Microbiologia generale e speciale

MICROBIOLOGIA

INTRODUZIONE

La microbiologia è quella parte della Biologia che ha come oggetto di studio i microrganismi, ossia

forme di vita microscopiche non visibili ad occhio nudo, che rivestono un’importanza biologica

fondamentale nei cicli di trasformazione della materia.

I microrganismi sono le prime forme di vita comparse sulla Terra, circa 3,5 miliardi di anni fa: per

circa 2 miliardi di anni i microrganismi procarioti hanno rappresentato l’unica forma di vita sulla

Terra, fino alla comparsa dei primi eucarioti, avvenuta 1.3 miliardi di anni fa. Essi sono tuttora la

forma di vita più diffusa sul nostro pianeta, popolando anche zone e ambienti che sono sfavorevoli

per gli organismi pluricellulari.

Vengono inoltre impiegati dall’uomo in molte attività da migliaia di anni: si fa infatti uso di

microorganismi per la produzione di pane, alcolici, formaggi ed inoltre sono impiegati nelle

biotecnologie e nelle opere di biorisanamento per il ripristino della stabilità ambientale e

l’eliminazione di sostanze tossiche e inquinanti.

Tuttavia buona parte dei microrganismi è anche causa di patologia: essi sono implicati

nell’insorgenza non solo di malattie infettive, ma anche di tumori e di malattie infiammatoria. In

particolare, poiché sono caratterizzati dalla capacità di evolvere continuamente, essi sono in grado di

adottare strategie che permettono loro di superare gli approcci terapeutici messi in atto dall’uomo: si

parla infatti ora di malattie infettive riemergenti (tubercolosi), di malattie causate da patogeni

multiresistenti MDR (multi drug resitant pathogens), di malattie emergenti nuove ad eziologia

prevalentemente virale.

I microrganismi oggetti di studio della Microbiologia sono:

Procarioti: organismi molto semplici senza organuli con un unico cromosoma circolare immerso nel

citoplasma, a cui si aggiunge materiale genetico extracromosomiale contenuto nei plasmidi.

Presentano ribosomi 70S. La cellula è rivestita esternamente da una parete cellulare rigida (assente

in Mycoplasma) che conferisce alla cellua rigidità e resistenza: da essa originano organi di motilità e

sessili, ossia pili e flagelli. (Dimensione: 0.1-10 μm)

Eucarioti: presentano un grado di complessità notevolmente maggiore rispetto ai procarioti;

presentano infatti un corredo cromosomico diploide, strutture cellulari compartimentalizzate

(organuli) e una membrana cellulare simile a quella delle cellule umane. I ribosomi sono del tipo

80S.

Funghi o Miceti: organismi eucarioti caratterizzati dalla presenza di parete cellulare e mancanza di

motilità. Possono essere sia unicellulari sia organizzati in strutture pluricellulari filamentose; soltanto

poche specie sono agenti patogeni per l’uomo. Alcuni esempi sono candida albicans e i dermatofiti,

tra cui epidermophyton, microsporum, tricophyton. (Dimensione: 4-10 μm)

Protozoi: gruppo eterogeneo di microrganismi eucarioti con caratteristiche tipiche delle cellule

animali e mancanza di parete cellulari. Sono classificabili in protozoi propriamente detti,

unicellulari, e in metazoi, pluricellulari (nematodi). Il classico esempio è dato dagli sporozoi della

famiglia plasmodium, causa della malaria.

La Microbiologia include inoltre lo studio dei seguenti microrganismi:

organismi pluricellulari come gli elminti;

virus, particelle infettanti contenenti un genoma (Dimensione: 0.03-0.3 μm);

prioni, particelle infettanti che non possiedono genoma.

La branca della Microbiologia che si occupa dello studio dei microrganismi (virus, batteri, parassiti e

miceti) capaci di provocare malattie nell’uomo è la Microbiologia Medica. Tali microrganismi

hanno infatti un ruolo molto importante nella patologia in quanto sono causa di:

patologie infettive: infezioni respiratorie, AIDS, TBC, malaria, epatite…

tumori: molte forme di cancro sono associate a virus (epatite Be C, HPV, EBV) e a batteri

(Helicobacter Pylorii)

malattie scatenate dall’azione di più microbi (sclerosi multipla, aterosclerosi, diabete mellito

giovanile, artrite reumatoide, asma bronchiale).

I PRIONI

Con il termine prioni si definiscono agenti patogeni di natura esclusivamente proteica, delle

dimensioni di 100nm, provvisti di capacità infettante che sono responsabili di una serie di

encefalopatie degenerative dell’uomo e di alcuni animali, la cui trasmissibilità è stata provata sia in

condizioni sperimentali sia in vivo. Tali agenti patogeni hanno le caratteristiche di non possedere un

genoma, di non evocare alcuna risposta di tipo immunitario, di non poter essere coltivati in

laboratorio e soprattutto di essere resistenti a calore, disinfettanti e radiazioni.

I prioni sono in particolare isoforme patologiche di proteine normali che hanno origine primigenia

nella presenza di mutazioni nel gene codificatore e che si accumulano nelle cellule, neuronali

soprattutto, danneggiandole irreversibilmente. Un’altra caratteristica peculiare di questi agenti

patogeni è il fatto che l’inoculazione di un tessuto contenente prioni è in grado di indurre la

comparsa della malattia in soggetti normali.

La prima encefalopatia spongiforme di cui è stata documentata l’infettività è stata una patologia

animale, la scrapie, che si manifesta nelle greggi di pecore con atassia, tremori, prurito (da cui il

nome della malattia) e che è caratterizzata da lesioni degenerative del SNC, con presenza di vacuoli

nei dendriti neuronali.

Sul finire degli anni ’50 l’attenzione si spostò sulla kuru, una patologia caratterizzata da atassia

cerebellare e da alternazioni neurodegenerative del SNC che si manifestava in una popolazione

indigena della Papua Nuova Guinea: tale malattia aveva un carattere endemico-epidemico a causa

della trasmissione orizzontale dell’agente eziologico durante pratiche di cannibalismo rituale.

Forme di encefalopatia spongiforme trasmissibili presenti in tutto il mondo furono scoperte e

dimostrate negli stessi anni:

Sindrome di Creutzfeld-Jakob: demenza presenile con declino delle capacità motorie e cognitive e

rapida involuzione letale. La malattia è sporadica nel 90% dei casi, mentre risulta familiare nel 10%

dei casi, con trasmissione autosomica dominante.

GSS: atassia cerebellare familiare con accumulo nel tessuto nervoso di placche amiloidotiche.

Insonnia familiare fatale: consistente presenza di lesioni talamiche.

Negli anni ‘80-’90 fu dimostrato che la trasmissione delle encefalopatie spongiformi è possibile

per via interumana e interanimale, ma anche per via animale-uomo. Il caso più eclatante fu la

trasmissione all’uomo della BSE, l’encefalopatia spongiforme bovina: essa ha avuto origine nel 1986

in Gran Bretagna e si ritiene che il prione di BSE abbia avuto origine da quello della scrapie. Il salto

di specie, con la conseguente infezione esogena dell’uomo per via alimentare, sarebbe stato possibile

in seguito all’utilizzo di farine proteiche nei mangimi per il bestiame non più private del grasso

animale mediante solventi a base di petrolio. A partire dal 1995 fu documentata in Francia, Irlanda e

Gran Bretagna la comparsa di una nuova encefalopatia spongiforme, detta nuova Creutzfeld.Jakob

CJ-nv, caratterizzata da sintomi psichiatrici, placche amiloidotiche e morte entro 38 mesi

dall’infezione. È comunemente considerato che la CJ.nv sia conseguenza di una infezione esogena

contratta per via alimentare a seguito dall’assunzione di cibo proveniente da bovini affetti da BSE.

Eziologia e patogenesi delle malattie da prioni

Negli anni ’80 si è ottenuta la dimostrazione che la trasmissibilità della patologia coincide con una

SC

proteina parzialmente glicosilata, formata da 253 aa e del peso di 33-35 kDa, denominata PrP ,

proteina prionica, che è caratterizzata da una forte analogia strutturale con una proteina endogena dei

mammiferi, codificata da un gene in singola copia, espressa sulla superficie delle cellule nervose e a

C

funzione sconosciuta, chiamata PrP : le due proteine differiscono solo per il fatto che mentre la

proteina endogena è ricca in segmenti α elica, quella mutata è ricca in sequenze β foglietto ed è

inoltre resistente all’azione degli enzimi proteolitici.

La trasmissibilità dei prioni e quindi della corrispondente malattia è un fenomeno che richiede la

cooperazione della PrP normale codificata dall’organismo ospite con quella patologica esogena:

C

animali knock-out privi del gene per PrP sono resistenti alla malattia. In particolare, non è la PrP

esogena a moltiplicarsi e a determinare l’insorgenza della malattia, bensì la trasformazione della PrP

endogena nella forma mutata per interazione con quella esogena: i prioni che si ritrovano negli

C

animali infettati sono il risultato di una modificazione post-traduzionale delle molecole di PrP

dell’organismo ospite per azione dei prioni esogeni.

I prioni esogeni, infatti, hanno la capacità di impedire l’assunzione della corretta conformazione da

C

parte di PrP , favorendo la formazione di ampie sequenze β foglietto e quindi la transizione nella

SC

forma PrP . Dopo un periodo di incubazione sufficiente all’accumulo di quantità di PrP mutata

sufficienti ad indurre danni irreversibili compaiono nell’ospite i sintomi morbosi e i tessuti

contengono abbastanza prioni da poterli trasmettere ad un altro organismo.

Nelle encefalopatie spongiformi a carattere familiare, invece, il processo patogenetico è correlato

C

ad una mutazione sul gene che codifica per PrP .

Nelle forme sporadiche o idiopatiche, infine, si ammette che sia la casuale formazione di una PrP

endogena non corretta a scatenare l’insorgenza della malattia.

Un possibile fattore di aumentata predisposizione alla comparsa delle encefalopatie spongiformi è

individuabile nel polimorfismo in posizione 129 del gene PrP, dove è presente o una valina o una

metionina. Le persone omozigoti Val/Val e Met/Met presentano una maggiore possibilità di

insorgenza della malattia.

Diagnosi e Tarapia

La diagnosi è in genere clinica e il paziente presenta un progressivo e acuto declino delle funzioni

cognitive e motorie.

Al momento non esiono terapie valide e non si ha notizia di guarigioni spontanee della patologia.

Non esistono inoltre efficaci strumenti che possano ridurre il rischio di trasmissione iatrogena della

patologia (trasfusioni, trapianti…)

LA CELLULA BATTERICA

La cellula batterica è una cellula procariotica, delle dimensione di 1-3 μm, la cui forma può essere

ricondotta o alla sfera o al clindro: i batteri di forma sferica sono detti cocchi, quelli di forma

cilindrica bacilli. I batteri cilindrici molto corti sono detti cocco-bacilli; quelli con le estremità

affusolate sono detti bacilli fusiformi e quelli con una o più curvature vibrioni e spirilli.

Le singole cellule che si producono in un certo numero di generazioni mantengono uno stretto

rapporto di continuità dando origine a caratteristici raggruppamenti: diplococchi quando i batteri

sono uniti due a due, stafilococco se si hanno ammassi irregolari e streptococchi se si raggruppano in

catenelle.

Il carattere citologico più notevole della cellula batterica è rappresentato dalla sua architettura

estremamente essenziale, caratterizzata dall’assenza di compartimenti intracellulari separati da

membrane. Essa è fondamentalmente costituita da una struttura cromosomica semplice immersa

direttamente nel citoplasma, che è delimitato verso l’esterno da una membrana citoplasmatica dalla

quale si dipartono una serie di invaginazioni chiamate mesosomi. Il tutto è quindi racchiuso in un

contenitore rigido, la parete cellulare, alla cui superficie si trova spesso uno strato polisaccaridico

denominato capsula. In alcune specie la cellula è provvista di sottili appendici libere cotituite dai

flagelli e dai pili.

Genoma Batterico: all’interno del citoplasma è possibile individuare materiale genetico

di diverso tipo. Si ha innanzitutto il cromosoma batterico, costituito da un unico

lunghissimo filamento di Dna senza estremi liberi, ossia con struttura circolare, con

eccezione delle Borelie e di alcune spirochete. Tale Dna non risulta essere complessato

ad istoni ed è legato bassamente ad alcune proteine acidiche.

Oltre al Dna cromosomiale è presente anche un Dna extracromosomiale, costituito dai

plasmidi, che sono piccole molecole circolari di Dna dotate di replicazione autonoma e

che molto spesso codificano per fattori di patogeneticità e resistenza agli antibiotici.

Infine è possibile la presenza di Dna di origine fagica.

Citoplasma: il citoplasma batterico è estremamente povero in dettagli morfologici.

Occasionalmente sono presenti granulazioni citoplasmatiche che hanno di norma il

significato di accumuli di materiali nutritivi di riserva.

Nel citoplasma sono presenti i ribosomi, di tipo 70S, formati da una subunità maggiore

50S e da una minore 30S, molto simili a quelli presenti nei cloroplasti e nei mitocondri

delle cellule eucariotiche.

Membrana cellulare: essa ripete fondamentalmente l’organizzazione della membrana

eucaristica e come questa è formata da lipidi e proteine. Essa tuttavia, data la mancanza

di organuli citoplasmatici, deve svolgere anche le funzioni che nella cellula sono svolte

da questi ultimi: trasporto di nutrienti e cataboliti attraverso la membrana;

fosforilazione ossidativa (specie aerobie);

riproduzione della cellula batterica;

sede di enzimi responsabili della sintesi della parete cellulare;

sede di proteine coinvolte in meccanismi di trasduzione del segnale per

funzioni di adattamento ambientale;

generazione di una differenza di potenziale transmembrana.

La membrana di alcuni batteri presenta, in corrispondenza di alcune zone, delle

invaginazioni che si approfondano nel citoplasma e possono assumere una struttura

complessa multistratificata: tali strutture, dette mesosomi, sono funzionali alla

replicazione cellulare ed ai processi di fosforilazione ossidativa.

Parete cellulare: una caratteristica della cellula batterica è quella di essere racchiusa in

un contenitore rigido al quale si dà il nome di parete cellulare o sacculo. In base alla sua

composizione, i batteri possono essere classificati in due grandi famiglie:

batteri Gram positivi: in seguito a colorazione di Gram appaiono colorati di violetto;

batteri Gram negativi: in seguito a colorazione di Gram appaiono colorati di rosso.

La colorazione di Gram è una colorazione differenziale in cui il preparato vien trattato

con soluzione di cristalvioletto; si allontana quindi il colorante e si mordenza la

colorazione mediante trattamento con liquido di Lugol (ioduro di potassio e iodio).

Si decolora quindi il preparato con acetone ed infine con un secondo colorante di

colore rosso.

Il componente fondamentale della parete cellulare è il peptidoglicano, che ne costituisce

il 90% nei batteri Gram + e il 10% circa nei Gram-. Esso è formato dalla ripetizione di

una unità strutturale assolutamente peculiare della cellula procariotica: tale unità

strutturale è formata da due carboidrati azotati, che sono la Nacetilglucosamina e l’acido

muramico, legati tra loro mediante un legame β1-4. Al gruppo carbossilico dell’acido

muramico è legato un tetra peptide i cui aminoacidi più frequenti sono nell’ordine L-

alanina, glutammato, L-lisina e D-alanina. Nel polimero di peptidoglicano l’acido

muramico di una unità è legato alla Nacetilglucosamina dell’unità successiva mediante

legame β1-4 portando alla formazione di lunghe macromolecole lineari.

I diversi polimeri lineari sono poi collegati trasversalmente tra di loro in corrispondenza

delle catene aminoacidi che laterali, mediante legami peptidici tra la D-alanina di un

tetrapeptide e la L-lisina del tetrapeptide adiacente o attraverso un ulteriore da un

pentapeptide di glicina.

L’insieme dei polimeri lineari collegati trasversalmente forma così una struttura rigida

che avvolge interamente la cellula batterica.

La sintesi del peptidoglicano avviene in parte nel citosol e in parte all’esterno della

cellula, direttamente a livello della parete: nel citoplasma si ha la sintesi delle molecole di

glucosamina e di acido muramico legato già al tetrapeptide, che presenta una D-alanina in

più; questi vengono trasportati a livello della membrana, dove un trasportatore permette

la formazione dell’unità strutturale e il suo traslocamento all’esterno della cellula; qui,

infine, si ha l’assemblaggio delle varie unità e la formazione di legami crociati

trasversali.

Nei Batteri Gram+ la membrana plasmatica è protetta da una parete cellulare molto

spessa, di circa 20-80 nm, che circonda e racchiude completamente il battterio: essa

risulta essere formata da numerosi strati di peptidoglicano con intersecate inori quantità

di altri polimeri, rappresentanti essenzialmente dagli acidi teicoici: essi sono alcoli

polivalenti esterificati con scido fosforico i quali costituiscono la componente antigenica

della parete cellulare di questi batteri. La spessa parete dei Gram + è una struttura

altamente polare che si oppone al passaggio di molecole idrofobiche in grado di

danneggiare la struttura della membrana plasmatica, mentre risulta permeabile alle

molecole idrofile. In virtù di queste caratteristiche, essa è in grado di legare grandi

quantità di catoini che hanno il compito di grarantire un ambiente ionico adeguato al

funzionamento degli enzimi presenti nella membrana citoplasmatica, in particolare quelli

preposti alla sintesi dello stesso peptidoglicano. La struttura rigida consente inoltre ai

batteri di vivere in ambiente ipotonico, prevenendo l’estensione eccessiva della

membrana cellulare per aumento del volume citoplasmatico. Il fatto che siano colorati in

violetto nella colorazione di Gram è dovuto alle caratteristiche idrofobiche che il

colorante (cristalvioletto), che è inizialmente idrofilo, assume in seguit