Microbiologia generale - Appunti

A+ T +G+C

Quando due organismi hanno lo stesso contenuto in G+C non significa necessariamente

che essi siano correlati, tuttavia se essi differiscono per più del 5% appartengono a specie

diverse.

CLASSIFICAZIONE NUMERICA: si basa sulla similarità generale valutata per confronto

di molti caratteri, a ciascuno dei quali è assegnato lo stesso “peso”. Il procedimento

comincia con una determinazione della presenza o dell’assenza di caratteri scelti nel

gruppo di organismi in esame. Per ottenere una classificazione accurata si dovrebbero

confrontare molti caratteri, almeno 50. Dopo l’analisi dei caratteri, per ogni coppia di

organismi appartenenti al gruppo si calcola un coefficiente di associazione, una funzione

che misura il grado di concordanza tra i caratteri posseduti. Il coefficiente di

corrispondenza semplice è la percentuale di caratteri che sono in corrispondenza

indipendentemente dalla presenza/assenza dell’attributo. Talvolta si calcola il coefficiente

di Jaccard, trascurando i caratteri che sono assenti in entrambi gli organismi. I coefficienti

di corrispondenza vengono poi raggruppati in modo da formare una matrice di similarità.

Gli organismi con elevati gradi di similarità vengono raggruppati tra loro e separati da

quelli dissimili; questi gruppi di organismi sono detti fenoni. I risultati dell’analisi vengono

spesso riassunti e rappresentati graficamente con un diagramma detto dendogramma.

Ogni punto di ramificazione corrisponde al valore di similarità che mette in relazione i due

rami. Al di sotto del punto di ramificazione i due gruppi risultano essere un gruppo unico. 2

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ceppi con più del 90% di coefficiente di similarità sono considerati appartenenti alla stessa

specie.

CLASSIFICAZIONE MOLECOLARE: utilizza l’analisi molecolare di una qualsiasi delle

biolmol presenti nelle cell.

Ibridazione DNA:DNA: misura il grado di somiglianza di sequenza ed è utile per

differenziare microrganismi strettamente correlati. Il DNA isolato da un microrganismo è

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reso radioattivo P o H, frammentato, denaturato con il calore e mescolato con un

eccesso di DNA non marcato di un altro microrganismo. La soluzione viene poi raffreddata

per permettere la riassociazione. Il DNA a doppio filamento è separato da tutto il rimanente

DNA ; viene determinata la quantità di radioattività nel DNA ibridato che viene confrontata

≥

con il controllo, considerato come 100%. Valori di ibridazione 70% sono preferibili per

considerare due organismi appartenenti alla stessa specie, mentre valori di almeno 20-

30% sono richiesti per asserire che due organismi appartengono allo stesso genere.

Ribotyping: tecnica per l’identificazione batterica che valuta la risposta caratteristica che

si genera quando il DNA di un particolare MO è sottoposto a digestione con enzimi di

restrizione e i frammenti vengono separati e rintracciati con una sonda di rRNA. Poiché le

differenze nella sequenza degli rRNA di due organismi si traducono nella

presenza/assenza di specifici siti di taglio per gli enzimi di restrizione, il modello di

restrizione di una specie batt è unico.

Procedimento:

amplificazione con PCR della totalità del DNA

1. trattamento con uno o più enzimi di restrizione

2. separazione dei frammenti per elettroforesi

3. individuazione dei frammenti mediante una sonda marcata.

4.

CRONOMETRI MOLECOLARI: alcune macromol possono servire come orologi

dell’evoluzione, ossia come misura dei cambiamenti evolutivi. Poiché la sintesi proteica è

un processo molto antico, gli rRNA sono mol eccellenti per riconoscere relazioni evolutive

tra gli organismi viventi. Sono mol dotate della stessa funzione, presenti in tutti gli

organismi con una sequenza abbastanza conservata anche in organismi tra loro

filogeneticamente distanti. Inoltre, poiché il nr di possibili sequenze diverse è molto alto,

l’omologia tra due sequenze è sempre indice di una qualche relazione filogenetica. È il

grado di omologia tra le sequenze di rRNA di due organismi che indica la loro relazione

evolutiva. Il più usato è l’RNA 16S, perché è sufficientemente grande da contenere

sequenze altamente conservate, tuttavia è abbastanza piccolo da essere maneggevole in

lab.

PCR: reazione a catena della polimerasi. Ricostruisce in vitro uno specifico passaggio

della riproduzione cellulare: la ricostituzione (sintesi) di un segmento di DNA "completo" (a

doppia elica) a partire da un filamento a singola elica. Il filamento mancante viene

ricostruito a partire da una serie di nucleotidi che vengono disposti nella corretta

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sequenza, complementare a quella del DNA interessato. Questo processo viene svolto in

natura da enzimi chiamati DNA-polimerasi, che sono in grado di sintetizzare

progressivamente un nuovo filamento di DNA nelle seguenti condizioni:

devono essere disponibili i nucleotidi da polimerizzare, sotto forma di

• desossiribonucleotidi trifosfati (dNTP).

il DNA deve essere denaturato.

• il segmento da ricostruire può essere soltanto prolungato, ovvero non è possibile

• sintetizzare un nuovo filamento a partire da zero.

devono inoltre essere rispettate opportune condizioni di temperatura, pH, ecc.

•

È possibile quindi ricostruire le condizioni che portano alla formazione dei nuovi segmenti

di DNA, ponendo in soluzione:

una quantità, anche minima, del segmento di DNA che si desidera riprodurre;

• una quantità opportuna di nucleotidi liberi per costituire i nuovi filamenti;

• opportuni "inneschi", detti primer, costituiti da brevi sequenze di DNA

• (oligonucleotidi) complementari agli estremi 5’ e 3’ del segmento da riprodurre;

una DNA polimerasi termo-resistente

• un Buffer che serve a mantenere il pH stabile (tampone) e necessario per costituire

• l'ambiente adatto alla reazione;

altri elementi di supporto (ad es. ioni magnesio) indispensabili per il corretto

• funzionamento della DNA polimerasi;

acqua per portare a volume la soluzione.

•

Per avviare la reazione della polimerasi (fase di prolungamento del filamento a partire dal

primer 5’) è prima necessario provvedere alla separazione dei filamenti del DNA (fase di

denaturazione), quindi alla creazione del legame tra i primer e le regioni loro

complementari dei filamenti di DNA denaturati (fase di annealing). Questo processo risulta

però incompatibile con la DNA polimerasi umana, che viene distrutta alle temperature

necessarie alla denaturazione (96-99°C).

Per ovviare a questo inconveniente si fa ricorso alle polimerasi appartenenti a organismi

termofili che non sono inattivate dalle alte temperature, ad esempio la Taq polimerasi

proveniente dal batterio termofilo Thermophilus aquaticus. Ciò consente di realizzare più

cicli di PCR in sequenza, in ciascuno dei quali viene duplicato anche il DNA sintetizzato

nelle fasi precedenti, ottenendo una reazione a catena.

IL MANUALE DI BERGEY: è un compendio di informazioni di base e molecolari su tutte le

specie conosciute di procarioti. La prima edizione è basata essenzialmente su

caratteristiche fenetiche. Inoltre vengono evidenziate le differenze tra Gram+, Gram- e

micoplasmi. La seconda edizione, in 5 volumi, riporta molti concetti emersi tramite il

sequenziamento dell’rRNA.

Domande:

Quali tecniche utilizzò Carl Woese per stabilire l’esistenza dei 3 regni

 96

Qual è la differenza tra tassonomia classica e molecolare?

 A cosa serve il manuale di Bergey?

 Teoria endosimbiontica.



ANTIBIOTICI :

AGENTI ANTIMICROBICI: un agente antimicrobico è un composto chimico, naturale o di

sintesi, che uccide i MO (= battercida, fungicida, virocida) o ne inibisce la crescita (=

batteriostatico, fungistatico, virostatico). Gli agenti antimicrobici sono molti diversi per

quanto riguarda la tossicità selettiva: alcuni agiscono in maniera poco selettiva,quindi

agiscono su più tipi cell, mentre altri sono molto più

selettivi. Agenti dotati di tossicità selettiva sono molto

importanti nella trp delle malattie infettive, in quanto

uccidono i MO patogeni senza danneggiare l’ospite.

Gli agenti batteriostatici sono inibitori della sintesi

proteica e agiscono legandosi ai ribosomi attraverso

legami molto deboli; quando la concentrazione

dell’agente batteriostatico diminuisce, i ribosomi si

liberano dell’inibitore e la crescita può riprendere. Gli

agenti battericidi, invece, provocano la morte della

cell senza causarne la lisi: sono una classe di

composti chimici che si legano in maniera

irreversibile ai loro bersagli cell e non vengono

rimossi per diluizione. Gli agenti batteriolitici

determinano la morte della cell provocandone la lisi,

effetto che si riflette in una diminuzione del nr delle cell.

Misura dell’attività antimicrobica: l’attività

antimicrobica si misura determinando la concentrazione più bassa del composto in esame

necessaria per inibire la crescita di un dato organismo; questo valore viene detto minima

concentrazione inibente (MIC). Per determinare la MIC viene allestita una serie di

provette, ciascuna contenente un terreno di coltura con una diversa concentrazione

dell’agente antimicrobico da saggiare. Tutte le provette vengono inoculate e dopo

l’incubazione vengono controllate per la presenza di una crescita visibile (torbidità):

l’assenza di torbidità denota un’inibizione completa della crescita microbica. Quindi la MIC

è la concentrazione più bassa che inibisce completamente la crescita di un dato

organismo. È possibile in questo modo confrontare agenti antimicrobici diversi e

determinare quale sia il più efficace contro un dato MO.

Un altro sistema per studiare l’azione antimicrobica è il metodo della diffusione in agar:

viene allestita una piastra Petri contenente un terreno agarizzato in cui è stato inoculato il

MO test. Quantità note dell’agente antimicrobico sono adsorbite su dischetti di carta da

filtro che vengono poi depositati sulla superficie del terreno agarizzato. Dopo

l’incubazione, il composto diffonde dal filtro dell’agar creando un gradiente di contrazione:

quanto più ci si allontana dal dischetto, tanto minore sarà la sua concentrazione. Al di là

del punto di MIC ci sarà crescita confluente, mentre nella zona più vicina al dischetto la

crescita sarà assente. La zona in cui non si ha crescita è detta alone di inibizione e il suo

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diametro sarà proporzionale alla quantità di agente antimicrobico presente sul filtro e alla

sua efficacia intrinseca.

Antisettici: composti chimici che possono pro