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(DAP), che è presente nei Gram-neg e in alcuni pos. Alcuni aa invece non sono mai

presenti nel ponte: aa a catena ramificata, aa aromatici, aa con zolfo, istidina, arginina e

prolina.

In base alla colorazione di Gram, i batteri possono essere suddivisi in Gram- neg e Gram -

pos in relazione alla differenze strutturali della parete stessa. Nella colorazione di Gram si

forma un complesso insolubile di cristal-violetto: nei Gram-neg viene estratto dall’alcol,

mentre ciò non avviene nei Gram-pos, a causa dello spessore della parete (il

peptidoglicano si disidrata a contatto con l’alcol). Lo strato di peptidoglicano nei Gram-neg

è troppo sottile per impedire l’ingresso del solvente all’interno della cell.

GRAM-POS : colorazione rossa.

 La loro parete cell è composta da:

Membrana plasmatica

o Spazio periplasmatico = è riempito dal periplasma, ma non ha molte proteine

o periplasmatiche. In quest’area vengono secreti enzimi che restano in situ.

Ampio strato di peptidoglicano = rappresenta più del 90% della parete e si

o può trovare fino a 25 strati su un batterio. I legami crociati sono costituiti da

un ponte peptidico, in cui il numero di legami crociati varia da un organismo

all’altro. Ad es in Staphylococcus aureus ogni ponte è costituito da 5

molecole di glicina collegate tra loro da legami peptidici. Inoltre molti Gram-

pos possiedono dei polisaccaridi acidi, detti acidi teicoici contengono residui

di glicerofosfato e ribitolfosfato. Alcuni di questi acidi contengono glicerolo e

sono strettamente legati ai lipidi di membrana, per questo vengono chiamati

acidi lipoteicoici. 19

GRAM-NEG : colorazione blu.

 La parete è composta da:

Membrana plasmatica

o Spazio periplasmatico = 20-40% del volume della cell, contiene

o moltissime proteine che sono impiegate nei processi di assorbimento di

nutrienti (= enzimi idrolitici) e anche enzimi coinvolti nella sintesi del

peptidoglicano.

Piccolo strato di peptidoglicano = circa il 10 % della parete. In questo caso vi

o è un legame diretto tra il gruppo aminico dell’acido diaminopimelico (DAM) e

la D-alanina.

Membrana esterna

o

La parete degli Archaea: il costituente principale delle pareti degli Archaea è lo

pseudopeptidoglicano (resistente al lisozima), che è formato da unità ripetute di NAM e

NAG; questo si differenzia per il tipo di legame glicosidico, che in questo caso è legame β-

1,3, anziché β-1,4. Inoltre le pareti cell di alcuni Archaea possono essere composte solo

da polisaccaridi, glicoproteine o proteine. In ogni caso, il più comune tipo di parete è lo

strato paracristallino (S-layer), formato da proteine e glicoproteine a simmetria esagonale.

Dal momento che delimita la cell, è probabile che lo strato S funga da barriera di

permeabilità, permettendo il passaggio di mol a basso pm. Inoltre nei batt patogeni

conferisce protezione contro i meccanismi di difesa dell’ospite.

20

Mycoplasmi: poiché mancano di parete cell, la loro membrana è lipoproteica trilaminare e

ricca di steroli, caso unico fra le cellule batteriche. Essendo privi di peptidoglicano

abbisognano di steroli che danno una consistenza rigida alla membrana senza la quale

essa avrebbe una consistenza fluida inadatta a mantenere il volume della cellula costante

e sensibile agli shock osmotici. Per l'assenza di parete cellulare, i micoplasmi non

subiscono l'azione di antibiotici come i beta-lattamici (che inibiscono appunto la sintesi di

parete) e non possono essere classificati secondo la colorazione di Gram.

Sintesi del peptidoglicano: quando la cell aumenta di dimensioni, prima che si divida in

due, è necessaria la sintesi di nuovo materiale parietale da aggiungere a quello già

preesistente. Le autolisine presenti nel divisoma, provocano piccole fessure nella struttura

macromol della parete, a partire dall’anello formato dalle proteine FtsZ. Il materiale di

nuova sintesi è aggiunto attraverso queste aperture. Sulla superficie cell dei batt Gram+ la

giunzione tra il peptidoglicano preesistente e quello di nuova sintesi forma un rilievo simile

a una cicatrice. Durante la crescita cell, la sintesi di nuovo peptidoglicano comporta la

rottura controllata di quello già preesistente; in questo processo è coinvolto il

bactoprenolo, una mol con funzione di trasporto, fortemente idrofobica, che porta legato

un precursore peptidoglicano. La sua funzione è quella di rendere gli intermedi

polisaccaridici idrofobici da poter attraversare la membrana.

Reazione di transepeptidazione: si tratta della tappa finale della sintesi del

peptidoglicano. È costituito dalla formazione di legami peptidici crociati tra residui di acido

muramico delle catene adiacenti di peptidoglicano. Questa reazione rappresenta il

bersaglio inibito dalla penicillina. L’antibiotico si lega alle proteine FtsZ, inibendo la loro

attività catalitica; questo impedisce la sintesi di nuova parete. Nei Gram- il legame crociato

avviene tra l’acido diaminopimelico (DAP) di un peptide e la D-alanina del peptide

adiacente, mentre nei Gram+ i legami si verificano attraverso ponti pentaglicinici fra L-

lisina di un peptide e la D-alanina di quello adiacente.

Protoplasto: il peptidoglicano può essere distrutto attraverso il lisozima, una proteina che

β

rompe il legame -1,4 tra N-acetiglucosamina e acido N-acetilmuramico. Poiché la

struttura ne risulta indebolita, l’acqua può entrar nella cell, facendola rigonfiare e poi

scoppiarelisi. Il protoplasto è un batterio che ha perso la parete cell. Se i protoplasti

stabilizzati in una soluzione isotonica di saccarosio, vengono trasferiti in acqua, allora si

verifica la lisi. Oltre ai mycoplasmi, in natura si trova Thermoplasma, un gruppo di Archea

senza parete.

MEMBRANA ESTERNA: presente solo nei Gram-neg, è costituita da:

• lipoproteina di Brann , unita al peptidoglicano della parete cell tramite legami

covalenti. Costituisce la metà interna della membrana; svolge funzioni di

ancoraggio tra la membrana e il peptidoglicano.

• lipopolisaccaride (LPS) contiene lipidi, polisaccaridi e proteine. Costituisce la metà

esterna della membrana. Una porzione lipidica di LPS è detta lipide A, che non è

costituita da glicerolipidi. Una particolare porzione del lipide A è chiamata

endotossina e determina la tossicità dei batteri (es Salmonella, Shigella..). Molti

21

batteri non patogeni mostrano una qual certa attività endotossina dovuta da LPS;

ciò dimostra che questo non è il solo responsabile della patogenicità dei batteri

stessi.

La membrana esterna è parzialmente permeabile a piccole mol; ciò avviene grazie alle

porine, le quali svolgono la funzione di canali, permettendo l’entrata e l’uscita di sostanze

idrofiliche a basso PM. Le porine sono proteine transmembranarie associate a formare

pori di circa 1nm di diametro, le quali oltre a permettere il passaggio di determinate

sostanze, impediscono la fuoriuscita di enzimi che sono localizzati nel periplasma.

Questo spazio, situato tra la superficie esterna della membrana citoplasmatica e la

superficie esterna della membrana esterna ha consistenza gelatinosa, dovuta

all’abbondante presenza di proteine, tra cui

• enzimi idrolitici = avviano la degradazione delle molecole nutritive

• proteine di legame = innescano i processi di trasporto di substrati

• chemiocettori = coinvolti nella risp chemio tattica

STRUTTURE DI SUPERFICIE:

Glicocalice: tappeto di zuccheri che costituisce un mantello di carboidrati deposto

all’esterno della cell. È formato da glicoproteine e glicolipidi; le glicoproteine sono legate a

catene saccaridi che attraverso un legame covalente. I glicolipidi possono formare zattere

che hanno funzione informazionale tipizzazione di ciascun tipo cell. I recettori possono

anche essere proteine glicosilate proteine modificate tramite glicosilazione, processo che

avviene dopo la sintesi proteica.

Varia nei diversi organismi, in quanto può essere uno strato spesso o sottile; gli strati rigidi

sono organizzati come una fitta matrice che non permette il passaggio di particelle, come

l’inchiostro di china in questo caso la struttura viene definita capsula. Se invece il

glicocalice è di tipo deformabile, quindi non permette il passaggio di particelle e quindi è

più difficile da visualizzare strato mucoso.

Capsula: formata da polisaccaridi, conferisce notevoli vantaggi:

• rende il batterio più resistente alla fagocitosi da parte dell’ospite.

• contiene una grande quantità di acqua, proteggendo il batterio dalla disidratazione.

• Impedisce l’ingresso di virus batterici e di sostanze tossiche idrofobiche, ad es i

detergenti.

Fimbrie: più corte e più numerose rispetto ai flagelli, sono comunque di natura proteica.

Sono formate da subunità proteiche e sono organizzate in una struttura elicoidale. Si

presume che permettano ai microrganismi di aderire a superfici come i tessuti animali, se

questi sono batt patogeni, oppure di formare pellicole sulle superfici.

22

Pili: strutture simili alle fimbrie, ma più lunghe. Sono determinati geneticamente da fattori

sessuali e da plasmidi coniugativi e sono coinvolti nel processo di coniugazione

Flagelli: molti procarioti sono dotati di mobilità, capacità che dipende dalla presenza

dei flagelli, anche se alcuni proc hanno la capacità di muoversi solo per scivolamento.

I flagelli sono appendici cell lunghe e sottili, la cui morfologia varia al variare

dell’organismo. Quindi la loro disposizione può essere:

• Polare : attaccati a uno o entrambi i poli della cell

• Lofotrica : un ciuffo di flagelli è posizionato a un’estremità

• Peritrica : i flagelli si orginiano da numerosi punti della superficie della cell.

I flagelli hanno una forma piuttosto elicoidale, quindi quando vengono appiattiti

mostrano una lunghezza d’onda che è costante per ogni specie. Il filamento dei

flagelli è costituito da numerose subunità della proteina flagellina; la forma e la

lunghezza sono determinate dalla struttura della flagellina e dalla direzione di

rotazione del filamento. La regione basale del flagello è composta da una regione più

ampia, chiamata uncino, formata da un singolo tipo di proteina e con la funzione di

connettere il filamento alla porzione del motore del flagello. Il motore flagellare è

formato da una piccola regione bastoncellare centrale che passa attraverso un

sistema di anelli: nei Gram-neg la coppia esterna di anelli è ancorata allo strato

lipopolisaccaridico e al peptidoglicano della parete, mentre la coppia più interna è

localizzata nella membrana citoplasmatica. Nei batt Gram-pos è presente solo la coppia

più interna.

Movimento flagellare: i flagelli ruotano attorno al punto d’attacco con una velocità di

rivoluzione pari a quella conferita dal movimento flagellare di cell libere di muoversi un

ambiente acquatico. Il movimento rotatorio è impartito corpo basale e l’energia richiesta

per la rotazione deriva dalla forza proton-motrice, che determina la velocità stessa di

rotazione (che quindi non è sempre costante). Il movimento è una componente importante

che permette ai batteri di sfruttare nuove risorse e di interagire in maniera positiva con

altre cell; infatti i mixobatteri, che si muovo per scivolamento, hanno uno stile di vita

sociale e cooperativo.

Motilità per scivolamento: i batteri privi di flagelli hanno la capacità di muoversi su una

superficie solida attraverso un processo di scivolamento. I batteri che sfruttano questa

modalità di movimento sono filamentosi o bastoncellari.

Nei Cianobatteri questo tipo di movimento è accompagnato dalla secrezione di una

sostanza mucosa (slime) di natura polisaccaridica, che ha il compito di aderire sulla

superficie spingendo in avanti il batterio. 23

In Flavobacterium johnsoniae il movimento è indotto dal movimento di proteine di

superficie, le quali sospingono al cell secondo un meccanismo a ruota dentata in quanto

ancorate alla membrana citoplasmatica.

RISPOSTE COMPORTAMENTALI: I proc spesso incontrano gradienti chimici e fisici, in

risp ai quali i batteri possono muoversi in modo positivo o negativo, avvicinandosi o

allontanandosi dagli stimoli. Questi movimenti direzionali sono detti tassie.

Chemiotassi: in assenza di un gradiente, le cell di E.coli, per es, si muovono seguendo

una modalità casuale, che include:

• Avanzamento = se cell nuota in avanti in modo lineare

• Capovolgimento = se la cell si ferma e piroetta

Dopo il capovolgimento la direzione dell’avanzamento successivo è di nuovo casuale.

Tuttavia, se è presente un gradiente chimico di una sostanza attraente, i movimenti

diventano orientati gli avanzamenti diventano più lunghi e i capovolgimenti meno

frequenti.

Il movimento in avanti avviene quando il motore del flagello si muove in direzione

antioraria; quando ruota in senso orario il fascio di flagelli si apre, il movimento di

avanzamento cessa e la cell si capovolge. 24

Tuttavia, alcuni batt con flagello polare come Rhodobacter sphaeroides, hanno un flagello

unidirezionale che gira solo in direzione oraria, quindi per poter cambiare direzione queste

cell devono interrompere il movimento del flagello. Durante il periodo in cui il flagello è

fermo la cell cambia direzione attraverso moti browniani.

Fototassi: processo secondo cui molti microrganismi si muovo verso la luce. Il vantaggio

della fototassi consiste nel permettere a un microrganismo fototrofo di orientarsi per

migliorare il processo fotosintetico.

Alcuni batt, invece si muovono secondo scotofobotassisi muovono casualmente al di fuori

del campo illuminato da un microscopio verso il buio; l’ingresso nel buio si ripercuote

negativamente sullo stato energetico della cell e le segnala di capovolgersi, per rientrare

nella zona illuminata.

ORGANELLI PRESENTI SOLO NEGLI EUCARIOTI:

Citoscheletro: formato da una rete proteica che conferisce resistenza ed elasticità. è

cosituito da 4 componenti non visibili al m.ottico.

Microfilamenti: sottili filamenti proteici costituiti da actina. Si trovano dispersi nel

citoplasma e formano una rete densa sotto la membrana cell.

25

Funzioni:

Ancorano il citoscheletro alle proteine strutturali di membrana. Questa funzione

 serve per stabilizzare la posizione delle proteine di membrana e conferisce

un’ulteriore resistenza meccanica alla cell.

Interagiscono con i filamenti spessi costituiti da miosina, per produrre movimenti

 attivi della cell.

Filamenti intermedi: la loro composizione varia da un citotipo ad un altro. Es:

neurofilamenti (nei nueroni) sono resp della stabilità strutturale degli assoni.

Funzioni:

Forniscono resistenza

 Stabilizzano al posizione degli organuli

 Trasportano materiale nel citoplasma

Filamenti spessi: formati da miosina. Sono numerosi, soprattutto nelle cell muscolari,

dove interagiscono con i filamenti di actina determinano la contrazione.

Microtubuli: hanno un diametro di circa 24 nm. sono proteine a forma di tubo cavo, il cui

costituente principale è la tubulina. Un microtubulo si forma in seguito ad aggregazione di

un eterodimero di tubulina (proteine α e β) formato da 13 unità in una rotazione completa

di spirale. . Vicino al nucleo si trova il centrosoma, a partire dal quale i microtubuli si

irradiano verso la periferia.

Funzioni:

Sono la componente principale del citoscheletro, conferiscono rigidità e resistenza.

 Ancorano la maggior parte degli organuli

 Durante la divisione cell formano l’apparato fusiforme, che determina la

 distribuzione dei cromosomi che si sono duplicati ai poli opposti della cell.

Sono la componente strutturale di alcuni organuli, come i centrioli, le ciglia e i

 flagelli.

Microvilli: sono piccole proiezioni digitigormi. La loro funzione principale è quella di

assorbire liquido extracell, inoltre incrementano l’area di assorbimento. In ogni microvillo si

estende una rete di microfilamenti che lo ancora al citoscheletro. L’interazione tra i

microvilli e il citoscheletro provoca un moto ondulatorio che agevola il movimento di liquido

attorno ai microvilli.

Centrioli: strutture cilindriche composte da corti microtubuli, che sono disposti ad anello (9

gruppi di microtubuli, nessuno al centrodisposizione 9+0);ogni lato ha 3 microtubuli

26

associati tra loro. I tubuli adiacenti ad una tripletta hanno una parete in comune. Le cell

che vanno incontro a mitosi possiedono due centrioli, posi ad angolo retto. I centrioli

dirigono il movimento dei cromosomi, quindi le cell che non si dividono, come gli eritrociti,

non possiedono i centrioli. Il centrosoma è la quota di citoplasma che circonda la coppia di

centrioli.

Ciglia: sono costituite da nove coppie di microtubuli che ne circondano un paio posti al

centro separati da una guaina disposizione 9+2. La struttura centrale del ciglio è definita

assonema.

Nelle 9 doppiette, tra ogni microtubulo, è presente la dineina, una proteina che garantisce

il movimento del ciglio. Ognuna delle 9 doppiette ha in comune una parete formata da 2 o

3 eterodimeri. Le doppiette adiacenti sono connesse tra loro attraverso ponti proteici (=

nexine) e legati alla guaina da raggi di connessione. Il movimento del ciglio viene

propagato dallo scivolamento di doppiette adiacenti.

Le ciglia si ancorano al corpo basale posto sotto la superficie cell. La porzione libera del

ciglio è completamente ricoperta di membrana cell. Le ciglia battono ritmicamente e il loro

movimento sposta i liquidi e le secrezioni presenti sulla superficie. Se le ciglia sono

danneggiate (es per fumo di sigaretta) non possono battere e quindi sostanze irritanti

determinano l’insorgenza di infezioni respiratorie che possono cronicizzare.

Mitocondri: organuli dotati di doppio rivestimento membranoso. Una membrana esterna

circonda l’intero organulo mentre quella interna contiene numerose ripiegature dette

creste. Le creste incrementano la superficie esposta al liquido contenuto nei mitocondri,

detto matrice mitocondriale. La matrice è costituita da enzimi metabolici che catalizzano

reazioni chimiche per la produzione dell’energia necessaria al metabolismo cell. I

mitocondri producono ATP demolendo alcune sostanze organiche attraverso reazioni che

consumano ossigeno e producono CO .

2

I mitocondri sono in grado di mantenersi autonomamente, oltre che di controllare la loro

crescita e la loro riproduzione. Ovviamente l’aumento del numero di mitocondri determina

un aumento della loro capacità di produrre energia.

Nucleo: circondato da una membrana nucleare che lo separa dal citosol. La membrana è

una doppia membrana contenente un sottile spazio pericell, inoltre in diversi punti prende

contatto con il RER.

Il nucleo dirige i processi che avvengono nel citosol e riceve di conseguenza le

informazioni. Queste comunicazioni sono di natura chimica e avvengono tramite i pori

nucleari, un complesso proteico che regola il movimento delle macromol all’interno e

all’esterno del nucleo.

Il liquido contenuto nel nucleo è detto nucleoplasma e contiene ioni, enzimi, nucleotidi,

proteine, DNA e piccole quote di RNA. Inoltre contiene una rete di sottili filamenti, la

matrice nucleare, che fornisce un supporto strutturale oltre che essere coinvolta nella

regolazione delle attività genomiche. 27

Il nucleo contiene 23 coppie di cromosomi, metà di origine materna, metà paterna. Ogni

cromosoma è costituito di una singola doppia elica di DNA. La mol di DNA è complessata

a specifiche proteine basiche dette istoni e con un gruppo eterogeneo di proteine non

istoniche acide. Il complesso DNA + proteine è chiamato cromatina.

Esistono 5 classi di istoni, che cooperano nell’impacchettamento delle fibre di cromatina.

Due copie di ciascuno degli istoni H2A, H2B, H3, H4 costituiscono un ottamero intorno al

quale una doppia elica di DNA si avvolge ( nucleosoma). Dopo un breve segmento di

DNA spaziatore si trova un altro complesso dando alla cromatina un aspetto a collana di

perle. H1, invece, si lega all’estremità di ogni nucleosoma. In interfase i cromosomi sono

impacchettati formando una struttura detta solenoide.

Reticolo Endoplasmatico: rete di membrane intracell formato da tubi cavi, foglietti piatti e

camere rotonde dette cisterne.

Funzioni:

Sintesi di carboidrati, lipidi e proteine nelle zone dove sono presenti ribosomi. I

 prodotti vengono depositati nelle cisterne.

Deposito : il RE può conservare parte delle sostanze che vengono prodotte.

 Trasport o: alcune mol possono viaggiare da una parte all’altra del RE.

Ci sono due tipi di RE:

• RER : in sua prossimità si trova l’apparato di Golgi, che modifica le proteine

sintetizzate dal RER. La superficie esterna contiene ribosomi fissi che sintetizzano

proteine decodificando il segnale portato da un filamento di RNA. Man mano che la

catena polipeptidica cresce, entra nella cisterna del RER dove viene modificata. La

maggior parte delle proteine qui prodotte viene impacchettata in vescicole di

membrana dette vescicole di trasporto, che trasportano le proteine nel Golgi.

• SER : non sono associati ribosomi fissi. Sintetizza principalmente lipidi e carboidrati.

Inoltre conserva ioni Ca e rimuove le tossine dal citosol. Ha un’organizzazione

tubulare con andamento casuale.

Apparato Di Golgi: è costituito da una serie di membrane appiattite dette sacculi. Un

tipico Golgi contiene 5-6 sacculi, impilati gli uni sugli altri. Ha una posizone intermedia tra il

nucleo e la membrana plasmatica.

Funzioni:

Sintesi ed impacchettamento di prodotti secretori, come muco ed enzimi

 Impacchettamento di enzimi citosolici

 Rinnovo della membrana cell

 28

La comunicazione del Golgi col RER coinvolge la formazione, il movimento e la fusione di

vescicole.

Vescicole e secrezione: le vescicole arrivano nella porzione convessa del sacculo, detta

porzione cis o versante di formazione, dove si fonderanno con le membrane del Golgi,

svuotando il loro contenuto nelle cisterne. Nel Golgi le proteine vengono modificate

muovendosi da sacculo a sacculo tramite le vescicole di trasporto fino a raggiungere la

porzione trans o versante di maturazione, dove si formeranno le vescicole secretorie che

allontaneranno il prodotto finito dal Golgi.

Lisosomi: vescicole contenenti enzimi digestivi (= idrolasi acide) e originano a livello del

Golgi.

• L. primari : contengono enzimi inattivi; l’attivazione avviene tramite fusione con le

membrane di organuli danneggiati, come mitocondri o frammenti di RE.

• L. secondari : creati dalla fusione dei primi, contengono enzimi attivi, che degradano

il contenuto lisosomiale. Parte del materiale degradato viene internalizzato nella cell

per essere riciclato e gli scarti vengono espulsi per esocitosi.

Inoltre hanno anche un’azione di difesa contro le malattie. Alcune cell possono rimuovere

batteri o scorie circondandoli con la membrana ed internalizzandoli in vescicole, che si

fonderanno con i lisosomi. Gli enzimi digestivi li degraderanno, riciclando aa e carboidrati.

Nelle cell morte o danneggiate la regolazione lisosomiale viene a mancare, in quanto i

lisosomi si disintegrano lasciando liberi nel citosol gli enzimi attivi. Questi enzimi

distruggono le proteine gli organuli, per un fenomeno detto autolisi.

Perossisomi: più piccoli dei lisosomi, contengono enzimi diversi e originano a livello del

RER. Hanno il compito di assorbire e neutralizzare tossine, come l’alcool, che vengono

assorbite dal liquido extracell. inoltre intervengono nella demolizione degli acidi grassi. La

loro attività forma perossido di idrogeno, convertito poi in acqua. Sono abbondanti negli

epatociti, dove hanno il compito di eliminare le tossine che arrivano tramite il tratto

digerente.

Domande: Elencate le principali differenze tra procarioti ed eucarioti.

 Individuate bersagli terapeutici selettivi nella cellula procariotica.

 Quali sono gli elementi extracellulari dei batteri? Quali sono le loro funzioni per

 la cellula?

Descrivete la struttura dei flagelli nei Gram+ e nei Gram-

 Come si differenziano le specie batt in base alla distribuzione dei flagelli?.

 cosa servono le inclusioni citoplasmatiche?

 Quali sono le funzioni della membrana cellulare?

 29

Eterocisti e funzione

 Parete batterica: struttura e funzione

 Cosa sono le autolisine e perché sono importanti?

 Descrivi le funzioni del bactoprenolo.

 elementi extracell dei batteri e funzioni

MICROSCOPIA:

POTERE DI RISOLUZIONE: è la capacità di avere un’immagine distinta di 2 punti che

sono vicini. La risoluzione dipende dalla larghezza del cono di illuminazione e quindi sia

dal condensatore sia dall’obiettivo. 0,61l

=

d nsin θ

dove:

d = distanza minima tra due oggetti che consente di distinguerli come entità separate.

λ = lunghezza d’onda. La luce bianca è un insieme di colori diversi, che vanno dal blu al

rosso. La media totale di tutte le lunghezze è 0,53 µm. il potere di risoluzione più alto si

λ

ottiene con le radiazioni luminose che hanno più breve (450-500nm).

n = indice di rifrazione del mezzo che separa il campione dall’obiettivo (aria/olio

dimensione).

θ = metà dell’angolo del cono di raggi raccolti dall’obiettivo. Più le sezioni sono sottili, più

aumenta il potere di risoluzione. Con un m.ottico il potere di risoluzione è di 2µm. sotto a

1µm si usa il m. elettronico.

Al diminuire di d la risoluzione aumenta, consentendo l’identificazione di particolari più fini

del campione.

M.OTTICO IN CAMPO CHIARO(1-10 µm): il microscopio è formato da uno stativo di

supporto (corpo metallico) a sua volta formato da una base e da un braccio. La base

contiene una sorgente luminosa, che può consistere di uno specchio o più comunemente

una lampada. Il braccio porta due manopole per la messa a fuoco: una vite macrometrica,

per la messa a fuoco più grossolana e una vite micrometrica, per la messa a fuoco di

precisione. Il tavolino portaoggettori traslatore è posizionato a circa metà del braccio e

sostiene i vetrini da esaminare. Il condensatore, montato sotto il tavolino, focalizza sul

vetro un cono di luce. Sulla porzione inclinata del braccio si inseriscono una torretta

portaobiettivi e uno o più oculari. il portaobiettivo porta da 3 a 5 obiettivi, con lenti dal

diverso potere di ingrandimento e può essere ruotato per selezionare l’obiettivo

desiderato. L’ingrandimento totale del campione si ottiene moltiplicando l’ingrandimento

dell’obiettivo per quello dell’oculare. 30

M. OTTICO IN CAMPO SCURO : il sistema di illuminazione viene modificato in modo che

raggiunga il preparato solo lateralmente, quindi l’unica luce che raggiunge la lente è quella

dispersa dal campione appare chiaro in campo scuro. Questo microscopio ha una

risoluzione piuttosto elevata; per questo viene utilizzato per visualizzare la motilità di

microrganismi.

M. A FLUORESCENZA: si utilizza nel caso di campioni che emettono fluorescenza. Il

fenomeno si manifesta a causa della presenza nella cell di substrati fluorescenti, come la

clorofilla, oppure in seguito a trattamento con un colorante fluorescente. La luce

fluorescente è una radiazione emessa molto rapidamente da una mol eccitata, quando

questa rilascia l’energia catturata e ritorna a un livello energetico più stabile. La luce è

composta da una serie di radiazioni di lunghezza d’onda diverse tra loro; queste

lunghezze possono essere +/- lunghe, ma la cosa importante è che l’intensità delle luci sia

inversamente proporzionale alle loro lunghezze.

L’ultravioletto non fa parte della luce bianca, ma è molto importante nella m. a

λ

fluorescenza in quanto è una molto energetica. La fluorescenza è un fenomeno fisico

λ

visibile quando l’energia di una colpisce una mol dove vi sono atomi con orbite esterne

- -

libere di e . Le mol colpite vengono un po’ sconvolte perché l’e interessato viene spostato

nell’orbita + esterna. La luce che non viene usata a tale scopo ha una lunghezza d’onda

-

meno energetica e perciò è considerata un’energia rimessa. Dopo un certo tempo l’e

tende a tornare indietro decadenza della fluorescenza.

La sorgente si trova a lato del preparato ed è rappresentata da una lampada ad arco a

vapori di Hg, mentre la trasmissione del calore viene bloccata da uno speciale filtro per gli

infrarossi. Davanti alla lampada è posto un filtro in pasta di vetro, che filtra le varie

lunghezze prima che arrivino al campione. Si usa una luce monocromatica. La luce arriva

ad uno specchio, che la convoglia sul preparato per epilluminazione la luce arriva al

-

preparato e sposta gli e .

L’energia rimessa viene convogliata al secondo filtro che taglia via i segnali fluorescenti

non desiderati e lascia passare solo la lunghezza d’onda specifica, che arriva all’obiettivo.

Tutte le lenti del microscopio sono in quarzo, perché non hanno fluorescenza per non

turbare il preparato.

M. A CONTRASTO DI FASE: ha la capacità di migliorare le differenze di contrasto tra le

cell e il mezzo circostante, così da consentire la visualizzazione senza dover ricorrere alla

colorazione, quindi viene utilizzato soprattutto per l’osservazione di preparati a fresco. Si

basa sul principio secondo cui le cell hanno un indice di rifrazione diverso da quello del

mezzo circostante, quindi deviano parte dei raggi luminosi che le attraversano. La luce che

attraversa un campione con indice di rifrazione differente da quello del mezzo circostante

viene ritardata. Il condensatore di un microscopio a contrasto di fase è provvisto di un

diaframma anulare, cioè da un disco opaco con un sottile anello trasparente, che dà

origine ad un cono di luce cavo. Al passaggio del cono, alcuni raggi vengono deviati a

31

causa della delle variazioni di densità e di indice di rifrazione nel campione. La luce

focalizzata forma un’immagine chiara in campo scuro.

M. A CONTRASTO DI FASE INTERFERENZIALE: utilizza un polarizzatore per produrre

una luce polarizzata, la quale attraversa un prisma che genera due fasci distinti, i quali

entrano negli obiettivi una volta che hanno attraversato il preparato. A livello degli obiettivi i

due fasci si fondono in uno solo, ma a causa della piccola differenza nell’indice di

rifrazione delle sostanze attraverso le quali ciascuno di essi passa, non riescono a essere

totalmente in fase, creando un effetto di interferenza. Poiché vengono sottolineate le

piccole differenze esistenti sulle strutture cell, questo microscopio vi ene utilizzato su

preparati non colorati. Å

M.ELETTRONICO A TRASMISSIONE (600-700 ) = se si vuole aumentare il potere di

risoluzione, bisogna agire sulla lunghezza d’onda del microscopio. Per questo vengono

-

usati gli e . Il principio del funzionamento del m.elettronico è basato sulla possibilità di

accelerare particelle cariche negativamente, in modo da ottenere radiazioni a bassa

lunghezza d’onda. -

Questo microscopio viene alimentato da una corrente di 380V. La sorgente di e è un

-

filamento di tungsteno che viene portato a incandescenza. Il fascio di e viene deviato da

un campo elettromagnetico come un fascio luminoso è rifratto quando attraversa una

lente. Sono presenti delle pompe che creano un vuoto spinto lungo una colonna. In questo

-

modo gli e si muovono verso il condensatore creando un ambiente omogeneo. -

Il condensatore, formato dal campo elettromagnetico, convoglia il fascio di e sul

-

preparato. Il fascio di e tende a seguire una linea retta e ha una natura corpuscolare e

-

vibratoria come la luce. Gli e arrivano fino all’obiettivo, che è un’altra lente

-

elettromagnetica, ma se incontrano zone con metalli pesanti vengono respinti. Gli e danno

un’immagine +/- ingrandita in base al loro grado di accelerazione regolata dalla corrente.

L’immagine finale può essere registrata su lastra fotografica, oppure è visibile su uno

schermo fluorescente ( anche lui sottovuoto), coperto da sali di fosforo che diventano

- -

fluorescenti quando sono colpiti da e . Ci saranno zone chiare, dove gli e attraversano il

-

preparato e zone scure, dove gli e non passano. NB! il campione si trova su una rete di

nichel di 3mm.

M.ELETTRONICO A SCANSIONE = è utilizzato per studiare la superficie della cell, per

questo ha un potere di risoluzione inferiore al TEM, di 25nm. Il campione viene ricoperto

-

da un sottile strato di un metallo pesante. Un fascio di e diretto contro la superficie del

campione ne effettua la scansione con movimento regolare. Quindi il campione viene

-

esplorato da un fascio molto sottile di e primari , che viene focalizzato su una piccola area

-

e deflesso lungo traiettorie che formano un reticolo. Gli e secondari emersi dalla superficie

cell vengono raccolti da un rilevatore, che emette segnali che regolano l’intensità di un

-

fascio di e che colpisce uno schermo televisivo fornendo un’immagine ingrandita.

Schema di un SEM-EDX: gli elettroni emessi da un cannone, che utilizza un filamento di W o LaB ,

6

giungono al campione in esame dopo essere passati dapprima tra una serie di lenti

32

elettromagnetiche e quindi tra le bobine di deflessione che generano la scansione. I rivelatori

ricevono le varie emissioni energetiche generate dal campione.

FISH(= ibridizzazione fluorescente in situ): una sonda è un filamento di acido nucleico che può

essere marcato e impiegato per ibridarsi a un acido nucleico complementare. Le sonde possono

essere generiche o specifiche, nel caso di queste ultime è possibile costruire sonde in grado di

legarsi solo al genoma dei batteri.

La FISH viene utilizzata in ecologia microbica per rintracciare i microrganismi direttamente

nell’ambiente e in diagnosi clinica per velocizzare il riconoscimento di uno specifico patogeno

presente in un soggetto. In questo modo non è necessario far crescere il batterio in coltura, il

trattamento inizierà più velocemente.

ALLESTIMENTO DEL PREPARATO:

FISSAZIONE: processo atto a bloccare e stabilizzare la disposizione delle mol che compongono la

struttura della cell. Permette l’inattivazione di enzimi lisosomiali e deve consentire al preparato di

sopportare gli stress chimici e fisici a cui andrà incontro. La scelta del fissativo è in funzione della

natura dei costituenti chimici della cell che si vogliono osservare.

FISSATIVI AZIONE SUL SUBSTRATO RISULTATO

Aldeidi Fissano proteine e acidi Buona risoluzione

nucleici. No lipidi morfologica

Alcoli Disidratazione e rottura dei No buona risoluzione

ponti H. modificazione delle morfologica

strutture terziarie delle

proteine. Estrazione delle

componenti lipidiche.

Precipitanti le proteine Denaturazione delle Risoluzione morfologica inf

proteine alle aldeidi

Non fissazione non c’è nulla Blocco in situ con basse Risoluzione morfologica

che vada a reagire con le temperature. Ridotta perdita fortemente dipendente

singole mol delle cell di comp. Diffusibili per dall’esecuzione del

blocco congelamento.

immediatocromatografia,

disidratazione, inclusione

Fissazione chimica: può essere effettuata con:

• formaldeide (HCHO) = ha un elevato potere di penetrazione, ma non si fissa in

modo permanente. Si lega a proteine e acidi nucleici.

33

• Gluteraldeide = ha una lenta penetrazione, questo conferisce un’alta stabilità al

tessuto.

• OSO (tetrossido di osmio) = fissativo non coagulante. Ha una lenta penetrazione,

4

non forma cross-links con proteine e non macchia i carboidrati.

Fissazione fisica: le alte temperature non sono consigliabili in quanto denaturano acidi

nucleici e proteine. È preferibile utilizzare le basse temperature ricorrendo alla

criofissazione, che è un processo reversibile, temperatura – dipendente.

Vantaggi:

Blocco “quasi” istantaneo di tutte le strutture cell

 Mantenimento delle componenti solubili

 Minori alterazioni chimiche dei costituenti cell

Esistono vari metodi per fissare un preparato a basse temperature:

• Freeze-drying = serve per mantenere a bassa temperatura e sotto vuoto il

campione. Viene eliminato tutto il ghiaccio. Poi può essere infiltrato con paraffina. Il

campione viene congelato in N liquido a -196° C, ma prima viene posto in uno

speciale apparecchio, dove viene effettuata la disidratazione del pezzo congelato,

nel vuoto, a una temperatura di -40°Cper sublimazione dell’H O, che passa

2

direttamente dallo stato solido a quello gassoso non si verifica ricristallizzazione.

• Congelamento – sostituzione = si congela il pezzo e si mantiene tale a bassa

temperatura in un reattivo anidro che scoglie lentamente e si sostituisce ai cristalli

di ghiaccio. È molto importante che non si verifichi la vetrificazione dell’H O  H O si

2 2

solidifica allo stato amorfo formando cristalli di ghiaccio di forma cubica-esagonale.

• Cold metal block = il campione viene messo in esadecano, poi in un bagno di

Nliquido. l’esadecano è un ottimo conduttore per raffreddare velocemente il

campione.

Durante la fase di disidratazione del campione bisogna usare anche dei crioprotettori (es:

acetone), che diminuiscono l’accrescimento dei cristalli di ghiaccio. Possono essere:

• Penetranti = permeano le membrane cell sostituendosi parzialmente all’H O.

2

• Non penetranti = richiamano H O dall’interno della cell per differenza di pressione

2

osmotica.

COLORAZIONI:I coloranti hanno la funzione di migliorare il contrasto tra le cell osservate

e il mezzo ambiente per avere un’osservazione del preparato migliore possibile. I coloranti

sono composti organici con una determinata affinità per specifici composti cell, quindi

utilizzando coloranti specifici è possibile osservare determinate caratteristiche della cell.

I coloranti devono avere due caratteristiche fondamentali:

34

• Possiedono gruppi cromofori, ossia gruppi chimici con doppi legami coniugati che

conferiscono alla sostanza il colore

• Si legano alle cell attraverso legami ionici, covalenti o idrofobici.

In base alla natura dei loro gruppi dotati di carica elettrica, i coloranti si possono

suddividere in:

• Coloranti basici = blu di metilene, fucsina basica, cristal violetto… sono composti

cationici, in quanto portano gruppi carichi +, quindi si legheranno a mol con carica

negativa, come gli acidi nucleici e molte proteine e soprattutto alla superficie delle

cell batteriche.

• Coloranti acidi = eosina, rosa bengala, fucsina acida… sono coloranti anionici

perché contengono gruppi a carica negativa, come carbossili (-COOH) e ossidrili

fenolici (-OH). Quindi si legheranno a strutture cell con carica positiva.

Le colorazioni batteriche possono essere:

• Semplici = queste colorazioni si effettuano su preparati essiccati. Il preparato viene

ricoperto con uno strato di colorante per alcuni minuti, dopodiché viene risciacquato

per eliminare l’H O in eccesso. I coloranti normalmente usati per queste colorazioni

2

sono eosina, blu ti metilene, fucsina… Il vantaggio di questa colorazione sta nel

fatto che è molto semplice da eseguire.

• Differenziali = non colorano in maniera uguale tutte le cell. Le cell vengono trattate

con un cristal-violetto, che si lega a tutti i tipi cell. Dopodiché si effettuano un

lavaggio e un trattamento con iodio per fissare la colorazione. Le cell si presentano

tutte con una colorazione violacea, a questo punto si utilizza un decolorante (=

alcool), che rimuoverà il cristal-violetto solo da alcune cell. Le cell decolorate

saranno nuovamente colorate con un colorante a contrasto.

Tra le colorazioni differenziali:

• Colorazione di Gram = sulla base della quale si distinguono i batteri Gram-

pos e Gram-neg. Questa colorazione è essenziale in batteriologia: il primo

passo che deve essere attuato davanti ad un batterio sconosciuto è

identificare se questo appartiene ai Gram-pos o neg. Nel primo passaggio

lo striscio di cell fissate su un vetrino viene trattato prima con un colorante

basico, il cristal violetto (= colorante primario), poi con una soluzione di

Iodio che agisce da mordenteiodio aumenta l’interazione di fra il colorante

e la cell, la quale si colora più intensamente. Quindi lo striscio viene

decolorato attraverso un lavaggio con etanolo o acetone. Infine, lo striscio

viene trattato con un colorante basico semplice, come la safradina.

A questo punto: 35

i batteri Gram + hanno trattenuto il colorante basico (viola), poiché

o l'alcool non ha danneggiato a sufficienza la spessa parete cellulare

(idrofila) che non permette al colorante di passare.

i Gram - sono rosa, perché l'alcool ha sciolto i lipidi della

o membrana esterna, danneggiando la sottile parete cellulare .

Infine, per far risaltare meglio la differenza si colora quindi il materiale con

un colorante di contrasto, in genere safranina o fucsina (o eosina). La

Safranina colora le cellule in rosso e l'Eosina in rosa.

Le colture batteriche molto vecchie tendono a trattenere meno il colorante,

apparendo meno Gram-pos di quanto siano in realtà; alcune (poche) specie di

batteri inoltre non danno un responso chiaro alla colorazione, e sono dette G

ram-

variabili.

• Colorazione acido-resistente = La colorazione di Ziehl-Neelsen è un esame di

laboratorio che consente di riconoscere la presenza dei Micobatteri in un

campione sfruttando la caratteristica alcool-acido resistenza di tali microrganismi. I

Micobatteri, per la particolare struttura e composizione della parete cellulare,

hanno la capacità di trattenere la colorazione della fucsina basica di Ziehl anche

quando trattati con decoloranti come l'alcool o gli acidi minerali.

Metodo:

strisciare il campione in esame su un vetrino portaoggetti, fissarlo al calore

1) e coprirlo con un piccolo rettangolo (2 cm x 3 cm) di carta da filtro.

36

applicare 5-7 gocce di fucsina fenicata alla carta da filtro completamente

2) bagnata.

scaldare il vetrino fino ad evaporazione ma senza lasciarlo seccare. Il

3) riscaldamento può essere ottenuto con un becco Bunsen o con un

riscaldatore elettrico.

allontanare la carta con una pinzetta, risciacquare e lasciar scolare.

4) decolorare con la soluzione di alcool-acido per circa 2 minuti, fino a quando

5) non scompare il colorante.

eseguire la colorazione di contrasto con blu di metilene per 1-2 minuti.

6) risciacquare, scolare e seccare all'aria per 1-2 minuti.

7) esaminare al microscopio ottico con l'obiettivo ad immersione da 100x.

8)

Dopo che la fucsina basica è penetrata con l’aiuto del calore e del fenolo, le cell

acido-resistenti non si decolorano quando sono sottoposte ad un lavaggio con

acido solforico e alcol etilico, quindi i Micobatteri appaiono colorati in rosso su di

uno sfondo blu pallido. Questo fenomeno dipende dall’elevato contenuto in lipidi

dalle pareti delle cell acido-resistenti. Gli altri batteri, invece vengono decolorati

dalla miscela alcol-acido e diventano blu con la colorazione di contrasto effettuata

con blu di metilene.

• Colorazione strutturale = sono colorazioni specifiche per determinate strutture

cell specifiche:

Capsule : vengono colorate attraverso una colorazione negativa, che si

o effettua attraverso la mescolanza dei batteri con inchiostro di china; dopo

si stende un sottile film su un vetrino.

Endospore: vengono colorate attraverso una colorazione di Fulton le

o endospore prima vengono scaldate insieme a verde di malachite; in

seguito il colorante viene eliminato dalle altre parti della cell attraverso un

lavaggio con H O, quindi si applica il colorante di contrasto (es safradina).

2

Flagelli: si utilizzano acido tannico e allume di potassio per aumentare il

o loro spessore e quindi visualizzarli meglio al m.ottico. i flagelli vengono

poi colorati pararosanilina o con fucsina basica. Al m.elettronico questa

procedura non è necessaria.

Domande :

Perché la risoluzione del TEM è migliore rispetto a quella del microscopio ottico?

 Quale tipo di microscopio usereste per osservare il nucleoide?

 A cosa servono le colorazioni?

 A cosa è dovuta la differente risposta dei batteri alla colorazione di Gram?

 Definite il termine di risoluzione

 37

Di quale colore apparirà un Mo Gram-negativo dopo essere stato sottoposto alla

 colorazione di Gram?

Se un campione viene osservato al microscopio usando un obiettivo 43X ed un

 oculare 15X, quante volte viene ingrandita l’immagine?

Confrontate i vari microscopi descritti in termini di immagini.

 Perché il microscopio ottico a trasmissione presenta una risoluzione superiore a

 quella del microscopio ottico?

In che modo è possibile visualizzare nei batteri le capsule, le spore ed i flagelli?

STERILIZZAZIONE : consiste in qualsiasi processo chimico o fisico che porti

all'eliminazione di ogni forma microbica vivente, sia patogena che non, comprese le spore

(anche endospore di Bacillus e Clostridium) e i funghi. Un materiale è considerato sterile

−6

se il SAL (livello di sicurezza di sterilità) è inferiore a 10 ; ovvero quando la probabilità di

trovarvi un microrganismo è inferiore ad uno su un milione.

Per tutti i Mo esiste una temperatura massima per la crescita, al di là della quale

sopravvengono effetti letali causati dalla denaturazione delle macromol che perdono la

loro struttura e funzione. La letalità è dovuta all’innalzamento della temperatura secondo

una funzione esponenziale: la curva tanto è più rapida quanto la temperatura aumenta. È

importante conoscere la temperatura alla quale i MO muoiono per poter determinare in

modo corretto il tempo di sterilizzazione. Il parametro più utilizzato è il tempo di riduzione

decimale D, cioè il tempo necessario per ridurre di dieci volte, a una data temperatura, la

densità di popolazione. Ma poiché questo valore è di difficile calcolo, si utilizza anche

come parametro il tempo di inattivazione termica tempo necessario per uccidere tutte le

cell di una popolazione a una data temperatura. Questod ato viene ottenuto scaldando per

tempi diversi campioni di una sospensione cell posti in un terreno di coltura e poi incubati.

Il tempo di inattivazione dipende dalle dimensioni della popolazione, per cui sarà

necessario più tempo per uccidere tutte le cell di una popolazione di grandi dimensioni

rispetto a una di piccole.

NB!! Sterilizzazione = uccisione di tutte le forme vitali.

Disinfezione = distruzione dei patogeni non sporigeni.

Sterilizzazione mediante calore secco: La sterilizzazione avviene attraverso il contatto

dell'oggetto con aria calda che agisce per ossidazione dei componenti cellulari; sono

utilizzate la stufa a secco o il forno Pasteur. In media, per una sterilizzazione completa è

necessario che sia raggiunta una temperatura di 160º per un'ora o di 180º per 30 minuti. A

questi tempi si devono aggiungere poi i tempi di riscaldamento e raffreddamento che

portano un ciclo a 180-240 minuti. È comune uso lasciare aperto lo sportello

dell'apparecchio per la sterilizzazione fino a temperature di 80/100º: in questo modo si

permette la fuoriuscita dell'eventuale vapore acqueo che si potrebbe creare e che

38

andrebbe a ridurre l'efficienza del processo. È comunque una tecnica ormai in disuso e

soppiantata dalla sterilizzazione a vapore, avendo lo svantaggio, a causa delle

temperature molto alte, di non poter utilizzare molti materiali termosensibili. Oltre al difetto

di tempi tanto lunghi per una routine di sterilizzazione va aggiunto l'impossibilità di

verificare l'avvenuta sterilizzazione e il mantenimento nel tempo del risultato raggiunto fino

al momento dell'utilizzazione dello stesso, (impossibilità di imbustare).

Sterilizzazione mediante c alore umido : È una tecnica che sfrutta l'azione del vapore

fluente (pentola di Koch) o saturo (autoclave); elimina i microrganismi mediante

denaturazione di loro proteine e altre biomolecole. La sterilizzazione mediante autoclave è

quella più diffusa essendo poco costosa e non tossica e data la sua buona capacità di

penetrazione.

Autoclave: camera a chiusura ermetica che permette l’immissione di vapore saturo sotto

pressione. L’eliminazione delle endospore resistenti al calore richiede temperature

superiori al punto di ebollizione dell’acqua e l’uso di vapore sotto pressione. La normale

2

procedura prevede il riscaldamento a una pressione di 1,1 kg/cm , che permette di

raggiungere la temperatura di 121° C. A questa temperatura il tempo necessario per

raggiungere la sterilizzazione è 10-15 minuti. È necessario tenere presente che per oggetti

e liquidi di grandi dimensioni il tempo necessario per la sterilizzazione si prolunga. È

importante ricordare che non è la pressione a provocare la morte dei MO, ma l’elevata

temperatura.

Sterilizzazione mediante radiazioni: I sistemi a radiazioni si dividono in sistemi a

radiazioni ionizzanti e non ionizzanti.

Radiazioni ultraviolette (non ionizzante): si ottengono tramite una lampada

o

agli UV accesa per sterilizzare il piano di lavoro, quando questo non è utilizzato (=

cappa sterile). I sistemi a raggi ultravioletti non possono essere considerati

sterilizzanti, in quanto hanno principalmente un’ azione batteriostatica. Non hanno

grande capacità di penetrazione, per questo sono efficaci solo su oggetti non troppo

spessi o su liquidi fatti passare attraverso recipienti sottili. Devono essere utilizzate

con cautela e a distanza dagli operatori, essendo agenti mutageni estremamente

dannosi per gli occhi. Sono prodotte da lampade a vapori di mercurio.

γ

Raggi (Sistema ionizzante): Sono utilizzati prevalentemente in ambito

o

industriale avendo un'ottima capacità di penetrazione e avendo la possibilità di

trattare contemporaneamente grandi quantità di oggetti. Le radiazioni ionizzanti

sono radiazioni elettromagnetiche con un’energia tale da provocare la formazione di

ioni e altre specie di composti reattivi a partire da mol con cui entrano in collisione.

Vengono così prodotti elettroni, OH, e H mol in grado di degradare e alterare

biopolimeri, come il DNA. Tutto ciò provoca la morte della cell irradiata.

Sterilizzazione per filtrazione: per sterilizzare soluzioni e gas contenenti sostanze

termolabili, è preferibile usare questo metodo di sterilizzazione. Un filtro è un dispositivo

con pori troppo piccoli per permettere il passaggio dei batteri, ma abbastanza larghi per il

passaggio di liquidi e gas. I metodi di filtrazione selettiva sono stati usati per dimostrare

39

l’esistenza di particelle infettivevirus. Esistono vari di tipi di filtri, che vengono utilizzati in

base alla funzione richiesta:

• filtri a spessore : costituiti da strati fibrosi di carta, amianto o lana di vetro, in cui le

fibre sono disposte in modo casuale. Le particelle rimangono intrappolate nei pori

tortuosi che si creano nello spessore del filtro stesso. Poiché sono porosi, i filtri

vengono usati come prefiltri per rimuovere da una soluzione le particelle di maggiori

dimensioni che potrebbero intasare i filtri usati per la sterilizzazione.

• Filtro tipo Nucleopore : viene prodotto trattando un sottile strato di policarbonato

prima con radiazioni nucleari e poi con un composto chimico corrosivo. Le

radiazioni provocano dei danni localizzati nello strato di policarbonato, mentre il

trattamento chimico corrode i punti danneggiati causando la formazione di pori.

Questo tipo di filtri vengono utilizzati nella microscopia elettronica.

• Membrane filtranti: sono dischetti molto resistenti di acetato di

cellulosa, nitrato di cellulosa o polisulfone. L’apparato per la

filtrazione viene sterilizzato separatamente dal filtro ed è poi

assemblato asetticamente al momento dell’uso. La filtrazione del

liquido avviene utilizzando una siringa o una pompa a vuoto, per

forzare il passaggio di liquido attraverso la membrana in un

recipiente sterile.

Sicurezza in laboratorio: esistono vari livelli di sicurezza nei laboratori, in base ai Mo che

devono essere trattati.

• BSL1 : adatto per un lavoro che coinvolge agenti ben caratterizzati non noti per

causare malattie in soggetti (umani) adulti sani e di minimo potenziale rischio al

personale di laboratorio e dell’ambiente. Es: E. coli, Bacillus.

• BSL2 : adatto per un lavoro che coinvolge agenti con moderato potenziale rischio al

personale di laboratorio e all’ambiente. Es: HBV, Toxoplasma, parassiti, salmonella.

• BSL3 : adatto per un lavoro che coinvolge agenti che possono causare malattie

gravi o potenzialmente letali in seguito ad esposizione per via inalatoria. Es: M.

tuberculosis.

Sono necessarie misure di sicurezza precauzionali:

Costruzione separata o zona isolata

o Doppia porta d’ingresso

o Flusso d’aria unidirezionale all’interno del laboratorio

o Aria senza ricircolo: 10-12 ricambi aria/ora

o

• BSL4 : es. Vaiolo, ebola 40

Domande:

Quali sono i metodi di sterilizzazione degli ambienti?

 Come si sterilizza una vitamina?

COLTURE CELL:

NUTRIZIONE MICROBICA: consiste nel fornire alle cell i nutrienti necessari per la propria

crescita. Non tutti i nutrienti sono necessari nella medesima quantità: i macronutrienti sono

richiesti in quantità elevate, mentre i micronutrienti sono richiesti in quantità ridotte, alcuni

devono essere presenti solo in tracce.

Carbonio e Azoto: i batt possono utilizzare diversi composti organici contenenti carbonio

per permettere un aumento della crescita. Quindi possono essere utilizzati acidi grassi, aa,

acidi organici, zuccheri, basi azotate, composti aromatici. Gli organismi autotrofi utilizzano

la CO .

2

Dopo il carbonio, l’elemento più abbondante è l’azoto, elemento presente nelle proteine,

acidi nucleici. In natura è principalmente presente nella sua forma inorganica, come NH ,

3

3-

NO e N . In genere, i batteri usano NH come fonte di N; N viene invece usato solo dai

2 3 2

batteri azoto-fissatori.

Fosforo: in natura è presente sotto forma di fosfati inorganici e organici ed è necessario

alla cell per la sintesi degli acidi nucleici e dei fosfolipidi.

42- -

Zolfo: in natura è presente sotto forma di solfati (SO ) e solfuri (HS ). È importante per la

formazione degli aa cisteina e metionina; inoltre è presente nelle vitamine, come tiamina,

biotina, acido lipoico e CoA.

Potassio: fondamentale per la sintesi di alcuni enzimi.

Magnesio: stabilizza i ribosomi, le membrane cell, gli acidi nucleici ed è essenziale per

molti enzimi.

Calcio: aiuta a stabilizzare la parete cell e svolge un ruolo chiave nella resistenza al calore

delle endospore.

Sodio: non è indispensabile per tutti gli organismi. Es è presente nei microrganismi

presenti in mare, ma non in quelli di acqua dolce.

Ferro: ha un ruolo chiave nella respirazione cell: infatti è un componente essenziale dei

-

citocromi e delle proteine ferro-zolfo coinvolte nel trasporto di e .

In assenza di ossigeno, il ferro si trova nello stato 2+ ed è solubile, mentre con O si trova

2

nella conformazione 3+ e forma composti insolubili. Per ottenere Fe, le cell utilizzano

chelanti del Fe, detti siderofori, che solubilizzano il Fe lo trasportano nella cell.

41

Micronutrienti: sono metalli (es. Cr, Cu, Mn, Ni, Se, Zn)che esplicano funzioni strutturali

in diversi enzimi. Poiché la loro richiesta da parte dei batt è davvero molto piccoli, spesso

non è necessario aggiungerli nei terreni di coltura in laboratorio.

Fattori di crescita: sono composti organici necessari e comprendono vitamine, aa, purine

e pirimidine. La maggior parte delle vitamine funziona come parte di coenzimi. Le più

richieste sono tiamina (= vitamina B1), biotina, piridossina (= vitamina B6) e cobalamina (=

vitamina B12).

TIPI NUTRIZIONALI DEI MICRORGANISMI: le possibili fonti di energia che gli organismi

hanno a disposizione sono l’energia luminosa e l’energia che deriva dall’ossidazione delle

mol organiche ed inorganiche. Quindi:

• Fototrofi : organismi che utilizzano come fonte di energia la luce

• Chemiotrofi : organismi che ricavano energia dall’ossidazione di composti chimici.

• Litotrofi : usano come fonte di elettroni composti inorganici ridotti

• Organotrofi : estraggono elettroni dai composti organici.

Fotoautotrofi: usano la luce per ottenere energia e CO come fonte di carbonio. Es: Alghe

2

Chemioeterotrofi: usano i composti organici come fonte di energia, idrogeno, elettroni e

carbonio. Praticamente tutti i batteri patogeni appartengono a questa classe.

Eterotrofi fotoorganotrofi: sono batteri porporini e verdi che usano la materia organica

come fonte di elettroni e carbonio. Es: batteri porporini non sulfurei.

Autotrofi chemiolitrofi: ossidano composti inorganici ridotti, come le mol di Fe, S, N e ne

ricavano energia ed elettroni per la biosintesi.

Mixotrofi: ne fanno parte i batteri Beggiatoa, che usano i composti inorganici come fonti di

energia e le sostanze organiche come fonte di carbonio.

Prototrofi: specie o ceppo microbico in grado di crescere su terreno minimo usando come

fonte di carbonio semplici carboidrati o CO , e tutti gli altri elementi sotto forma di sali.

2

Auxotrofi: specie o ceppo microbico con richieste nutrizionali particolari (aa, nucleotidi,

cofattori).

TERRENI: sono soluzioni nutrienti usate per permettere la crescita microbica.

Le soluzioni dei terreni possono trovarsi in forma liquida (= brodo) o solida in questo caso

è presente anche Agar in concentrazione di 15-18 g/l. L’agar è un polisaccaride strutturale,

estratto da un’alga rossa, che funge da agente solidificante trasformando il terreno in

gelatina, e che non viene digerito dai batteri. È molto utile quando occorre coltivare

microrganismi in superficie. Una volta preparato e sterilizzato in autoclave a 100°C, l’Agar

viene versato su piastra Petri, dove viene lasciato a raffreddare (45°C)e poi messo in stufa

per eliminare la condensa. 42

Se sappiamo quale organismo dobbiamo isolare e conosciamo il suo metabolismo,

possiamo allestire il terreno di coltura con tutti i nutrienti di cui il microrganismo ha

bisogno.

• Terreno minimo : usa l’ossidazione di composti inorganici e usa come fonti di

carbonio la CO inorganica.

2

Es di terreno minimo per batteri chemioeterotrofi.

Estratto di montone 1,5g Fonte vitamine

Estratto di lievito 3,0g Fonte vitamine

Peptone 6,0g Fonte amido

Glucosio 1,0g Fonte di C ed energia

Agar 15g Agente solidificante

Acqua 1000ml

pH 6.0

• Chimicamente definiti : preparati aggiungendo all’H O distillata precise quantità di

2

sostanze organiche ed inorganiche. Di conseguenza si conosce l’esatta

composizione chimica del terreno.

• Chimicamente indefiniti (= terreni complessi): sono quei terreni di cui non si

conosce in maniera dettagliata la composizione chimica. Questi mezzi di coltura

risultano di estrema utilità in quanto permettono di crescere contemporaneamente

specie con esigenze nutrizionali molto diverse fra loro. Oltre alle sostanze

“standard” i terreni complessi contengono:

Peptoni , idrosilati proteici che derivano da una parziale digestione proteolitica

1. (questi particolari proteine son parzialmente idrolizzate altrimenti denaturerebbero

ad alte temperature);

Estratti di carne magra , ricchi in amminoacidi, peptidi, nucleotidi, acidi organici,

2. vitamine e sali minerali;

Estratti di lievito , ricchi di vitamina B e composti del carbonio e dell’azoto.

3. Es di terreno complesso utilizzato per batteri ossidanti lo zolfo chemioautotrofi.

NH Cl 0,52 g Fonte N

4

KH PO 0,28g Fonte P e K

2 4 2+

MgSO 7H O 0,25g Fonte S e Mg

4 2 2+

CaCl 2H O 0,07g Fonte Ca

2 2 43

Zolfo 1,56g Fonte energia

CO 5% Fonte C

2

Acqua 1000ml

pH 3.0

• Terreni selettivi : Sono terreni che favoriscono la crescita solo di particolari specie

batteriche grazie alla presenza di fattori che inibiscono lo sviluppo delle altre

specie. Questi fattori vengono chiamati sostanze inibenti e possono essere

antibiotici, coloranti o sali. Alcuni esempi di sostanze inibenti possono essere:

Cristal violetto : inibisce i batteri Gram+

1. Verde brillante : inibisce i batteri Gram+ e la Shigella

2. Cetrimide : favorisce la crescita dello Pseudomonas aeruginosa

3. Sodio azide : inibisce a seconda delle sue concentrazioni: se la concentrazione è

4. bassa viene inibita la crescita dei Gram-,se la concentrazione è elevata vengono

inibiti anche i Gram+.

Antibiotici : inibiscono la crescita dei batteri, favorendo quella di lieviti e muffe

5. Cloruro di sodio : a concentrazioni elevate (>3%) inibisce la maggior parte dei

6. microrganismi (esclusi stafilococchi)

• Terreni differenziali : permettono la crescita di due organismi e il loro

differenziamento. Es: Agar-sangue per streptococchi si divideranno in α-emolitici

e β-emolitici. Questi producono tossine dette streptolisine, che lisano le membrane

dei GR.

Componenti presenti all'interno di un terreno differenziale possono essere:

Indicatori di pH (rosso fenolo ...)

, eosina

o Indicatori reazioni redox (sostanze che cambiano la loro configurazione

o elettronica in base alle quantità di elettroni, cambiando così colore)

Composti facenti reazioni chimiche (come ferro citrato ioni solfuro)

o

• Terreni selettivi-differenziali : si usano molto nella diagnostica chimica dei Gram-

neg. Sono indicatori di pH. Producono un colore porpora scura quando il pH

diminuisce. Inibiscono la crescita di Gram-pos.

Es. MacConkey agar è un terreno in grado di differenziare i batteri fermentanti il

lattosio da quelli non fermentanti. La presenza di Sali biliari e cristal violetto

inibisce la crescita dei Gram+, mentre la presenza di lattosio e rosso fenolo

differenzia i Gram- fermentanti da quelli non.

44

• Terreni elettivi : Sono terreni ricchi di nutrienti, spesso con la presenza di sangue di

pecora o cavallo, rosso d'uovo, albumina o miscele chimicamente definite (ad

esempio vitamine o aminoacidi)che consentono la crescita di specie microbiche

esigenti da un punto di vista nutritivo. Si mettono sangue o siero, per mimare

meglio le condizioni riscontrate nell'organismo che ospita un determinato

microrganismo.

• Terreni di arricchimento: Sono terreni che consentono di aumentare la carica della

specie batterica che ci interessa isolare, grazie alla presenza di fattori che

rallentano la crescita di specie batteriche contaminanti presenti nel campione in

esame. Procedimento:

Inoculare un terreno contenente fenolo quale unica fonte di C con il

o terreno e incubare

Trasferire 1 ml ad un’altra beuta contenente fenolo e incubare

o Soltanto i batteri in grado di metabolizzare il fenolo cresceranno.

o

Domande:

I fotoautotrofi utilizzano…….

 I chemioautotrofi utilizzano…………..

 Terreno selettivo significa……

 L’agar sangue è un terreno…..

 Un chemioautotrofo è coltivato in un terreno…….

 E. coli cresce in un terreno…….

 Un terreno più antibiotico è un terreno………

 Come potreste isolare un batterio fotosintetico e azoto-fissatore?

 Differenza tra terreno selettivo e terreno di arricchimento. Fornite un es di ciascuno.

 Fate un esempio di terreno selettivo differenziale.

 Che cosa significa coltura pura? Come si può ottenere?

LA CRESCITA BATTERICA

: il termine crescita indica un aumento ordinato dei

costituenti cell. Se i microrganismi si riproducono per gemmazione o scissione binaria, la

crescita coincide con un aumento del nr delle cell. La scissione binaria è il processo che

permette alla cell di dividersi in due cell figlie, dopo accrescimento iniziale e successiva

formazione di un tramezzo transitorio. Il tramezzo viene detto setto ed è costituito da

un’introflessione della membrana citoplasmatica e della parete cell, che si accrescono fino

a separare la cell. Nel corso di un ciclo di crescita tutti i costituenti cell aumentano in modo

che le cell figlie ricevano ciascuna un intero cromosoma e copie sufficienti di macromol.

Se l’organismo è cenocitico (ovvero è un organismo multi nucleato in cui le divisioni

nucleari non sono accompagnate da divisioni cell) la crescita porta a un aumento delle

dimensioni, ma non del numero delle cell. 45

L’aumento del nr di cell batteriche può essere misurato come incremento della massa

microbica, quindi la velocità di crescita è la variazione della massa per unità di tempo.

L’intervallo di tempo durante il quale da una singola cell se ne formano due è detto

generazione, quindi il tempo richiesto per l’intero processo è chiamato tempo di

generazione, che varia molto da un organismo all’altro.

TRASFERIMENTO ASETTICO: consiste in una serie di procedure atte a prevenire la

contaminazione durante la manipolazione delle colture e dei terreni sterili. Attraverso

questa tecnica può essere inoculata una nuova coltura batterica che avrà così la

possibilità di crescere in coltura. Il trasferimento asettico da una provetta contenente un

terreno a un’altra viene effettuato con un’ansa o con un ago sterilizzato per incandescenza

su una fiamma. Le colture in cui ha avuto luogo una crescita possono essere trasferite

sulla superficie di una piastra agar, dove in seguito alla crescita e alla divisione di singole

cell si sviluppano colonie. Prelevare e strisciare una colonia isolata è il metodo migliore

per ottenere una coltura pura da una comunità microbica costituita da organismi diversi.

LA CURVA DI CRESCITA: la crescita di una pop viene studiata analizzando la curva di

crescita ottenuta da una coltura microbica. Se i batt crescono in mezzo liquido, si ottiene

una coltura batch (= sistema chiuso). La coltura viene incubata in un recipiente chiuso

contenente una quantità limitata di terreno; poiché non viene mai aggiunto terreno fresco,

la concentrazione dei nutrienti diminuirà nel tempo e aumenterà la concentrazione delle

sostanze di rifiuto.

Fase di latenza(= fase lag): quando una coltura batterica viene inoculata in un terreno

fresco, generalmente non si osserva immediatamente una crescita netta; questa fase è

preceduta da una fase di latenza, che può verificarsi per diversi fattori:

• Le cell possono essere vecchie (o semplicemente in fase stazionaria) e quindi prive

di ATP, cofattori e ribosomi. 46

• Il terreno può essere diverso da quello in cui il microrganismo è vissuto in

precedenza

• Le cell possono essere state danneggiate da radiazioni, calore o composti chimici

tossici e quindi devono avere il tempo necessario di riparare il danno subito.

Quando, invece, le cell, che si trovano in fase esponenziale, vengono inoculate in un

terreno con le stesse caratteristiche di quello precedente, alle stesse temperature,

passano direttamente alla fase esponenziale saltando la fase lag.

Fase esponenziale: durante questa fase i microrganismi si dividono attivamente per

aumentare la dimensione della colonia. Durante questa fase la velocità di crescita si

mantiene costante, se le condizioni ambientali (temperatura, composizione del terreno)

restano invariate. Questa fase è caratterizzata da una crescita bilanciata, ovvero tutte le

componenti cell vengono sintetizzate a tasso costante le une rispetto alle altre. Se

cambiano i livelli di nutrienti o altre condizioni ambientali, allora la crescita diventa non

bilanciata.

Fase stazionaria: la fase stazionaria caratterizza la fine della crescita batt; quando le

9

cell raggiungono in coltura una densità di 10 cell/ml , in quanto si verifica

l’esaurimento dei nutrienti e contemporaneamente si ha un accumulo dei prodotti di scarto.

Sebbene non vi sia una crescita netta, molte funzioni cell, come il metabolismo energetico,

possono continuare. Poiché durante questa fase alcuni organismi moriranno, altri potranno

crescere, seppur molto lentamente, quindi la loro crescita viene definita criptica. In questo

modo la popolazione rimane costante. I batteri che raggiungono questa fase, inoltre,

producono un’ampia gamma di proteine da deprivazione nutrizionale, che le rendono

molto più resistenti a possibili danni. Queste proteine intensificano i legami crociati del

peptidoglicanoaumento della forza della parete.

Fase di morte: se l’incubazione prosegue, le cell entrano nella fase di morte, determinata

dalla mancanza di nutrienti e dall’accumulo dei prodotti di rifiuto, che diventano tossici per

le cell. Durante questa fase la conta totale delle cell può rimanere costante, mentre la

conta vitale decresce lentamente. Spesso l’unico modo per stabilire se una cell batterica è

viva consiste nell’inocularla in terreno fresco: se la cell non si riproduce più, allora si

presume sia morta. Quindi per morte cell si intende la perdita irreversibile della capacità di

una cell di riprodursi.

I parametri della crescita batterica: durante la fase esponenziale, ogni microrganismo si

divide ad intervalli costanti. Quindi se a 20min la popolazione è costituita da 2cell, a 40

n

sarà costituita da 4 e così via; il suo aumento sarà espresso dalla potenza 2 , dove n

rappresenta il nr delle generazioni.

Il tempo di generazione g viene calcolato come t/n, dove t è il tempo in ore o minuti. Quindi

conoscendo il nr iniziale e finale di una popolazione in crescita, è possibile ricavare n e da

n, conoscendo t, si può ricavare g. 47 n

N = N X 2

t 0

LogN = LogN + nLog2

t 0

n = (LogN - LogN )/Log2

t 0

n = (LogN - LogN )/0.301

t 0

G = T/n

CRESCITA DI COLTURE CONTINUE: fino a questo momento si è parlato di colture batch,

dove il terreno di coltura non viene rinnovato e quindi la fase esponenziale della curva di

crescita dura solo per poche generazioni. Tuttavia, è possibile coltivare delle colture cell

per lungo tempo , utilizzando sistemi aperti, cioè caratterizzati da condizioni ambientali

costanti grazie al continuo rinnovamento del terreno e alla conseguente eliminazione dei

prodotti di scarto.

In questo modo si ottiene una coltura continua sistema di flusso a volume costante in cui

viene continuamente aggiunto terreno fresco e da cui viene eliminato uguale volume di

terreno esaurito. Una volta che viene raggiunto l’equilibrio, il nr delle cell e la

concentrazione dei nutrienti rimane costante.

Chemostato: è costruito in modo da immettere nuovo terreno sterile con al stessa velocità

a cui viene rimosso quello vecchio. Il terreno di coltura contiene un nutriente essenziale in

quantità tali da renderlo un fattore limitante. Quindi, il tasso di crescita è determinato dal

tasso d’immissione di terreno fresco nella camera di crescita e la densità cell finale

dipende dalla concentrazione del nutriente limitante. Quindi:

D = f/V

dove:

D = tasso di diluizione, cioè la velocità a cui il terreno fluisce attraverso il recipiente di

coltura in rapporto al volume del recipiente stesso

f = velocità di flusso (ml/ora)

V = volume del recipiente (ml)

Turbidostato: apparecchio dotato di una fotocellula che misura l’assorbanza (= torbidità)

della coltura nel recipiente di crescita. In questo caso il tasso di diluizione è costante e nel

terreno non è presente alcun nutriente a concentrazione limitante.

MISURAZIONE DIRETTA DELLA CRESCITA MICROBICA: la crescita di una popolazione

batterica è misurata seguendo nel tempo la variazione del numero di cell oppure il peso

secco delle cell stesse. 48

Conta totale: questo tipo di conteggio può essere effettuato sia su campioni essiccati su

vetrino, sia su campioni sospesi in liquido. in questo ultimo caso è necessario utilizzare

una camera di conta di Petroff-Hausser queste camere hanno un vetrino di superficie con

un reticolo quadrettato in cui è nota l’area di ogni riquadro. Poiché vi viene posta una

quantità di volume nota, il nr di cell conteggiate nella camera viene moltiplicato per un

fattore di conversione basato sul volume della cameraottengo il nr cell/ml.

Svantaggi:

• Non è possibile distinguere tra cell vive e cell morte

• È difficile individuare cell di dimensioni molto piccole

• È necessario utilizzare un microscopio a contrasto di fase

• È necessario immobilizzare le cell prima della conta

• La popolazione deve essere abbastanza grande

Conta vitale: permette di determinare il nr delle cell di un campione in grado di formare

colonie su un terreno opportuno. Infatti questo conteggio viene definito anche conta delle

colonie.

Vi sono due metodi per eseguire una conta in piastra:

• Piastramento in superficie : un volume noto di una coltura diluita (non maggiore di

0,1 ml) viene distribuito con una spatola sterile sulla superficie sul terreno in piastra

Petri. La piastra viene poi incubata fino alla comparsa delle colonie. È importante

che il liquido venga adsorbito dal terreno, altrimenti le colonie tendono a fondersi e

non è più possibile contarle.

• Piastramento per inclusione : un volume noto di colture cell viene pipettato in piastra

Petri, poi viene aggiunto un terreno con Agar fuso e il tutto viene mescolato. È

possibile effettuare questo tipo di piastramento solo con batteri in grado di tollerare

per un certo periodo una temperatura di 45° C, in quanto è la temperatura a cui si

trova l’agar liquido.

Diluizione della sospensione prima del piastramento: è importante diluire la coltura

batterica prima che venga piastrata, in quanto un eccessivo affollamento di cell

impedirebbe la formazione di colonie oppure provocherebbe la fusione di colonie tra loro,

impedendo così di poter effettuare un conteggio preciso. Normalmente, l’ideale è ottenere

nella piastra un numero di colonie che va da 30 a 300, ma poiché difficilmente si conosce

il nr di cell vive nella sospensione da diluire, si esegue una serie di diluizioni scalari in

-1

base 10. Per ottenere una diluizione di dieci volte (10 )si possono mescolare 0,5 ml di

campione con 4,5 ml di diluente, oppure un 1ml di campione con 9 di diluente. Quindi, se

49

-2

si vuole fare una diluizione per cento (10 ), si mescolano 0,05 ml di campione con 0,45 di

diluente, oppure 0,1 ml di campione con 0,9 di diluente.

Serial Dilutions

Misura della torbidità: metodo usato per misurare la massa cell. Una sospensione cell

appare torbida perché ogni cell riflette luce. Quanto maggiore è il numero di cell presenti

nella sospensione, tanto più sarà la luce riflessa, quindi maggiore sarà la torbidità. La

torbidità può essere misurata con un colorimetro o con uno spettrofotometro, che

misurano il fascio di luce non riflesso che riemerge.

Metodo delle membrane filtranti: il nr delle colonie

può essere determinato contandole una volta cresciute

su particolari membrane filtranti, dotate di pori così piccoli

da non permettere il passaggio di batteri. Sottovuoto, un

campione viene fatto passare da un recipiente

all’altro per semplice filtrazione. I due contenitori sono

separati dalla membrana. Il filtro viene poi deposto su un

terreno Agar in piastra Petri e poi viene incubato fino

allo sviluppo di colonie. 50

FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA: le attività dei microrganismi sono

fortemente influenzate dalle condizioni ambientali e fisiche del loro ambiente naturale.

Temperatura: all’aumentare della temperatura, le reazioni chimiche ed enzimatiche

aumentano la loro velocità e la crescita diventa più rapida. Tuttavia, oltre una certa velocità

alcune proteine possono denaturare in maniera irreversibile. Esiste quindi un intervallo di

temperatura in cui le funzioni e la crescita aumentano, dopo il punto di inattivazione,

invece, tutti i processi si bloccano. Quindi per ogni organismo è possibile determinare le

sue temperature cardinali:

Effect of Temperature on Growth Rate

• Temperatura minima , al di sotto della quale non c’è crescita. Molto probabilmente

determina un irrigidimento della membrana; ciò impedisce alla cell di svolgere

funzioni come il trasporto di nutrienti o la formazione di un gradiente protonico.

• Temperatura ottimale, alla quale si ha la velocità max di crescita. È sempre più

vicina alla temperatura massima che a quella minima.

• Temperatura massima , al di sopra della quale non si ha crescita. Determina

inattivazione delle funzioni cell.

Le temperature cardinali differiscono molto da un organismo all’altro: mentre alcuni

hanno un optimum a valori molto bassi (4° C), per altri è attorno ai 100°C. in ogni caso

non esiste alcun organismo in grado di crescere lungo l’intero intervallo di temperatura.

In funzione della temperatura ottimale, i batteri possono essere divisi in 4 categorie:

• Psicrofili = 0-20°C, con temperatura ottimale di 15°C. Vivono in ambienti

costantemente freddi, come le regioni polari. Gli psicrotolleranti sono capaci di

51

crescere a 0° C, ma hanno un optimum attorno a 20-40°C. Es. Chlamydomonas

nivalis: colora in rosso i nevai perenni quando riaffiora in estate.

Gli ambienti che hanno un’escursione termica elevata tra la stagione estiva (fino

a 40°C) e quella invernale (-20°C) sono molto meno favorevoli a questi

organismi rispetto ad aree che rimangono congelate per tutto l’anno.

• Mesofili = 20-45°C si trovano generalmente negli animali a sangue caldo e in

ambienti con un clima tropicale. Es. E.coli.

• Termofili moderati = 45-70°C, con optimum attorno ai 55°C vivono per esempio

nel foraggio conservato nei silos, dove la temperatura si aggira tra i 60-65°C.

• Termofili estremi = 70-100° C vivono nei geyser o nelle sorgenti termali.

Gli organismi che vivono a temperature estremamente basse o estremamente alte in cui

l’uomo non potrebbe sopravvivere vengono definiti estremofili.

pH: l’acidità o l’alcalinità di una soluzione è espressa attraverso il suo pH, in cui il valore di

neutralità è uguale e 7. Il pH è una funzione logaritmica, quindi la variazione di un’unità

+

corrisponde a una variazione di 10 volte della [H ]. Ogni organismo cresce ad un

determinato intervallo di pH, nel quale è possibile individuare il pH ottimale; la maggior

parte vive in un intervallo di pH che è compreso tra 5 e 9.

Gli organismi estremofili che vivono a pH molto bassi sono detti acidofili (pH ottimale 0-

5,5); i funghi risultano essere più acido-tolleranti rispetto ai batteri, riuscendo a vivere

anche a pH 2. Tra i batteri acidofili, alcuni sono obbligati, ossia non sono in grado di

sopravvivere a pH neutro (es Thiobacillus) quando il pH si avvicina alla neutralità, la

membrana degli acidofili obbligati comincia a disgregarsi e la cell si lisa.

I basofili hanno pH ottimale 5,5-8, mentre il pH degli alcalofili varia da 8,5-11,5 si trovano

in habitat come laghi alcalini e i suoli con elevato contenuto di carbonati. Alcuni batteri

basofili sono anche alofili, ossia necessitano di una grande concentrazione di sali per

sopravvivere.

Il pH ottimale di crescita rappresenta solo il pH dell’ambiente extracell, mentre il pH

intracell deve rimanere vicino alla neutralità in modo da impedire la distruzione delle

macromol cell.

Soluti e attività dell’acqua: la disponibilità di acqua è uno dei principali fattori che

influenzano la crescita microbica. Ovviamente, la disponibilità di acqua è determinata

anche dalla concentrazione di soluti come sali, zuccheri…

La disponibilità di acqua viene espressa come attività dell’acqua (a ) rappresenta il

w

rapporto tra la pressione di vapore dell’aria in equilibrio con una sostanza e la pressione

dell’acqua pura. Quindi i suoi valori sono compresi tra 0 e 1.

52

Psoln

A = Pwater

w

Il citoplasma della cell ha una concentrazione di soluti più elevata rispetto all’esterno,

quindi l’acqua tenderà ad entrare all’interno della cellequilibrio idrico positivo.

Sulla base di queste considerazioni, è possibile suddividere i microrganismi in base alla

loro capacità di vivere in ambienti con concentrazioni di soluti +/- elevate:

• Alofili : vivono nelle acque marine dove NaCl è a 3%. Poiché questa

richiesta di NaCl è variabile, a loro volta possono essere suddivisi in bassi alofili e

moderati alofili.

• Alotolleranti: tollerano una certa riduzione di a ma generalmente crescono meglio

w,

in assenza di soluti aggiunti.

• Alofili estremi: vivono ad una concentrazione molto elevata di NaCl (15-30%).

• Osmofili: richiedono un’elevata concentrazione di zuccheri

• Xerofili: vivono in ambienti molto secchi.

Molti microrganismi conservano la concentrazione osmotica del protoplasma a valori

leggermente superiori rispetto a quelli dell’habitat, attraverso l’uso di soluti compatibili

sostanze compatibili con il metabolismo e la crescita cell anche se presenti a

concentrazioni intracell elevate. Questi soluti possono venire sintetizzati direttamente dai

microrganismi, oppure possono venire accumulati in seguito ad assunzione.

Ossigeno:nei riguardi dell’ossigeno, i microrganismi hanno dimostrato una diversa

esigenza e tolleranza.

• Aerobi : crescono in presenza di O a tensione naturale; alcuni essi tollerano elevate

2

concentrazioni di ossigeno (O iperbarico). Molti aerobi sono facoltativi, ossia

2

crescono sia con sia senza ossigeno.

• Microaerofili : aerobi che usano O solo se presente a livelli ridotti rispetto a quello

2

dell’aria.

• Anaerobi aerotolleranti : tollerano O e crescono in sua presenza anche se non

2

possono utilizzarlo nel metabolismo come accettore finale di elettroni.

• Anaerobi facoltativi : crescono bene ugualmente in presenza di O che in assenza.

2

• Anaerobi obbligati ( = stretti): vengono inibiti o uccisi dall’ossigeno, in quanto non

sono in grado di detossificare alcuni dei composti tossici che si formano dal

metabolismo dell’ossigeno. Una delle classi più famose che appartiene a questa

categoria è rappresentata da Clostridium, altri si trovano nei metanogeni e in altre

specie di Archaea. 53

Effetti dell’ossigeno nelle colture batteriche: Per far crescere gli anaerobi, che non

richiedono ossigeno, si utilizza un composto in grado di eliminarlo chiamato agente

riducente, in quanto riduce l’ossigeno ad acqua. Ad es viene utilizzato il tioglicolato, che

viene addizionato al terreno. Una volta eliminato tutto l’O presente nel terreno, l’ossigeno

2

si troverà soltanto nella parte superiore del terreno che si trova a diretto contatto con l’aria.

In queste condizioni:

• gli aerobi obbligati cresceranno nella parte superiore del terreno in modo da essere

a contatto con l’aria;

• gli anaerobi facoltativi lungo tutta l’altezza della provetta, ma localizzandosi

preferibilmente negli strati superiori

• I microaerofili vicino all’estremità superiore

• Gli anaerobi si localizzeranno sul fondo della provetta, dove l’ossigeno non può

penetrare.

Per eliminare completamente l’ossigeno dai terreni usati per gli anaerobi stretti, è possibile

incubare le piastre in apposite giare con sostanze chimiche che consumano l’O2 presente.

Domande:

Descrivete le fasi della curva di crescita.

 Descrivete i metodi per la determinazione della curva di crescita.

 A cosa è dovuta la latenza in una curva di crescita?

 Che cosa sono i chemostati e a che cosa servono?

 Che cosa è il tempo di generazione e come si determina?

 Spiegare la differenza di crescita in un sistema aperto e in uno chiuso

 54

Come si isola un batt riduttore di amilasi?

 Che cosa si intende per crescita batterica

 Come sono classificati i batt in base alla temperatura?

 I batteri che hanno un optimum di T tra i 25 e 45 °C sono detti…..

 I batteri………si trovano nelle regioni artiche e antartiche.

 I batteri che non crescono assolutamente in presenza di ossigeno sono ….perchè

 non tollerano l’ossigeno?

FERMENTAZIONE:

METABOLISMO: è la somma delle reazioni chimiche che avvengono nella cell ed è reso

possibile dal flusso dell’energia e dall’azione degli enzimi. È composto da:

• Catabolismo : in cui mol più grandi e più complesse vengono decomposte in mol più

piccole e più semplici con rilascio di energia.

• Anabolismo : corrisponde alla sintesi di mol complesse, a partire da mol più

semplici, con apporto di energia.

Entrambi i processi vengono catalizzati dagli enzimi = catalizzatori delle reazioni

biologicheaumentano la velocità delle reazioni senza influenzarne l’equilibrio.

Hanno caratteristiche precise:

• Potere catalitico = rapporto tra velocità di una reazione catalizzata e una non

catalizzata.

• Specificità = ogni enzima è specifico per ogni reazione.

• Regolazione

Durante una reazione enzimatica, l’enzima si combina temporaneamente con un reagente,

detto substrato, formando un

complesso enzima–substrato. Mentre la

reazione procede viene rilasciato il

prodotto e l’enzima ritorna allo stato

originale. La porzione dell’enzima a cui si

lega il substrato è detto sito attivo.

→ → EP → E+ P

E + S ES 55

Le reazioni enzimatiche possono avvenire spontaneamente, e in questo caso vengono

definite esoergoniche (in cui G<0) oppure possono essere non spontanee (=

endoergoniche, G>0). In questo caso, affinchè le reazioni avvengano, è necessario

immettere una certa quantità di energia.

REAZIONI REDOX: chimicamente un’ossidazione viene definita come la rimozione di uno

o più elettroni da una sostanza, mentre una riduzione è definita come l’aggiunta di un

elettrone. In biochimica ossidazione e riduzione coinvolgono il trasferimento non solo di un

- -

elettrone, ma di tutto un H. Si parte da un donatore di e per arrivare ad un accettore di e .

Nel catabolismo il donatore di elettroni viene chiamato anche fonte di energia; è molto

importante capire che non è il donatore in sé a fornire energia, ma la reazione chimica

durante la quale il donatore viene ossidato che rilascia energia.

Nei sistemi biologici l’elettrone e il protone vengono rimossi dal substrato e trasferiti a un

-

trasportatore di e . Questi trasportatori possono essere:

• + +

Diffusibili liberi = includono i coenzimi NAD e NADP , che sono trasportatori di

atomi di idrogeno e trasferiscono due atomi di idrogeno al successivo trasportatore

della catena.

• Legati a enzimi presenti sulla membrana = funzionano nelle reazioni di trasporto di

-

e associati alla membrana.

Le reazioni redox possono essere considerate come un processo a tre fasi:

Rimozione degli elettroni dal donatore primario

1- -

Trasferimento e attraverso una serie di trasportatori

2- -

Cessione degli e all’accettore terminale.

3-

Conservazione dell’energia: l’energia chimica anche viene liberata nelle reazioni redox

viene conservata sotto forma di legami fosfati ad alta energia. L’ATP è, infatti, il principale

trasportatore di energia; poiché viene generato durante le reazioni esoergoniche, viene

utilizzato per condurre quelle endoergoniche.

In aggiunta ai composti fosfati ad alta energia, nella cell vengono prodotti altri composti

per conservare l’energia prodotta nelle reazioni spontanee. Tra questi composti vi è il CoA,

che contiene legami sulfoanidridici la cui scissione libera energia.

Nei chemiotrofi (= usano sostanze chimiche come donatori di elettroni) sono presenti due

meccanismi destinati alla conservazione di energia:

56

• Fermentazione : il processo redox avviene in assenza di accettori terminali. In

questo caso l’ATP viene prodotto mediante fosforilazione a livello del substrato

ATP viene sintetizzato in vari stadi di un composto organico.

• Respirazione : è presente sempre un accettore finale di elettroni: il più comune è

l’ossigeno molecolare. In questo caso l’ATP viene prodotta attraverso fosforilazione

ossidativa, a spese della forza proton-motrice.

In entrambi i processi il risultato finale è la sintesi di ATP.

Quindi il metabolismo aerobico può essere suddiviso in tre stadi:

• nel primo stadio mol di nutrienti più grandi (= proteine, polisaccaridi lipidi) vengono

idrolizzate o decomposte nelle loro parti costituenti. Le reazioni chimiche di questo

stadio non rilasciano molta energia.

• Nel secondo stadio aa, monosaccaridi, acidi grassi e glicerolo prodotti nello stadio 1

vengono ulteriormente ridotti. Questo stadio opera in aerobiosi o in anaerobiosi,

portando alla formazione di ATP, FADH e NADH.

2

• Nel terzo stadio il carbonio prodotto viene immesso nel ciclo di Krebs, dove le mol

sono completamente ossidate a CO , con produzione di ATP, FADH e NADH.

2 2

Questo ciclo provoca il rilascio di molta energia.

NAD = è una biomolecola il cui ruolo biologico consiste nel trasferire gli elettroni, quindi nel

permettere le ossido-riduzioni; come sempre avviene in biologia, essa svolge il suo

importante ruolo tramite lo spostamento di atomi di idrogeno. È un coenzima

ossidoriduttivo. Le reazioni di ossidazione vedono impegnato il NAD+, in quanto

riducendosi a NADH, accetta un protone (idrogenione H) e due elettroni (o più spesso un

idruro H- , grazie al quale riceve direttamente un protone dell'idrogeno e due elettroni)

dalla molecola substrato (generalmente indicata con la sigla SH2, dove S = substrato) e

agevola quindi la sua ossidazione. Mentre nella reazione di riduzione di un generico SH ad

SH2, il coenzima si ossida da NADH a NAD+, donando un protone e due elettroni. La

reazione di ossidazione è la favorita, in quanto il sistema NAD/NADH ha un Potenziale

redox pari a -0,32 Volt.

generica ossidazione del coenzima: NADH + SH --> NAD+ + SH2

generica riduzione del coenzima: NAD+ + SH2 ---> NADH + SH

Il NAD, così come tutte le altre sostanze trasportatrici di elettroni, non viene né prodotto né

consumato nelle cellule; queste utilizzano, effettivamente, sempre le stesse molecole

trasferitrici, che di volta in volta si ossidano o riducono. Perciò ogni cellula ha bisogno di

ritrasformare il NAD ridotto (NADH ) tramite la glicolisi o altre reazioni chimiche in NAD

2

+

ossidato (NAD ) per poter fare in modo che le prime avvengano ancora. Ciò succede in

modo diverso in ogni cellula: mentre i Lactobacilli utilizzano, per esempio, la

fermentazione lattica, i Saccharomyces adoperano quella alcolica.

ATP: L'adenosina trifosfato è un ribonucleotide trifosfato formato da una base azotata (=

adenina), dal ribosio, (= zucchero pentoso), e da tre gruppi fosfato. È uno dei reagenti

57

necessari per la sintesi dell'RNA, ma soprattutto è il collegamento chimico fra catabolismo

e anabolismo, costituendo la "moneta" corrente energetica. Esso viene idrolizzato ad ADP

(adenosindifosfato), che viene riconvertito in ATP mediante vari processi.

L'ATP è il composto ad alta energia richiesto dalla stragrande maggioranza delle reazioni

metaboliche endoergoniche. Esso viene prodotto secondo la reazione endoergonica:

ADP + P + E ---> ATP

i

L'ATP non può stare libero nel citosol ma deve essere chelato dal magnesio. Esso

maschera parzialmente le cariche negative e influenza la conformazione nello spazio dei

gruppi fosfato.

Dalla respirazione, in cui si libera energia, una parte molto piccola di essa (7,3 kcal/mol)

viene immagazzinata nelle molecole di ATP. L'immagazzinamento vero e proprio avviene

quando la fosfocreatina cede alla molecola di ADP un gruppo fosfato per divenire ATP.

Mentre si uniscono gruppo fosfato e ADP, l'energia viene imprigionata nei nuovi legami

chimici.

GLICOLISI: processo usato da chemioeterotrofi per sintetizzare piruvato a partire da

glucosio; fa parte della seconda fase del catabolismo, quindi può avvenire sia in presenza

sia in assenza di O .

2

E’ divisa in 2 step:

• Stadio a 6 atomi di carbonio

• Stadio con 2 mol a 3 atomi di carbonio

Stadio 1: consiste in una serie di riarrangiamenti preparatori, quindi non viene prodotta

energia; infatti per ogni glucosio si consumano due mol di ATP. Queste reazioni iniziali

danno l’innesco, aggiungendo un fosfato su ogni estremità dello zucchero. I gruppi fosfato

saranno utilizzati per la produzione di ATP.

Stadio 2: ha luogo l’ossido-riduzione, l’energia viene conservata sottoforma di ATP e si

formano due mol di piruvato. A questp punto, il piruvato può seguire diverse vie: può

entrare nella fermentazione oppure può essere direttamente ossidato.

Bilancio netto: 2NADH, 2ATP, 2 piruvato 58

FERMENTAZIONE: Durante la formazione di acido 1,3-difosfoglicerico nella glicolisi, due

+

mol di NAD vengono ridotte a NADH. Tuttavia, una cell contiene solo una piccola quantità

+

di NAD , quindi se venisse tutto convertito in NADH, l’ossidazione del glucosio si

+

bloccherebbe. Quindi il NADH viene ossidato a NAD attraverso la formazione dei prodotti

della fermentazione.

Fermentazione alcolica: molti funghi e alcuni batteri, alghe e protozoi fermentano gli

zuccheri a etanolo e CO .

2

Acido piruvico Acetaldeide + CO 2

+ +

Acetaldeide + NADH + H NAD + Etanolo

Il processo viene svolto da funghi unicellulari chiamati lieviti. Inizialmente tali organismi

messi nel substrato di coltura (il mosto, il malto o l'impasto del pane) svolgono una

respirazione aerobica, trasformando gli zuccheri in acqua ed anidride carbonica. Poi,

dall'interno della massa in fermentazione per mancanza di ossigeno, i lieviti passano alla

59

fermentazione sfruttando l'energia degli zuccheri, ossidandoli anaerobicamente (senza

l'utilizzo di ossigeno) in alcol etilico ed anidride carbonica.

Bilancio netto: 2ATP, 2CO , 2etanolo

2

Fermentazione lattica: l’acido piruvico viene ridotto ad acido lattico.

I fermentatori lattici possono essere divisi in:

• Omolattici : utilizzano la via glicolitica e riducono quasi tutto il piruvato in acido lattico

attraverso la lattico deidrogenasi. I batteri omofermentanti come Lactobacillus lactis

producono 2ATP e 2 lattato. I prodotti sono poco aromatizzati.

• Eterolattici : formano notevoli quantità di prodotti diversi, come acido lattico, etanolo,

CO attraverso la via della fosfochetolasi. I batteri etero fermentanti come

2

Leuctonostoc producono 1etanolo, 1lattato, 1CO . I prodotti sono molto

2

aromatizzati.

Batteri lattici: ne sono alcuni esempi:

• Streptococcus, presente nella normale flora della gola

• Enterococcus, presente normalmente nella flora intestinale

• Lactobacillus: presente nella flora della bocca e dell’apparato genitale femminile.

I batteri lattici sono Gram+, in grado di produrre acido lattico quale principale prodotto di

fermentazione. Nella loro struttura mancano di porfirine e citocromi e riescono a ricavare

energia tramite la fosforilazione a livello del substrato. Sono batteri anaerobi, che tollerano

piccole quantità di O (= microaerofili). Hanno diverse richieste nutrizionali, infatti

2

necessitano di aa, vitamine, purine e pirimidine.

Probiotici: sono definiti come «supplementi alimentari microbici vivi, che influenzano

favorevolmente la salute dell’ospite, migliorandone l’equilibrio microbico intestinale».

Svolgono insomma funzione diametralmente opposta agli antibiotici. La comunità batterica

residente nel tratto gastrointestinale umano ha un importante impatto sulle funzionalità

gastrointestinali e in generale sulla salute dell’ospite. Tuttavia, sia condizioni patologiche,

come diarrea, ma anche stress, variazioni della dieta, assunzione di antibiotici, sia

alterazioni fisiologiche dell’intestino, possono avere effetti considerevoli sull’integrità della

flora batterica intestinale. La deplezione della normale flora microbiotica ha effetti negativi

sul benessere dell’ospite e spesso può essere associato ad un’aumentata suscettibilità

alle infezioni batteriche. Per superare i problemi associati alla fluttuazione della microflora

e, in generale, per migliorare la salute dell’ospite, vengono proposte due strategie

principali per modulare la flora batterica dell’ospite:

somministrazione orale di preparazioni microbiche vive, dette probiotici

• assunzione con la dieta di prebiotici (oligosaccaridi non digeribili che hanno un

• effetto stimolatorio sulla flora dell’ospite).

60

I batteri più usati in preparati probiotici appartengono ai generi Bifidobacterium e

Lactobacillus. Tuttavia sono utilizzati anche microrganismi appartenenti ai generi

Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Propionibacterium e Bacillus.

Fermentazione formica: viene effettuata dagli Enterobatteri, i quali metabolizzano l’acido

piruvico e l’acido formico, che viene convertito in H e CO dalla formico idrogenasi.

2 2

HCOOH H + CO

2 2

Esistono due tipi di fermentazione formica:

• fermentazione acido-mista : che ha come risultato la produzione di etanolo e di una

miscela di acidi di cui fanno parte acido acetico, lattico, succinico e formico.

• Fermentazione butandiolica : in cui l’acido piruvico è convertito a acetonio, che

quindi viene ridotto, con il NADH, a 1,3 butandiolo.

Domande:

Una coltura dopo 3 ore di crescita ha una concentrazione cellulare pari a 32000

 cellule /ml. Quale era la concentrazione cellulare al tempo zero, sapendo che G è di

30 minuti?

Una coltura diluita 16 volte e piastrata (0.1 ml) dà origine a 13 colonie. Quale era la

 concentrazione originale della coltura / ml?

Una coltura concentrata 1.2 X 10 7 / ml viene opportunamente diluita e piastrata

 (0.1 ml). Sulla piastra conto 60 colonie. Che diluizioni sono state fatte?

Una coltura concentrata 250 cellule / ml è diluita 5 volte e 0.1 ml sono seminati su

 piastra. Quante colonie ti aspetti di osservare sulla piastra ?

Fotosintesi e respirazione. Come sono legate fra loro?

 Che cos’è la fosforilazione a livello del substrato e a cosa serve? Elencate un

 processo metabolico dove è presente.

Prodotti finiti dal piruvato

 Perché la fermentazione ha resa minore della respirazione?

 NAD e ruolo nella fermentazione e nella respirazione

 Batterio lattico eterofermentante e batterio omofermentate. Differenze.

 Distingui tra catabolismo e anabolismo. Come sono correlati?

 Elenca 4composti che possono essere prodotti dal piruvato ad opera di un

 organismo in grado di fermentare

RESPIRAZIONE : l’ossidazione delle mol libera elettroni e protoni che saranno

indirizzati ad una catena di trasporto degli elettroni. L’acido piruvico ossidato e

decarbossilato entra in Krebs. 61

CICLO DI KREBS: è costituito da una serie di reazioni cicliche nelle quali gli enzimi

- + 2

strappano e e p da ogni gruppo acetile, completando l’ossidazione dl glucosio in CO . Il

substrato del ciclo è acetil-CoA. Da ogni acetile si generano 3NADH, 1FADH, 1ATP per

fosforilazione a livello del substrato. Per ogni molecola di piruvato ossidata vengono

rilasciate tre mol di CO . Inoltre fornisce composti di carbonio (= α-chetoglutarato e

2

ossalacetato) che rappresentano i substrati chiave nella sintesi di mol precursori (aa).

FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA: ha luogo sulla membrana citoplasmatica dei procarioti

(negli euc avviene nei mitocondri). È composta da due parti:

Catena di trasporto degli elettroni : In questo processo gli elettroni trasportati da

• NADH e FADH vengono scambiati dalla catena enzimatica transmembrana, che

2

provvede a sfruttare questo movimento per generare un gradiente protonico.

sintesi di ATP tramite fosforilazione di ADP dall'enzima ATP sintetasi con catalisi

• rotazionale.

CATENA DI TRASPORTO DEGLI ELETTRONI: È costituita da una serie di complessi

proteici e composti lipo -solubil i capaci di produrre un potenziale elettrochimico attraverso

+

la membrana mediante la creazione di un gradiente di concentrazione di ioni H tra i due

lati della membrana. Questo potenziale è sfruttato per attivare i canali di trasporto presenti

sulla membrana stessa e per promuovere la sintesi dell'ATP da parte dell'ATP sintetasi. La

catena di trasporto degli elettroni è coinvolta nei processi della fosforilazione e della

respirazione. -

È costituta da una serie di trasportatori di elettroni che operano per trasferire gli e dai

donatori (NADH, FADH ) agli accettori, come O . Vi sono varie classi di proteine che

2 2

fungono da trasportatori e si trovano legati alla membrana citoplasmatica (negli euc sono

nei mitocondri):

• Flavoproteine : proteine che contengono un derivato della riboflavina, in cui la

porzione flavinica è costituita da un gruppo prostetico viene ridotto quando accetta

atomi di idrogeno e ossidato quando gli elettroni sono passati oltre. Es. FAD. La

riboflavina viene anche comunemente chiamata vitamina B .

2

• Citocromi : proteine con gruppi prostetici costituiti da anelli porfirinici contenenti

ferro. Subiscono l’ossidazione e la riduzione attraverso la perdita o l’acquisto di un

singolo elettrone da parte dell’atomo di ferro al centro del citocromo.

Trasportano gli elettroni da un livello di alta energia ad un livello più basso. Questa

liberazione energetica permette all'ATP-sintetasi di produrre molecole di ATP a

partire da ADP e gruppo P. Sono suddivisi in quattro categorie principali a, b, c, d in

relazione alla loro capacità di trasmettere alcune radiazioni dello spettro visibile che

li fanno apparire colorati:

Citocromo A 600 nm

o Citocromo B 560 nm

o 62

Citocromo C 550 nm

o

• Coenzima Q : detto anche ubichinone, è una molecola organica con una catena

laterale isoprenica molto lunga le proprietà della catena laterale lo rendono molto

-

lipofilo, per cui può fluire lateralmente nella membrana per il trasporto degli e .

• Centro Fe-S : sono proteine non eme in cui gli atomi di atomi di Fe sono associati a

S libero e alla proteina attraverso gli atomi di S residui di cisteina. Una comune

proteina presente nei sistemi biologici è la ferrodoxina.

Possono essere:

Centri 2Fe-2S: presentano due ioni ferro con due atomi di zolfo a fare da

o ponte tra le molecole. I due atomi di ferro sono solitamente coordinati alla

proteina attraverso gli atomi di zolfo di quattro catene laterali di cisteina. In

altri casi, sono coordinati a due atomi di zolfo da cisteina e due di azoto di

istidina.

Centri 4Fe-4S : presentano quattro atomi di ferro con quattro di zolfo a farne

o da ponte. Il ferro, anche in questo caso, viene coordinato dalle catene laterali

di quattro cisteine.

Centri 3Fe-4S : sono essenzialmente identici a quelli 4Fe-4S, ma presentano

o un atomo di ferro in meno. -

Teoria della chemiosmosi ( proposta da Peter Mitchell): i trasportatori di e sono orientati

sulla membrana in modo tale che il processo di trasporto avvenga secondo una

- +

separazione degli e dai p . gli atomi di H rimossi dai trasportatori (es NADH) vengono

- +

scissi: gli e vengono trasportati lungo la catena, mentre i p vengono pompati fuori dalla

cell ciò provoca una acidificazione della superficie esterna della membrana. Quando O è

2

+

ridotto ad H O, questa requisisce H dal citoplasma per completare la reazione, causando

2 - + -

un accumulo di OH all’interno nella cell. Poiché né H né OH possono attraversare la

membrana per diffusione passiva in quanto mol cariche, l’equilibrio non può ristabilirsi

spontaneamente.

Quindi il risultato finale è la generazione di un gradiente di pH e di un potenziale

elettrochimico attraverso la membrana per cui l’interno del citoplasma è negativo ed

alcalino, mentre l’esterno è positivo e acido causano l’energizzazione della membrana.

Tutti i trasportatori sono disposti secondo il loro potenziale di riduzione standard E°: è la

-

tendenza di una coppia redox ad accettare e da quello inferiore (NADH = donatore) a

quello superiore (O = accettore). Quindi, il trasporto, durante il quale si ha rilascio di

2

energia, va da un composto più elettronegativo ad uno meno elettronegativo.

-40 Substrato = glucosio

+

-30 NADH/NAD

-20 Flavoproteine

63

-10 Proteine Fe/S

∞ Chinoni, Citocromi bc

-

+0,10

+0,20 Citocromi c

+0,30

+0,40 Citocromi aa 3

+0,80 O 2

Tappe:

Da NADH a Coenzima Q : il NADH viene ossidato liberando due elettroni e riducendo

1- la FMN a FMNH . Quest'ultima, riossidandosi, trasferisce due elettroni al gruppo

2

prostetico (costituito da centri Fe-S) dell'enzima NADH-coenzima Q reduttasi (o

coenzima Q reduttasi o NADH deidrogenasi o complesso I). I centri Fe-S trasferiscono

3+ 2+

gli elettroni al coenzima Q trasformandolo in QH passando da Fe a Fe .

2

Tappa alternativa: invece che ridurre l'FMN a FMNH si riduce il FAD a FADH . La

2 2

riduzione del FAD tramite ossidazione del succinato a fumarato porta alla

3+

formazione di FADH che viene ossidato dal centro Fe-S (che si riduce da Fe a

2

2+

Fe ). La successiva ossidazione del Fe riduce Q a QH . L'enzima di questa tappa è

2

il succinato-coenzima Q reduttasi (o complesso II)

Questa pompa protonica porta 4 protoni fuori dalla matrice del mitocondrio e abbiamo

un flusso di 2 elettroni per ogni NADH. Nella tappa alternativa non c'è trasporto di

elettroni. + 3+

Da QH a citocromo c : il QH si ossida a Q liberando due H e riducendo il Fe del

2- 2 2

2+ 3+ 2+

citocromo b a Fe che riossidandosi a sua volta riduce i centri Fe-S da Fe a Fe . La

2+ 2+

successiva ossidazione di questi centri riduce il Fe del citocromo c a Fe . Il Fe del

1

3+ 2+

citocromo c riossidandosi riduce il Fe del citocromo c a Fe . L'enzima di questa

1

tappa è il QH -citocromo c reduttasi (o citocromo c reduttasi o complesso III).

2

Durante questa tappa due protoni vengono prelevati dalla matrice e quattro vengono

liberati nel citoplasma mitocondriale.

2+ 3+

Da citocromo c a O ( ciclo Q ): il Fe del citocromo c viene ossidato riducendo il Fe

3- 2 2+

del citocromo a; quest'ultimo riossidandosi riduce il Fe del citocromo a . Il Fe del

3

2+

citocromo a riduce il Cu legato alla citocromo ossidasi (o citocromo c ossidasi o

3 1+ +

complesso IV) a Cu che riossidandosi riduce l'O a H O consumando due H ogni O.

2+ 2

Altri quattro protoni vengono portati dalla matrice al citoplasma.

Complessi proteici: I complessi normalmente associati alla catena di trasporto degli

elettroni sono quattro: 64

Complesso I – NADH deidrogenasi, chiamato anche Coenzima Q reduttasi: questo

• complesso riceve due atomi di idrogeno dal coenzima NADH e li trasferisce

interamente al secondo trasportatore della catena di trasporto degli elettroni, cioè il

Coenzima Q. L'energia ricavata dal passaggio degli elettroni è utilizzata da questo

complesso per trasportare 4 protoni nello spazio intermembrana.

Complesso II – Succinato deidrogenasi: è parte del ciclo di Krebs.

• Complesso III – Complesso del citocromo bc , anche detto Citocromo c reduttasi:

• 1

riceve elettroni dal Coenzima Q e li cede al citocromo c; in seguito trasporta 4

protoni nello spazio intermembrana (ciclo Q)

Complesso IV – Citocromo c ossidasi: è l'ultimo complesso, quello che trasferisce

• gli elettroni direttamente all' ossigeno (proveniente dai polmoni) trasformandolo

+

insieme agli ioni H , in H O. Anche questo trasporta 2 protoni nello spazio

2

intermembrana.

Tutte queste sono complessi lipoproteici che contengono flavina, cluster ferro-zolfo o

rame.

Sintesi di ATP: ATP-sintetasi è l’enzima responsabile della permutazione

della forza proton-motrice in ATP. L’ATPasi contiene una testa con subunità

multiple (F ) posizionata nel versante citoplasmatico e un canale conduttore

1

di elettroni (F ) che attraversa la membrana. Sulla porzione F vi sono 3 siti

0 1

attivi che catalizzano a turno la sintesi di ATP: uno di questi siti si trova in

conformazione β-ATP (che lega ATP), un altro in β-ADP e l'ultimo sito in β-

vuoto (incapace di legare ATP). La forza motrice protonica provoca la

rotazione dell'asse centrale c che entra in contatto con le subunità β.

Ciò causa una modificazione conformazionale cooperativa in cui il sito β-ATP viene

convertito in β-vuoto rilasciando ATP; quindi il sito β-vuoto passa in conformazione β-ADP

che lega debolmente ADP e gruppo fosfato dal solvente e per ultimo il sito β-ADP viene

65

convertito nella conformazione β-ATP a promuovere la condensazione di ADP e P . 

i

questo meccanismo va sotto il nome di catalisi rotazionale.

Bilancio Totale: 38 ATP.

RESPIRAZIONE ANAEROBICA: indica una via del metabolismo energetico in cui la

catena di trasporto degli elettroni usa come accettore finale un composto ossidato diverso

dall'ossigeno. Questo tipo di metabolismo è presente esclusivamente tra i batteri. Gli

accettori finali di elettroni possono essere nitrati, solfati o carbonati. In questo caso il

-

donatore di e è una sostanza organica o inorganica. La resa di ATP, però, è minore, di

circa 30-34 ATP (meno efficiente). 3-

Batteri denitrificanti: utilizzano il nitrato (NO ) come accettore di elettroni riducendolo ad

azoto molecolare (N ). Il nitrato può essere ridotto a nitrito dalla nitrato reduttasi secondo

2

la reazione: 3- - + 2-

NO + 2e + 2H NO + H 0

2

Tuttavia, questo non è un metodo efficiente per sintetizzare ATP in quanto è richiesta una

grande quantità di nitrato per la crescita e il nitrito risulta essere tossico per la cell. Per

questo si passa alla reazione successiva di denitrificazione, in cui si ottiene N .

2

3- - +

2NO + 10e + 12H N + 6H O

2 2

Questo metabolismo energetico è stato studiato in organismi anaerobi facoltativi

appartenenti ai generi Pseudomonas, Bacillus, Thiobacillus, che utilizzano molecole di

nitrato solo quando vivono in carenza di ossigeno (in presenza di ossigeno questi batteri

usano la respirazione aerobica).

La denitrificazione è uno stadio del ciclo dell'azoto, che avviene sia nel suolo che nelle

acque, ed è un processo importante per l'eliminazione dei nitrati, soprattutto negli ambienti

acquatici, dove questi composti possono provocare fenomeni di eutrofizzazione.

Ciclo azoto: N è contenuto nelle proteine, negli acidi nucleici e in molti fattori enzimatici.

Gli animali non sono in grado di utilizzare l’azoto inorganico per produrre i composti

organici azotati, ma sono costretti ad assumerlo dalle piante. N è presente in atm al 79 %,

ma gli organismi autotrofi non sono in grado di utilizzarlo come tale. La trasformazione di

N in NH ad opera delle alghe blu-verdi.

2 4

Quindi NO diventa un fattore limitante in quanto è scarso nel suolo e nell’H O.

3 2

Fasi del ciclo dell’azoto:

• Fissazione N NH : questo processo avviene ad opera di batteri azoto fissatori che

2 3

svolgono questa funzione grazie alle nitrogenasi.

Possono essere:

Liberi = conducono una vita libera, come Azotobacter e Clostridium

o Cianobatteri = alghe verdi blu-verdi come Anamoeba. La reazione avviene a

o livello delle eterocisti per assenza di ossigeno.

66

Simbionti = batteri che realizzano una associazione mutualistica con piante.

o

• Nitrificazione NH  NO , NO = questo processo avviene ad opera dei batteri del

3 2 3

genere Nitrosomonas nel suolo e Nitrococcus nel mare. La formazione dei nitrati è

a carico di batteri del genere Nitrobacter.

• Organicazione NH , NO comp organici azotati = consiste in una complessa serie

3 3

di reazioni metaboliche svolte dalle piante e dai microrganismi che comportano la

formazione di aa, proteine, nucleotidi e acidi nucleici. I nitriti e i nitrati vengono

convertiti in NH dalle piante, in quanto è l’unica forma che sono in grado di

3

assorbire. Tuttavia, la sola concimazione ammoniacale non è sufficiente, in quanto

elevate concentrazioni di NH sono tossiche per le radici. Inoltre NH viene

3 3

facilmente assorbita dal terreno e quindi non è più disponibile per la pianta.

• Mineralizzazione = trasformazione di composti organici azotati in NH . Consiste

3

nell’insieme di processi demolitivi della sostanza organica con formazione di

composti inorganici (H O, CO e sali minerali). Due fasi:

2 2

Ammonificazione = coinvolge l’humus  è resp della liberazione di una parte

o degli elementi in forma inorganica e dalla formazione di composti organici

semplici. 3-

Denitrificazione = NO , NO  N . Coinvolge i composti organici semplici

o 2 2

derivati sia dalla decomposizione dell’humus sia delle macromol complesse.

Batteri solfato-riduttori: A questo gruppo appartengono microrganismi anaerobi obbligat i

appartenenti ai generi Sulfobacteria e Clostridium. In questo caso l'accettore degli elettroni

4= =

è lo ione solfato (SO ) che viene ridotto a ione solfuro (S ). La reazione può essere

schematizzata così: 4= - + =

SO + 8e + 8H S + 4H O

2

La riduzione degli ioni solfato è una tappa del ciclo dello zolfo.

Ciclo zolfo: Lo Zolfo (S) partecipa alla costituzione di aa come cisteina e metionina ed a

quella di altre macromol come biotina, coenzima A, ferridossina, tiamina pirofosfato ecc.

raggruppate sotto il nome generico di tiocomposti. Lo zolfo presente nell'ambiente può

derivare da eruzioni vulcaniche (soprattutto sotto forma di H S), da attività industriali o da

2

incendi che, in seguito alla combustione, liberano in atmosfera ossidi di zolfo (SO ).

2

Questi, grazie ad un processo di ossidazione fotochimica, diventano anidridi (SO ) che, a

3

loro volta, si sciolgono nell'acqua piovana sotto forma di acido solforico (H SO ) il quale si

2 4

4--

dissocia liberando ioni solfato (SO ). Altre sorgenti di zolfo sono minerali come: il gesso

(CaSO *2H O) o la pirite (FeS ). Quest'ultima, in particolare, può essere demolita da un

4 2 2

batterio aerobio tollerante per condizioni acide del terreno (pH ottimale da 3 a 4, ma può

arrivare anche a 0.6) il Thiobacillus thiooxidans:

67

2FeS + 2 H O + O → 2Fe(OH) + 2S

2 2 2 2 2

+ 4--

S + 2H O + 3O → 2H SO → 4H + 2SO

2 2 2 2 4

(entrambi le reazioni liberano energia)

4--

Lo ione solfato (SO ) è la forma in cui lo zolfo viene assorbito dalla maggioranza delle

piante verdi e dei batteri, che poi lo riducono e lo "attivano" per sintetizzare aminoacidi

solforati ed altre molecole. Organismi incapaci di ridurre lo zolfo (e che quindi non

potrebbero produrre queste molecole essenziali) lo assorbono già ridotto sotto forma di

cisteina o acido solfidrico (H S che è tossico per la maggior parte dei viventi). Lo zolfo, una

2

volta organicato, torna al suolo attraverso le demolizioni metaboliche o la morte degli

organismi; a questo punto i tiocomposti vengono degradati da vari microorganismi sia

4--

aerobi che anaerobi fino a SO , nel primo caso, o, rispettivamente, nel secondo caso, a

H S.

2

Batteri metanogeni: L'uso di anidride carbonica (CO ) come accettore di elettroni da

2

parte di microorganismi porta alla produzione di metano (CH ) secondo una reazione

4

(metanogenesi) semplificabile in questo modo:

4H + CO CH + 2H O

2 2 4 2

Accanto a questa via, però questi organismi presentano la possibilità di produrre metano

partendo da composti organici parzialmente ridotti come il carbonio metilico dell'acido

acetico.

I microrganismi in grado di svolgere questo tipo di metabolismo appartengono ad alcune

particolari classi di Archea ed in particolare agli Euryarchaeota.

Idrogenobatteri: Diversi chemiolitotrofi sono in grado di utilizzare come unica fonte di

energia l'idrogeno (H ), un prodotto comune del metabolismo microbico. Sono noti diversi

2

idrogenobatteri che differiscono per l'accettore di elettroni utilizzato. Gli idrogenobatteri che

usano un accettore di elettroni diverso dall'ossigeno effettuano un tipo di respirazione

anaerobica che discuteremo più avanti. Gli idrogenobatteri sono chemiolitotrofi facoltativi

capaci di crescere sia come chemiorganotrofi in presenza di composti organici, sia come

chemiolitotrofi attraverso l'ossidazione di H . Dal punto di vista tassonomico e filogenetico

2

gli idrogenobatteri appartengono a gruppi di batteri diversi. Gli idrogenobatteri quando

crescono in condizioni di autotrofia, ossidano H con la seguente reazione:

2

6H + 2O + CO > (CH O) + 5H O

2 2 2 2 2

dove CH O indica il materiale cellulare allo stato ossidazione dei carboidrati.

2 +

L’enzima idrogenasi catalizza l'ossidazione di H con trasferimento degli elettroni al NAD

2

o al chinone. Gli elettroni introdotti nella catena di trasporto degli elettroni a livello del

68

NADH o del chinone ridotto vanno incontro a reazioni di trasporto con la formazione di una

forza motrice dei protoni e di ATP prodotto mediante una ATPasi di membrana.

Molti batteri incapaci di autotrofia possono ossidare H come unica fonte di energia. Per

2

esempio, Escherichia coli può utilizzare H come fonte di energia ma non può crescere in

2

presenza di CO come unica fonte di carbonio. In presenza di H , è necessario fornire a E.

2 2

coli un composto organico come fonte di carbonio. Gli organismi che utilizzano un

composto inorganico come fonte di energia ed uno organico come fonte di carbonio

vengono talvolta definiti anche mixotrofi.

Quando gli idrogenobatteri si comportano da autotrofi, fissano la CO attraverso il ciclo di

2

Calvin. In presenza di composti organici, la sintesi degli enzimi del ciclo di Calvin viene

repressa, mentre vengono indotti gli enzimi coinvolti nell'utilizzazione del composto

organico. Negli idrogenobatteri, la regolazione del metabolismo chemiolitotrofo è molto

fine e specifica; l'espressione genica viene regolata sia da elementi del metabolismo del

carbonio sia da elementi del metabolismo energetico.

Quindi, il destino del piruvato (ad es in E. coli) può essere così riassunto:

• In presenza di O  respirazione aerobica

2

• In presenza di O e di NO  respirazione anaerobica

2 3

• In assenza di entrambi fermentazione.

Gli organismi possono essere classificati in base alle loro richieste metaboliche:

69

Domande:

Schema di Hbatteri

 Enzimi chiave della sintesi di ATP

 Quale donatore inorganico di e- viene usato da nitrosomonas e quale da

 nitrobacter?

Differenza tra batteri s-red e batteri ox-s

 Esempi di batteri chemioautotrofi e donatori di e-

 E. Coli: metabolismo aerobico e anaerobico

FOTOSINTESI: i microrganismi producono energia catturando l’energia luminosa che

utilizzano per sintetizzare ATP e NADH. Generalmente un organismo fotosintetico riduce e

incorpora CO .

2 6CO + 6H 0 + Fotoni C H O + 6O

2 2 6 12 6 2

Può essere:

• Ossigenica : svolta da piante, alghe, cianobatteri = H O + CO  CH O + O

2 2 2 2

• Anossigenica : svolta da batteri = 2H S + CO  CH 0 + 2S

2 2 2

La fotosintesi consta di due fasi:

• Fase alla luce , in cui l’energia luminosa è catturata e convertita in energia chimica.

È dipendente dalla luce. In questa fase viene assorbita luce e viene prodotto

ossigeno.

• Fase oscura, in cui avviene l’organicazione della CO 2.

Tutti gli organismi possiedono i pigmenti necessari all’assorbimento della luce, tra cui:

• Clorofille = sono dei grossi anelli planari costituiti da 4 anelli pirrolici sostituiti con un

atomo di Mg coordinato a 4 atomi centrali di N. Negli eucarioti sono presenti la

clorofilla a, che assorbe la luce blu-violetta e rossa (picco assorbimento = 665 nm)

e la clorofilla b, che assorbe soprattutto la luce blu e arancione (picco assorbimento

= 645 nm).

• Carotenoidi = si dividono a loro volta in:

Caroteni , che sono idrocarburi privi di ossigeno

o Xantofille , che contengono ossigeno.

o

Il tipico colore dei carotenoidi, che spazia dal giallo pallido all'arancione fino al

rosso acceso, è una diretta conseguenza della struttura molecolare di questi

composti. Le catene polimeriche che li compongono son infatti caratterizzate dalla

presenza di doppi legami , che interagiscono tra di loro permettendo agli elettroni

degli atomi interessati di muoversi più liberamente; all'aumentare dei doppi legami

70

nella catena, aumenta anche la libertà di movimento degli elettroni. Questo fatto fa

si che lo spettro della luce assorbita da queste molecole diminuisca; come

conseguenza di ciò, aumenta la lunghezza d'onda della luce riflessa, ed essa

appare perciò di un colore tendente al rosso.

Le clorofilla e i carotenoidi sono assemblati in sistemi organizzate chiamati antenne, il cui

scopo è quello di ampliare la superficie in grado di catturare la luce. L’energia luminosa

catturata da un’antenna viene trasferita da clorofilla a clorofilla fino a raggiungere una

-

clorofilla detta centro di reazione coinvolta nel trasporto degli e .

I gruppi di clorofilla assemblati vengono anche detti fotosistemi. Si possono distinguere:

• Fotosistema I : il cui centro di reazione è eccitato ad una lunghezza d’onda di 700

nm.

• Fotosistema II : il cui centro di reazione è eccitato alla lunghezza d’onda di 680 nm.

Trasferimento non ciclico degli elettroni: 71


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
Università: Pavia - Unipv
A.A.: 2014-2015

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher chiaramof di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Microbiologia generale e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Pavia - Unipv o del prof Riccardi Giovanna.

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