Microbiologia - batteriologia

MICROBIOLOGIA (04/10/2006) prof. Galdiero Capoluogo Maria Carmela

Quarta lezione: “Batteriologia”

La volta scorsa abbiamo parlato dei costituenti della parete cellulare dei Gram positivi e Gram negativi. Vi ho

indicato che l’ LPS, con il Lipide A, KDO, leptosio, il Core e poi la parte specifica, ci possono essere vari

mutanti a partire da quello semplice, che tiene semplicemente il Lipide A con qualche molecola di KDO e di

mutanti RN, e poi fino ad arrivare ai mutanti che abbiamo detto essere quelli patogeni. Questa l’abbiamo vista

sotto una forma diversa, sono le proteine maggiori di membrana, che come dimeri vanno a formare le porine. A

parte le porine, altre proteine che si possono trovare nella membrana esterna dei Gram negativi, ma in piccole

quantità, quindi non facenti parte delle proteine maggiori di membrana, sono quelle che vengono indicate in

questa tabella, con peso molecolare indicato qua, con gene che ne determina la qualificazione e con le funzioni

che hanno. Vedete che hanno funzioni di fissare ferro, di trasporto praticamente del ferro, vitamina B12,

maltosio, nucleotidi, ecc…. Alcuni si comportano anche come recettori per i batteriofagi (o fagi, i virus dei

batteri).

Prima di passare a quello che si trova al di sotto della parete, la membrana citoplasmatica dei batteri, dove

diremo poche cose (le differenze rispetto alle membrane degli eucarioti), vi accenno qualche altra cosa per

quanto riguarda il peptidoglicano (la parete propria dei procarioti).

Il peptidoglicano si trova in quasi tutti i batteri e specialmente in quelli che noi studiamo e in quelli che

interessano la Microbiologia Medica. C’è un gruppo di batteri che o non ha, addirittura, la parete cellulare,

oppure ha una parete cellulare che ha uno schema di struttura simile al peptidoglicano, ma non è della stessa

composizione del peptidoglicano. Mi spiego meglio!

Ci sono dei batteri, che fanno parte oggi di un gruppo a parte: gli archeabacteri che, al posto dell’acido

muranico, hanno un acido uronico che è derivato dal talosio, che è un altro zucchero, diverso, raro, che si trova

solo in questi microrganismi, sotto forma di N-acetil-talosiouronoco: quindi ha l’acido uronico al posto

dell’acido muranico che viene a mancare; è un peptidoglicano che alterna N-acetilglucosammina e questo acido

uronico invece che acido muramico, con delle catene peptidiche che possono essere un poco diverse nel

contenuto in amminoacidi e che vanno ad avvolgere questo gruppo di microrganismi, che non sono dei veri

batteri (eubacteri). Quelli che studiamo noi, patogeni per l’uomo, sono gli eubacteri, questi fanno parte degli

archeabacteri.

Appartengono a questa famiglia degli archeabacteri: i demimetanogenici, quelli che producono metano,

praticamente, che sono dell’ambiente; ce ne sono alcuni del tipo Sulfo Locus, che sono presenti nella Solfatara di

Pozzuoli, vivendo ad elevate temperature (batteri Termofili, per la maggior parte); batteri che vivono in ambienti

estremi (Estremofili) e i così detti Alobacteri, che sono quelli che vivono e si sviluppano solamente in presenza

di elevata pressione osmotica. Ci sono dei batteri così detti: Alofili, quindi alobacteri, alobacterium salinarium,

per esempio, che si sviluppa solamente in terreni con una concentrazione molare 5-10 volte quella normale, sono

germi capaci di svilupparsi in quegli ambienti come mari e laghi a salinità elevate. Se si abbassa la pressione

osmotica, vanno incontro a rigonfiamento e a lisi, quindi vanno incontro a morte (questi sono gli alofili

obbligati). Ci sono dei batteri alofili facoltativi, cioè che possono svilupparsi oppure no, in presenza di una

concentrazione maggiore di sali. Tra questi ve ne sono alcuni che interessano la patologia umana, per esempio

gli Stafilococchi, lo Stafilococco aureo, quello patogeno è un germe alofilo, che si può sviluppare anche in

presenza di una concentrazione maggiore di sali nell’ambiente. Questo ha la sua importanza nella conservazione

dei cibi per salatura: quando si fanno le marmellate con il glucosio, ad esempio, si può usare anche il sale per

sottrarre acqua e ridurre l’acqua libera, che è necessaria per lo sviluppo della vita, quindi per lo sviluppo dei

microrganismi. Ci sono batteri che hanno un peptidoglicano diverso da quello che studiamo negli eubacteri, che

però non sono patogeni per l’uomo, che si trovano ampiamente diffusi nell’ambiente e hanno enorme importanza

in alcune nicchie ecologiche. Poi ci sono dei batteri che vengono considerati batteri e che non hanno proprio la

parete cellulare (un poco impropria la loro attribuzione batterica), hanno solo la membrana: sono i micoplasmi.

I micoplasmi, li studierete nel testo, sono dei patogeni in alcune condizioni (condizionati).

Oggi hanno una certa importanza perché si trovano specialmente nelle vie uro-genitali, sia maschili che

femminili, e danno luogo a delle distrofie della mucosa fastidiose, in punti dove in genere non si trovano batteri,

non si trovano virus come agenti eziologici di queste manifestazioni infiammatorie (molto lievi), e poi se andate

a fare la ricerca (oggi si può fare molto facilmente rispetto a prima perché si riesce a riprodurre l’ambiente di

crescita dei germi) si fanno crescere su terreni di coltura “particolari” perché, non avendo la parete, vanno

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rapidamente incontro a lisi se non sono protetti opportunamente. I micoplasmi, oltre ad avere questa

caratteristica di non avere il peptidoglicano, hanno nella loro membrana citoplasmatica (simile a quella delle

cellule eucaristiche), il colesterolo, invece i batteri (gli eubacteri) non hanno nella membrana citoplasmatica il

colesterolo. Il colesterolo nel corso dell’evoluzione compare nelle cellule più evolute. Da qui l’ipotesi che i

micoplasmi dei parassiti che hanno perso le caratteristiche dei procarioti, e si avviano verso le cellule

eucariotiche. In tutte le cellule eucariotiche trovate il colesterolo, nelle cellule procariotiche non trovate il

colesterolo. Questa è un’altra delle differenze che si elenca quando si fa la distinzione tra cellule eucariotiche e

procariotiche. Questa differenza, inizialmente, non veniva considerata, mentre oggi si, perché ora si sa che il

colesterolo, in effetti, manca nei batteri. Il colesterolo ha la funzione di dare una certa rigidità allo scheletro

lipidico della membrana citoplasmatica, rigidità che è valida ed è ottimale per le funzioni delle cellule

eucariotiche, entro certi limiti: l’esagerazione di colesterolo crea certi problemi, la diminuzione ne crea degli

altri. Quindi il colesterolo, non è che va eliminato completamente. Il colesterolo deve essere presente in certe

concentrazioni, che sono quelle ottimali per la funzionalità delle membrane citoplasmatiche.

La membrana classica ha gruppi idrofilici e gruppi idrofobici, che si affrontano (la solita forchetta), e le proteine

(quelle transmembrana, che sono interne, e quelle esterne). La membrana viene raffigurata oggi come un mare di

lipidi dove galleggiano delle piattaforme (dovute alle proteine), c’è un rapporto ottimale tra lipidi e proteine.

Quello che è importante, è che generalmente certi fosfolipidi delle cellule eucariotiche contengono la lecitina

(praticamente la fosfatidilcolina) come fosfolipide più abbondante, invece, i batteri contengono fosfatidil-etano-

lammina, e non la fostatidilcolina, questa è una differenza importante. Gli acidi grassi dei fosfolipidi delle cellule

eucariotiche sono generalmente monoinsaturi, o raramente con due insaturazioni. L’acido più importante è

l’acido oleico, è l’acido elaidinico. L’acido oleico, specialmente, (sapete tutti il problema della dieta

mediterranea, ricca in acido oleico), è quello che si trova nei fosfolipidi di membrana delle cellule eucariotiche.

Nei batteri troviamo, generalmente, acidi grassi saturi, e non insaturi, e mentre nelle cellule eucariotiche non

sono mai ramificati, nelle cellule batteriche sono anche ramificati: quindi sono ramificati saturi e, generalmente,

tendono anche a ciclizzare. La loro catena carboniosa forma delle strutture cicliche che sono alla base dei

ciclopropani. La struttura disordinata, che in molti dipende dalla temperatura di transizione è quella che, rispetto

a quella ordinata, dà una fluidità maggiore alla membrana, il che permette una maggiore velocità di traslazione

delle frazioni proteiche immerse nella membrana. Le proteine di membrana (quelle che avete visto prima), si

muovono lungo questo piano, e la loro possibilità di spostamento dipende dalla rigidità o fluidità di questa parte

lipidica. Fra poco vi dirò dove funzionano l’LPS, le porine, ma più o meno è quello del meccanismo generale di

stimolazione dei recettori. Alcuni tipi di recettori si debbono aggregare, o mimetizzare per lo meno, per poter

trasmettere il segnale, poi, all’interno della cellula. Quindi la fluidità di membrana, un optimum di fluidità di

membrana è fondamentale per permettere ai recettori di aggregarsi e creare la cascata di eventi, che porta alla

trasmissione del segnale dalla membrana citoplasmatica al nucleo. Se questo non avviene la cellula risponde di

meno agli stimoli. Ecco l’importanza di queste strutture, della presenza dei vari tipi di acidi grassi, nel dare

strutture più o meno fluide. Poiché la temperatura di transizione dipende dal numero di doppi legami che ci sono

(diinsaturi, monoinsaturi), dipende inoltre, anche da se sono o non sono strutture ramificate.

Quella rigidità che noi notiamo maggiore nella membrana citoplasmatica dei procarioti probabilmente la

spieghiamo perché, mentre la cellula eucariotica fa parte di un organismo superiore, dove è protetta da

un’organizzazione per tessuti, organi, sistemi, (arriva il sangue, arriva la linfa), e ogni cellula è avvolta da

membrana in interconnessione con le altre, la cellula batterica si trova isolata nell’ambiente, e quindi, risente

della temperatura ambientale, delle condizioni ambientali, molto di più della cellula eucariotica, che è protetta

nel ricevere gli stimoli. Ci sono tutta una serie di barriere, di membrane nei batteri che necessitano di maggiori

protezioni: basta pensare ai nutrienti, che negli organismi superiori, arrivano attraverso il canale alimentare

(assorbimento di prodotti della scissione di queste macromolecole, che arrivano ad essere sintetizzate di nuovo

nelle singole cellule, per formare strutture di un certo tipo secondo lo schema della specie a cui si appartiene).

Nei batteri tutto questo non c’è, perché si possono trovare nei più diversi ambienti, esposti a diverse temperature

(non tutti gli ambienti presentano la stessa temperatura). Allora loro debbono adeguarsi, mediante la possibilità

di avere una membrana, più o meno rigida a seconda delle condizioni ambientali. Questo adattamento alle

condizioni ambientali avviene, per buona parte, attraverso la costituzione di quelli che sono gli acidi grassi dei

fosfolipidi della membrana citoplasmatica (non la membrana esterna dei Gram negativi). Qua vi vengono

indicate le modificazioni che subisce una membrana quando vi è un doppio legami, quando vi sono più doppi

legami. La membrana subisce delle modifiche strutturali, che ne favoriscono, più o meno, la fluidità. Sapete che

quando voi trovate una struttura di questo genere (fosfolipidi con tutti gli acidi grassi saturi), si parla di cristalli

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liquidi, che furono messi in evidenza da Louis Pasteur negli omogenati di colture di microrganismi, di cellule, di

quello che era, ma comunque di origine vitale. Questa possibilità dell’orientamento della luce, di questo aspetto

simil cristallino, per Pasteur era all’origine della vita.

Agli inizi del ‘900, fine ‘800, si ritenevano i cristalli liquidi, come probabili precursori della cellula, e quindi

dell’origine della vita. Erano molto studiati, anche a Napoli, (nella nostra università, con un busto a lui dedicato)

c’era un anatomo-patologo austriaco che fondò l’anatomia patologica - Ottorn Crom - e si occupò,

prevalentemente, di cristalli liquidi. Poi i cristalli liquidi, come argomento di studio, sono tramontati per molti

anni, per essere ripresi negli ultimi venti anni, specialmente recentemente, perché hanno anche delle applicazioni

industriali, che sono state messe in evidenza in tante altre situazioni, non costituiti solo da lipidi, ma anche da

molti altri tipi di molecole. Cristallo liquido, significa, in effetti, che ha una struttura rigida. E per quanto

riguarda la luce è capace di dirigerla sempre, in un senso o nell’altro, a seconda degli assi che attraversano il

fascio luminoso. I Cristalli liquidi sono quelli, che solo in certe condizioni, sono capaci di orientare la luce,

altrimenti non l’orientano (se si trovano in una situazione caotica). Se si dispongono, invece, come in questa

situazione (uno sull’altro) rigida, ci saranno, per lo meno due direzioni per far ruotare la luce polarizzata. Se la

disposizione è caotica, non c’è una distribuzione regolare. Qui c’è un accenno ad una distribuzione regolare.

Quando avremo occasione di parlare dell’architettura virale, vi farò notare come, a livello della struttura di un

virus c’è molto che riguardi ad una struttura cristallina. E quindi, poiché i virus, in effetti, sono del materiale

genetico, avvolto da proteine, che hanno tutte le caratteristiche di entità che possono trasmettere l’informazione,

ma non possono mantenersi, di per sè, se non hanno il supporto di una cellula, essi sono al limite, tra quelle

strutture che sono alla base della vita. Ecco, quindi, le analogie tra la materia che si organizza in cristalli, poi si

organizza in cristalli che hanno capacità di trasferire le proprie informazioni. Anche il cristallo è capace di

orientare la formazione di altri cristalli, quando si trova nel mezzo dove nasce. Se non nasce un nucleo

cristallino, la cristallizzazione non avviene. Ci vuole un nucleo, e poi questo si propaga rapidamente. Quindi, la

formazione di un cristallo è un evento raro e eccezionale. Ma una volta che si è formato, riesce a riempire tutto

l’ambiente circostante, tutto il contorno. I virus sono diversi, perché, hanno la stessa architettura, la stessa

struttura, però hanno delle informazioni che riescono a trasferire, quando entrano in una cellula. E quindi, poi, si

arriva alla cellula totale che è capace di fare quello che fa.

• Come agiscono queste strutture periferiche dei batteri, che abbiamo studiato, nell’interagire con la membrana

delle cellule degli ospiti?

Le membrane interessate sono, generalmente, quelle delle cellule del sangue circolante, perché in un’infezione

sistemica è presente sempre una fase in cui il microrganismo si trova nel sangue circolante. Nel sangue circolante

sono presenti i globuli bianchi (i linfociti , i monociti e i granulociti) quindi l’interazione sarà con le cellule

linfocitarie, monocitarie e granulocitarie. Ognuno di questi, sapete, si comporta in un certo modo, ha certe

funzioni, ecc…. Poi il sangue circolante, logicamente, ha a che fare con l’endotelio che riveste la parete dei vasi

(l’endotelio è molto importane per tutto quello che è capace di produrre). Quando non passa in circolo e rimane

localizzato, il germe ha a che fare con le cellule del sito che ha invaso, e quindi reagirà con le membrane che si

trovano lì. Il processo ad uno stimolo esterno, detto infiammazione, fa intervenire, localmente, una quantità di

cellule che sono quelle del sangue circolante (tra monociti, che si trasformano in fagociti, quando arrivano sul

posto, ecc…). Quindi ci sono tutte queste cellule che sono capaci di interagire con queste strutture di superficie

(perché il germe è rivestito). Quando si trova nell’ospite sensibile, si trova nelle condizioni migliori di habitat,

quindi sintetizza tutti i fattori che gli sono propri. E inoltre, oggi si sa (prima non si sapeva), che in vivo,

nell’ospite sensibile sintetizzano una serie di fattori di virulenza che non è possibile mettere in evidenza in

nessun modo se non in vivo: è molto difficile poterli seguire, perché dal momento che lo prelevate, lo portate in

un terreno di coltura per verificare se vengono liberate determinate tossine, sintetizzate determinate molecole

ecc…, il germe perde la capacità di virulenza, il gene si inattiva e quindi non le sintetizza più. Quando sta in vivo

le sintetizza. Di conseguenza il comportamento in vivo (e oggi ci sono dei modelli sperimentali per studiarli in

vivo) è diverso da quello che noi possiamo studiare in vitro.

• Qual è il meccanismo con cui queste strutture interagiscono con le cellule?

Generalmente si tratta di interagire o con gruppo recettoriali specifici o in modo aspecifico con la parte

lipoproteica della membrana. I gruppi recettoriali specifici, per esempio, sono stati messi in evidenza per l’LPS,

il lipopolisaccaride. Per il lipopolisaccaride sono stati messi in evidenza diversi gruppi recettoriali, di cui i più

impotanti sono i CD14 e i Tall receptor. I recettori Tall sono stati messi in evidenza, prima nei moscerini, poi si

è visto che sono distribuiti universalmente. Nell’uomo ve ne sono oltre dieci (10-11), ognuno di questi recettori è

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capace di legare una serie di sostanze chimiche, specialmente di origine microbica (batteri Gram positivi, batteri

Gram negativi, miceti, protozoi), per poi trasmettere il segnale all’interno. Il lipopolisaccaride, generalmente

attacca il recettore Tall4, e qualche volta il Tall2, ma è il Tall4 il recettore dell’LPS. Il lipopolisaccaride, come vi

ho detto, si trova, generalmente, sulla superficie batterica. Con la lisi dei batteri passa in circolo. Se la lisi

avviene in altro sito, viene riassorbito e passa in circolo. Inoltre se il germe è in ottime condizioni significa che

ne sintetizza più del normale di parete esterna, quindi una parte si libera nell’ambiente. E quindi, si trova questo

LPS legato alle proteine di membrana (specialmente alle porine), che trova una proteina, che si trova nel fegato,

capace di legare l’LPS e di trasferirlo a CD14.

CD14 sulla superficie della cellula è capace di interagire con il recettore Tall4 e formare quell’aggregato, (ecco

l’importanza della fluidità di membrana), che poi va a stimolare quei sistemi enzimatici, che sono delle

proteinchinasi (le tirosin-proteinchinasi). Ne esistono vari tipi: a livello della membrana, al livello del

citoplasma, dal quale passano alla membrana, quando essa riceve lo stimolo. Attraverso questa serie di

fosforilazioni a cascata, a partire dal recettore che viene stimolato, fino ad arrivare a quelli che sono i fattori di

trascrizione, tra cui nel campo batterico è molto importante LSKB, che è la chiave di volta per la stimolazione

dell’acido nucleico a sintetizzare quelle che noi chiamiamo citochine (specialmente nel sangue circolante:

linfociti, monociti e granulociti) che poi vengono liberate nel sangue circolante, localmente, nelle varie zone, nei

vari organi e tessuti. Le citochine sono diverse, vengono indicate con dei numeri e delle sigle varie. Quelle

importanti sono quelle che si distinguono in due grandi gruppi: le proinfiammatorie e le proimmunitarie, cioè

quelle che servono per innescare una risposta infiammatoria e quelle che servono per innescare una reazione

immunitaria. Per esempio nella reazione infiammatoria il TL6 il TNSά, vi è l’interleuchina1, mentre le

proimmunitarie sono l’interleuchina2, interleuchina4, l’interferone gamma, che vanno ad agire tutte in un certo

modo. Poi vi sono anche altri interferoni alfa e beta, quindi tutta una serie di prodotti di questo genere. Se la

produzione è nei limiti, voi avete un processo infiammatorio che è di difesa dell’organismo ospite, che può

essere localizzato o generale, ma comunque l’infiammazione è un processo di difesa. La produzione può variare,

anche per la presenza di vari stimoli, non solo da LPS, ma anche dalle porine, dalle proteine, dalle lipoproteine,

dal peptidoglicano, che trovano tutti recettori specifici. Il peptidoglicano, per esempio stimola il Tall3, e quindi

vi sono altre stimolazioni. Le lipoporine, più che come dei recettori, sembra che agiscano fissandosi a quei

particolari domini che si trovano nella membrana degli eucarioti, che sono ricchi in fosfolipidi e colesterolo.

Colesterolo e fosfolipidi, non è che sono distribuiti uniformemente nella membrana degli eucarioti, ma vanno a

formare dei domini che sono ricchi in colesterolo e sfingomielina, per esempio (quindi fosfolipidi particolari), e

quindi sono altamente idrofile: favoriscono l’aggregazione di quelle proteine prevalentemente idrofobiche, come

sono le porine, con delle proteinchinasi che sono anche loro a dissociazione prevalentemente idrofobica , quale

per esempio le SRC, le GTPasi, le PKC, le PKA, le Jac, sono tutte una serie di attività enzimatiche, che vengono

attivate in vario modo e trasmettono l’attivazione alle MAP-chinasi e poi da queste ai fattori di trascrizione, di

cui i più importanti sono quelli che vi ho citato, ma ne esistono degli altri. Quindi se la stimolazione è elevata

vengono interessate più vie di trasmissione del segnale.

Allora voi avete, per esempio, un’abbondante produzione di Interleuchina6 (il fattore di TNSalfa) e se questa

sarà abbondante sarà all’origine di quello che è lo shock da endotossina (oppure di shock tossici in genere). Di

conseguenza, quei prodotti che, in quantità ottimali, servono a proteggere l’ospite, in quantità eccessive

danneggiano l’ospite stesso. Vi ho parlato delle cellule del sangue circolante, ma vi ho anche parlato

dell’endotelio dei vasi. L’endotelio dei vasi è un’altra cellula molto sensibile che risponde agli stimoli che

arrivano dal sangue e provengono dal mondo esterno. Come rispondono? Posseggono anche loro delle

interleuchine di vario tipo, ma di meno delle cellule del sangue. Ma quello che presentano però in quantità

abbondante quando vengono stimolate sono quelle molecole di adesione, che vengono poi espresse in superficie,

tra cui le selectine (La selectinaE, per esempio), che sono molecole di adesione, in modo particolare, per le

piastrine. Allora le piastrine aderiscono all’endotelio, formano dei coaguli, avete la formazione di trombi. La

sintomatologia della setticemia da Gram negativi (anche da Gram positivi, ma prevalentemente da Gram

negativi) nei neonati, per esempio,è la coagulazione intravasale diffusa, formandosi coaguli in tutti i piccoli vasi.

Nello Shock endotossico da Gram negativi, nelle settici neonatali, ma anche in bambini più grandicelli avviene la

disseminazione intravasale di coaguli dovuta all’attivazione di questo endotelio, che blocca le piastrine, le

aggrega, e quindi si formano i coaguli, di conseguenza l’individuo va in contro a morte, perché arrivato in questa

fase lo shock è irreversibile. Lo shock viene determinato da varie cose: c’è lo shock da ipotensione, da perdita di

sangue, ci sono gli shock da sostanze tossiche, da endotossine. In tutti questi casi c’è periodo in cui è ancora

reversibile e in seguito c’è la fase irreversibile. Quando avete avuto la coagulazione intravasale, non c’è più

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