico)
  • Classificazione dei batteri
  • Il microbiota dell’organismo umano
  • Meccanismi con cui i batteri causano malattia (meccanismi di patogenesi batterica)
  • Farmaci antibatterici (meccanismi d’azione e meccanismi di resistenza dei batteri agli antibiotici)
  • Diagnosi di laboratorio delle infezioni batteriche
• Parte speciale: caratteristiche dei principali batteri di interesse medico (morfologia, colorabilità, habitat, modalità di trasmissione, potere patogeno) e delle infezioni da essi causate.

Cellula batterica

La cellula batterica è molto più piccola di quella eucariotica e presenta una struttura più semplice, caratteristica dell’organizzazione procariotica. Elenchiamo le principali differenze della cellula batterica rispetto a quella eucariotica:

• Non esiste un nucleo compartimentato
• Il materiale genetico nel procariota è organizzato in un unico cromosoma circolare
• Il contenuto di DNA è minore: i batteri hanno ca. 0,5-8 x 10⁶ coppie di nucleotidi (nell’uomo ce ne sono ca. 10⁹)
• Il DNA batterico non presenta introni
• Non esiste il citoscheletro
• Gli organuli sono quasi del tutto assenti: ci sono quasi esclusivamente ribosomi

La cellula batterica ha dimensioni attorno a 1 µ. Quasi tutti i batteri sono visibili al microscopio ottico a massimo ingrandimento. Hanno una forma generalmente regolare perché possiedono una parete cellulare rigida (ad eccezione dei microplasmi). In base alla forma, i batteri si distinguono in:

• Cocchi, cellule sferiche
• Bacilli o bastoncini, cellule allungate
• Cocco-bacilli, cellule con forma intermedia tra le due

I bacilli possono avere l’asse maggiore rettilineo oppure incurvato: in quest’ultimo caso assumono una forma “a virgola” e vengono detti vibrioni. Se il bacillo presenta più curvature, prende il nome di spirillo o spirochete. Esistono anche dei batteri che crescono formando dei filamenti che si ramificano. Alcuni batteri, inoltre, possiedono un flagello, che utilizzano per muoversi (ad esempio i vibrioni).

Aggregati cellulari

Le cellule batteriche possono anche aggregarsi tra loro:

• Cocchi: possono associarsi in coppie (diplococchi), in catenelle (streptococchi) o a grappolo (stafilococchi)
• Bacilli: possono associarsi in catenelle (streptobacilli)

Osservazione al microscopio

Per osservare le cellule batteriche al microscopio ottico si utilizza un vetrino portaoggetto su cui si depone il materiale contenente batteri, precedentemente prelevato tramite un’ansa per batteriologia (bacchetta al termine della quale si trova un filo di platino con il fondo ad anello: viene passato prima sulla fiamma per rimuovere i batteri naturalmente presenti sulla sua superficie e poi viene usato per raccogliere e depositare il materiale batteriologico sul vetrino). Si immette il colorante nel materiale batteriologico e si fa asciugare. Per mettere a fuoco correttamente è poi necessario deporre sulla superficie del vetrino una goccia di olio di cedro (esame al microscopio ottico in immersione). Per osservare le cellule batteriche al microscopio ottico è necessario il massimo ingrandimento (100x). Per vedere gli spirilli, che sono cellule piuttosto sottili, è necessario il microscopio a campo oscuro.

Componenti fondamentali della cellula batterica

I componenti fondamentali della cellula batterica si trovano in tutte le cellule batteriche. Sono:

• Membrana plasmatica
• Citoplasma
• Cromosoma
• Parete cellulare (cell wall)

Cromosoma

Il cromosoma batterico non è contenuto in un nucleo. Si trova generalmente localizzato in certe zone del citoplasma batterico che prendono il nome di nucleoide. Il cromosoma porta il corredo genetico essenziale per la cellula, cioè codifica per quelle caratteristiche che si riferiscono alla cellula batterica che vive nel suo habitat naturale (nell’acqua, in simbiosi con l’uomo ecc.). È costituito da un DNA bicatenario (come quello umano), ossia a doppia catena. Ha una struttura circolare ed è una singola molecola. Tuttavia, esistono delle eccezioni: ci sono dei batteri con cromosoma lineare (simile a quello eucariotico) oppure con un più di un cromosoma (ad esempio, due cromosomi circolari oppure uno circolare e uno lineare). I batteri sono aploidi, ossia possiedono un’unica copia di ciascun cromosoma. Ciò determina un’evoluzione più rapida: ogni mutazione ha la possibilità di risultare in un fenotipo (nei patrimoni diploidi, invece, esistendo due copie di ciascun cromosoma, la mutazione si manifesta a livello fenotipico solo se è dominante). Il patrimonio aploide costituisce quindi uno svantaggio per l’individuo, ma non per la popolazione, che invece ne trae un vantaggio. Le dimensioni del cromosoma batterico sono molto variabili e vanno da 0,5 a ca. 8 milioni di coppie di nucleotidi. Batteri che sono in grado di vivere in ambienti diversi hanno la possibilità di adattarsi a questi differenti habitat, quindi presentano maggiore complessità strutturale. La diversa dimensione del genoma batterico riflette le diverse esigenze e le diverse complessità della cellula batterica.

Il classico modello di cellula batterica è rappresentato da Escherichia coli. Questa specie fa parte del nostro microbiota intestinale, ma è anche emessa all’esterno con le feci (torna poi nell’intestino attraverso l’acqua e i cibi). Deve quindi essere in grado di sopravvivere in ambienti diversi. Il suo genoma conta 4,64 Mb (megabasi).

L’Haemophilus influenzae, invece, vive solo nelle nostre vie aeree (appena fuoriesce da questo ambiente, muore). Ha infatti un genoma molto più piccolo, che consta di sole 1,83 Mb.

Uno dei batteri con patrimonio genetico più esiguo è il Mycoplasma pneumoniae, che non possiede parete batterica e presenta solo 0,82 Mb. È chiaro che sarà E. coli ad essere molto più facilmente trasmissibile da un individuo all’altro. Questa specie, infatti, si può trasmettere per via diretta (contatto) o attraverso gli alimenti. H. influenzae, invece, si trasmette solo per contatto stretto (goccioline di saliva). La diversa capacità di sopravvivenza, quindi, influenza le modalità di trasmissione.

Il cromosoma batterico di E. coli è lungo ca. 1 mm (molto più della cellula stessa). Per essere contenuto nella cellula batterica, deve essere spazialmente organizzato: infatti, il cromosoma si superavvolge (processo di superspiralizzazione della molecola di DNA). Viene diviso in diversi domini, ciascuno dei quali si superspiralizza. È un processo che viene ripetuto continuamente, perché, ogni volta che un gene deve essere espresso, il cromosoma viene svolto e riavvolto di nuovo. Il processo è svolto da enzimi della categoria delle isomerasi, detti DNA topoisomerasi. Questi enzimi sono bersaglio di alcuni antibiotici.

Citoplasma

Il citoplasma batterico contiene il cromosoma, i sistemi enzimatici e i ribosomi. Può anche contenere plasmidi (elementi genetici accessori) e granuli di materiale da accumulo in condizioni di abbondanza. Sono spesso presenti granuli di glicogeno, di polifosfati (il fosfato è solubile e poco abbondante nell’ambiente; serve per produrre molecole come nucleotidi e fosfolipidi e per fosforilare) e di β-idrossibutirrato (acido grasso a catena breve, fonte di carbonio).

Membrana plasmatica

Dal punto di vista strutturale è una membrana con struttura trilaminare, ossia costituita, come quella eucariotica, da un doppio strato fosfolipidico. I fosfolipidi costituenti espongono la porzione idrofila verso l’ambiente acquoso, mentre le code idrofobe si fronteggiano verso l’interno. La membrana plasmatica batterica contiene anche proteine, sia del tipo a tutto spessore, sia che sporgono solo da un lato.

La membrana ha una funzione di barriera idrofobica, che impedisce l’entrata o l’uscita di soluti e proteine all’interno o all’esterno della cellula. È tuttavia permeabile ad alcuni oggetti. Il doppio strato fosfolipidico è permeabile a: sostanze lipofile, gas e acqua. Il doppio strato fosfolipidico è impermeabile a: ioni e molecole cariche o polari.

A costituire la membrana partecipano anche steroli: i batteri solitamente non contengono colesterolo, bensì strutture molto simili, dette opanoidi, che hanno la stessa funzione del colesterolo. La membrana plasmatica nei batteri è l’unico sistema di compartimentazione presente, nonché l’unico sistema membranoso. Dal punto di vista funzionale, questo comporta che la membrana deve svolgere tutte quelle funzioni che nelle cellule eucariotiche sono espletate da organuli specifici.

• Trasporto: la membrana contiene trasportatori (o permeasi) che funzionano in modo unidirezionale (uniporto) o bidirezionale (simporto o antiporto)
• Produzione di energia: la membrana contiene gli enzimi del metabolismo energetico (quelli che nella cellula eucariotica sono incastonati nelle membrane del mitocondrio). La membrana plasmatica dei batteri è la sede in cui viene prodotta energia e dove essa si accumula sotto forma di gradiente, ossia differenza di potenziale elettrico tra interno ed esterno della membrana (che rappresenta il dielettrico). L’energia qui accumulata viene utilizzata dalla cellula batterica per varie funzioni: movimento, sintesi di ATP (tramite l’utilizzo di ATP sintetasi) ecc.
• Secrezione di proteine: nella cellula eucariotica esiste un apparato apposito per la secrezione delle proteine, costituito dal reticolo endoplasmatico ruvido e dall’apparato di Golgi, assenti nella cellula batterica. Nei batteri, quindi, questa funzione è espletata dalla membrana. Esistono vari sistemi di secrezione delle proteine, alcuni dei quali sono bersagli di farmaci antibiotici. Ad esempio, il sistema generale o SEC è costituito da varie subunità proteiche (SEC A, B, Y ecc.): si tratta di proteine che servono a secernere altre proteine. Le varie subunità riconoscono le proteine citoplasmatiche che devono essere secrete, le quali vengono trasportate verso la membrana (mantenute nello stato non ripiegato da SEC B), associate ad un trasportatore (con dispendio energetico) e trasportate all’esterno, dove assumeranno la loro conformazione. Esistono anche altri sistemi attraverso cui, ad esempio, i batteri riescono ad iniettare in una cellula bersaglio proteine solubili tramite una “siringa molecolare” (iniectosoma), struttura costituita a sua volta da proteine. In questo modo, il batterio dialoga con o danneggia la cellula ospite: infatti, queste proteine modificano la funzionalità della cellula a vantaggio del batterio, arrivando talvolta a trasformare la cellula bersaglio in una cellula tumorale. L’iniectosoma è formato da tante proteine che mettono in comunicazione il citoplasma batterico con il citoplasma della cellula eucariotica: presenta quindi un sistema di ancoraggio, attraverso cui si fissa sulla superficie della membrana della cellula bersaglio, e un sistema di iniezione nel citoplasma.
• Sintesi della parete batterica: la membrana contiene gli enzimi necessari per la costruzione della parete cellulare
• Percezione dei parametri ambientali: la membrana contiene gli “organi di senso” dei batteri, che gli permettono di percepire e potersi adattare ai parametri ambientali per sopravvivere:
  • Temperatura
  • pH
  • Presenza di sostanze tossiche (ad esempio, ioni metallici)
  • Controllo osmotico (variazioni di osmolarità)
  • Presenza di sostanze nutritizie
  • Variazioni di ossigeno atmosferico (composizione dell’atmosfera)
  • Densità della popolazione batterica: in base a questa, i batteri decidono di agire in maniera coordinata in un modo o in un altro, tramite un fenomeno denominato quorum sensi. Cioè, quando sono in tanti, esprimono i fattori di aggressività che risvegliano il nostro sistema immunitario, quando sono in pochi non li esprimono.

I batteri hanno sviluppato, per percepire queste variazioni ambientali, diversi sistemi, che hanno come componenti delle proteine di membrana. Solitamente questi sistemi, che sfociano in una trasduzione del segnale, constano di due componenti proteiche: una si trova a livello della membrana e ha due domini, uno interno e uno esterno. Quello esterno riconosce il segnale ambientale, quello interno permette la trasduzione del segnale. Ciò che accade è che il sensore percepisce il segnale proveniente dall’esterno e lo riconosce; questo determina una modificazione allosterica del sensore, che ha come conseguenza l’attivazione della funzione enzimatica che si trova nella porzione enzimatica del sensore. Si attiva quindi la capacità chinasi della proteina, che fosforila se stessa. Il gruppo fosfato viene poi passato ad una proteina citoplasmatica solubile, detta regolatore della risposta. Essa viene quindi fosforilata dal sensore, si modifica e si lega a livello di una sequenza regolativa del DNA, che promuove l’attivazione o la repressione di certi geni.

Parete cellulare (cell wall)

Nel corso dell’evoluzione, si sono definiti almeno tre tipi diversi di organizzazione della parete cellulare batterica. Quella più antica, ma tutt’ora esistente, è una parete costituita da più foglietti concentrici di un polimero rigido, detto peptidoglicano. Tutta la cellula risulta...