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pipistrelli. La sorgente a volte coincide con il serbatoio, si intende chi o cosa

nel

direttamente ci trasmette questo microrganismo, ma non sempre è la stessa cosa,

caso di Ebola, l’infezione non si otteneva direttamente dai pipistrelli ma da animali

infettati da essi che poi venivano macellati . Per l’uomo la sorgente principale è il

soggetto malato, che eliminando il microrganismo rischia di infettare altri soggetti

suscettibili a tale infezione, abbiamo altre figure che anche non essendo malate,

hanno l’infezione in varie fasi e possono comunque trasmetterla, è il caso di un

portatore sano. Ci possono essere soggetti sorgente che trasmettono

l’infezione nel periodo di incubazione, cioè quel periodo che decorre da quando il

microrganismo entra nel soggetto a quando si manifestano i primi sintomi. Il

portatore precoce è il soggetto che è in fase di incubazione, per alcuni

microrganismi, la fase di trasmissibilità comincia in questo periodo (chi prima e chi

dopo) e per altri no. Non per tutte le infezioni esistono i portatori precoci. Ci sono quei

soggetti che hanno superato la malattia ma continuano ad eliminare i microrganismi

diventando sorgente di infezione, è un processo che dura anni. La salmonella si va a

localizzare dall’intestino alla cistifellea, quest’organo viene difficilmente raggiunto

dagli antibiotici, quindi dopo una tale terapia non è detto che il batterio sia stata

debellato completamente, nel caso non fosse stato completamente eliminato dagli

antibiotici, si troveranno sue tracce per anni in feci e bile, qui si parla di portatore

convalescente. Infine ci sono soggetti che non sviluppano proprio la malattia, sono i

portatori asintomatici, sono sempre infetti ma non presentano i sintomi della

malattia. Le infezioni croniche sono dovute a microrganismi che rimangono nell’ospite

per tempi lunghissimi, e quindi durante questo periodo il soggetto è sorgente di

infezioni. Alcune infezioni possono essere trasmesse direttamente da

soggetto infetto a soggetto suscettibile, altre vengono trasmesse tramite un

veicolo che come dice il nome serve per veicolare il microrganismo dal soggetto che

lo elimina al soggetto suscettibile, sono i fomiti, sono gli alimenti, l’acqua, tutti questi

sono veicoli, qualcosa di inanimato che porta microrganismi da un soggetto ad un

altro. Il soggetto che ha già avuto salmonellosi elimina il batterio tramite feci, se tali

feci infettano cibo o acqua, questi diventeranno veicoli per le infezioni. Concetto

diverso è quello di vettore, un animale, che rappresenta un elemento

indispensabile per la trasmissione dell’infezione, il microrganismo in questione non è

in grado di uscire dall’ospite ed andare ad infettare un altro soggetto e quindi ci vuole

un vettore, in genere un insetto ematofago che preleva il microrganismo, si replica

all’interno del vettore, aumentando la sua carica microbica, passa nella saliva

dell’insetto ed al successivo pasto di sangue, passa nel nuovo ospite insieme alla

saliva che l’insetto usa per dilatare il capillare, per riuscire a prenderlo con l’ago .

Classico esempio è la malaria, malattia da vettore, ed il vettore è la zanzara

Anopheles, che succhiando sangue da un malato, lo trasmette ad un soggetto sano,

quindi per far sì che tale infezione si diffonda nella popolazione è necessaria la

presenza di un vettore che completi il ciclo vitale del microrganismo. Quindi non si ha

la trasmissione diretta (uomo-uomo), ma si ha quella indiretta (uomo-vettore-uomo).

In Italia la malaria è stata eradicata come in quasi tutta l’Europa negli anni ’50,

utilizzando un disinfettante per eradicare la zanzara Anopheles. Tale disinfettante era

un pesticida molto potente, il DDT, estremamente tossico anche per l’uomo, anche se

negli ultimi mesi ci sono stati casi di malaria con trasmissione autoctona.

Trasmissione autoctona vuol dire che è avvenuta in Italia, dovuta ad importazione

da turisti che hanno fatto un viaggio all’estero ed hanno portato il microrganismo in

Italia insieme alle zanzare, ed infatti la zanzara Anopheles sta tornando in Italia, tutto

ciò dovuto all’importazione, creando la possibilità di diffondere nuovamente la

malattia. 9

Lezione 2

Le vie di trasmissione dei microrganismi: Orizzontale e Verticale.

VERTICALE: può avvenire in qualsiasi fase della gravidanza, per cui si suddivide

questo tipo di trasmissione in prenatale, perinatale e postnatale.

Prenatale (in utero): durante la gravidanza alcuni microrganismi passano la placenta

e infettano il feto. Sono pochi, perché una delle funzioni principali della placenta è

quella di isolare il feto da eventuali agenti patogeni, in più, è presente anche il sacco

amniotico, che isola il feto dal canale del parto, quindi i microrganismi che superano

queste barriere lo fanno solo attivamente. Nel loro complesso, i microrganismi che

attraversano la barriera placentare sono indicati come TORCH:

T = toxoplasmosi e treponema pallidum. Il toxoplasma gondii, protozoo, è in

 grado di compiere il suo ciclo solo nel gatto, dove arriva alla sua forma

trasmissibile. Con le feci del gatto viene eliminata la forma patogena, per cui è

possibile la trasmissione all’uomo nel caso di bambini che toccano qualsiasi

cosa o se non vengono utilizzati guanti e dispositivi di protezione nel momento

della pulizia della cassetta del gatto. Questo protozoo va a localizzarsi nei

muscoli degli animali, dove rimane silente: se introduciamo carne cruda o poco

cotta ingeriamo queste spore che nell’organismo poi si riattivano nella loro

forma patogena. Nell’individuo immunocompetente non causa malattia, mentre

negli immunodepressi ha conseguenze, talvolta gravi, così come nelle donne

gravide non immuni. Il treponema causa la sifilide, malattia a trasmissione

sessuale. Essa dà un’infezione cronica in cui il microrganismo può rimanere

silente o evolvere e dare manifestazioni cliniche;

O = others, quindi altri virus che sono in grado di passare la placenta

 (parvovirus B19, HBV epatite B, HCV epatite C, Lysteria batterio che

solitamente si trasmette tramite alimenti, causa listeriosi, in gravidanza causa

seri problemi al feto);

R = rosolia (virus). E’ una malattia esantematica della prima infanzia (cioè che

 dà manifestazioni cutanee come macchie o vescicole, papule)

C = citomegalovirus (famiglia degli herpes virus). Negli immunocompetenti

 causa al massimo malattia respiratoria blanda, ma se contratto da soggetti

immunodepressi o in gravidanza dà problemi. Esistono esami di laboratorio che

permettono di rintracciarlo in gravidanza, ma sono a carico della paziente;

H = herpes virus HSV2 (herpes genitale), VZV (varicella zoster).

Il bambino cresce in ambiente sterile, ma dal momento del parto entra in contatto con

microrganismi provenienti dall’ambiente esterno. La gravidanza è però

un’immunodepressione fisiologica, la donna quindi si infetta più facilmente e queste

malattie possono risultare più gravi. Il primo trimestre è il più critico perché si verifica

l’embriogenesi, quindi un’infezione provocherebbe disfunzione delle cellule che sono

in formazione. Spesso in questo caso il feto muore. Nel secondo e terzo trimestre

l’esito è sempre piuttosto grave: più avanti l’infezione si verifica, meglio è, ma

comunque le conseguenze sono gravi perché il feto non è ancora in possesso di un

Esempio: la rosolia può infettare qualsiasi distretto,

sistema immunitario proprio.

causando microcefalia, problemi sensoriali come cecità e sordità, problemi

cardiocircolatori, epatite. Nel migliore dei casi il neonato risulterà solo molto debole,

con qualche difficoltà di sviluppo. 10

Perinatale (al momento del parto, intrapartum): il bambino passa nel canale del

parto, in comunicazione con esterno, esso presenta una flora microbica che può essere

sia normale che sede di microrganismi patogeni. Inoltre, il feto viene a contatto con

grosse quantità di sangue della madre, che può infettarlo.

Sono infezioni localizzate alla mucosa vaginale:

Gonorrea: malattia a trasmissione sessuale, si manifesta solo nell’uomo con

 un’intensa secrezione purulenta, nella donna è asintomatica, per cui è facile

non accorgersi di essere infette. In questo caso, il bambino nasce e contrae

l’infezione, che va a localizzarsi nella cornea e potrebbe portare alla cecità. Per

questo motivo, si segue una profilassi che impone di somministrare al neonato

un collirio con un antibiotico;

HSV2 (herpes simplex): dà encefalite associata ad altre manifestazioni gravi,

 il bambino spesso muore o ha conseguenze per tutta la vita;

Papilloma virus: si manifesta con verruche purulente. Il bambino viene a

 contatto con il tessuto infetto della madre ma al momento della nascita non ha

manifestazioni. Solo in età adolescenziale svilupperà delle verruche, i cosiddetti

PAPILLOMI, nella laringe. Questi papillomi possono molto facilmente evolvere in

carcinomi della laringe;

Streptococco agalactie: germe presente normalmente nella flora microbica

 vaginale, ma se contratto dal bambino può evolvere in setticemia per il neonato

che si estende a tutto l’organismo, diventando una malattia sistemica;

HBV, HCV, HIV.

Per prevenire la trasmissione, si esegue un parto cesareo e non vaginale. In questo

modo, il bambino non entra in contatto con la mucosa vaginale quindi non contrae

nessuna infezione.

Postnatale (allattamento, microrganismi presenti nel latte, goccioline di saliva della

madre). Sono ad esempio l’HIV, per cui per evitare la trasmissione verticale, oltre al

parto cesareo, è vivamente consigliato l’allattamento artificiale.

ORIZZONTALE: Diretta: il microrganismo passa direttamente dall’infetto al soggetto

veicolo

suscettibile; Indiretta: si interpone un (oggetto inanimato o alimenti) o un

vettore (animale). L’infetto, in questo caso, elimina il microrganismo che contamina

veicoli o vettori e poi si trasmette ai soggetti suscettibili.

La facilità di trasmissione di un microrganismo dipende da:

Resistenza del microrganismo nell’ambiente: se poco resistente, è possibile solo

- la trasmissione diretta; se il microrganismo è poco resistente infatti si inattiverà

velocemente, perdendo la sua capacità di infettare.

Numero di microrganismi eliminati: tanti più ne eliminiamo, tanto più facile è la

- trasmissione. Dipende dalla via di ingresso, in quanto alcune facilitano la

Ad esempio nel caso della

diffusione di un’infezione, altre sono meno favorevoli.

via aerea, non è molto facile contenere l’infezione, perché chiunque parlando o

respirando elimina microrganismi. Quindi, la diffusione tramite secrezioni

respiratorie è molto facile, mentre risulta più difficile in casi come quello della

diffusione sessuale. 11

Via di eliminazione: per essere infettati ad esempio attraverso feci, ci deve

- essere un contatto diretto, il che non è sempre possibile. In questo modo

l’infezione risulta più rara.

Il soggetto infetto deve eliminare il microrganismo, e questo non avviene

- sempre. Nelle infezioni da vettore, ad esempio, l’infetto non elimina il

microrganismo, che rimane localizzato nell’apparato circolatorio e sarà

necessario un ulteriore vettore che prelevi sangue e lo passi ad una seconda

persona.

N.B.: la via di ingresso determina SOLO come il microrganismo è entrato, non è detto

che esso rimanga in questo distretto. Ad esempio, HIV non dà infezione nelle vie

genitali ma è un’infezione sistemica, sebbene entri nell’organismo attraverso i genitali.

HBV HCV si interessano del fegato.

Trasmissione DIRETTA

Trasmissione sessuale, quindi per via venerea;

 Parenterale (è una via di trasmissione che facilita il microrganismo, che in

 questo caso entra direttamente nei tessuti profondi quindi non deve superare le

difese dell’ospite come cute, mucose, ecc. Si ritrova già pronto a provocare,

eventualmente, la malattia). Questo tipo di trasmissione si verifica ad esempio

con inoculazione con strumenti che penetrano in profondità, trasfusioni o

trapianti;

Contatto con materiale infetto (sangue, visceri);

 Trasmissione aerea ravvicinata;

 Trasmissione verticale.

Altri meccanismi di trasmissione sono:

Trasmissione aerea parlando e respirando eliminiamo goccioline di saliva, le

emissioni forzate come colpi di tosse e starnuti secernono microrganismi molto più

concentrati e molto più veloci. Le goccioline hanno diverse dimensioni, contengono

acqua, che favorisce la sopravvivenza dei microrganismi (tutti tranne i virus la

necessitano). Le gocce più grosse fanno meno strada perché più pesanti mentre quelle

minori di 100 µm rimangono in sospensione e nel loro nucleo, leggerissimo, sono

presenti i microrganismi. Arrivano anche a 40m di distanza. La dimensione condiziona

anche il percorso della goccia: particelle più grosse rimangono bloccate nelle vie

respiratorie più alte, agli alveoli arrivano solo quelle più piccole di 3µm. è per questo

che le gocce più pericolose sono quelle di dimensioni minori.

Trasmissione oro-fecale microrganismo entra dalla bocca, percorre tutto il tubo

il

digerente e viene poi eliminato tramite le feci, che contaminano alimenti e acque. I

microrganismi a trasmissione oro fecale devono essere molto resistenti, perché tra

contaminazione dell’alimento e consumo può passare parecchio tempo. In più, essi

devono superare la barriera acida dello stomaco, dove il pH è a 3,2. Dopo il duodeno,

l’ambiente si trasforma da estremamente acido ad estremamente alcalino (pH>10. In

più nello stomaco arriva la BILE, che contribuisce a degradare i microrganismi non

commensali. Alcuni alimenti sono facilmente infettati perché buon substrato per la

12

I molluschi poi vengono spesso consumati crudi,

crescita di batteri (brodo, latte, uova).

e sono pericolosi perché funzionano da filtri: introducono acqua, trattengono al loro

interno la materia organica ed eliminano poi l’acqua. I microrganismi sono quindi

concentrati nel mollusco che, se non cotto in modo adeguato, molto spesso funziona

da veicolo per l’infezione. I vegetali possono essere stati concimati con liquame,

oppure vengono lavati con acqua contaminata. Importantissimo lavare bene le

verdure anche se già pronte all’uso. Inoltre più un alimento è stato manipolato, più

sarà stato contaminato.

INFEZIONI DA VETTORI (indiretta)

I vettori sono, nella maggior parte dei casi, insetti ematofagi. Trasmettono l’infezione

acquisita dal soggetto infettato al non infetto. Il vettore è indispensabile, al contrario

del veicolo, perché nel vettore avviene una tappa del ciclo biologico del

microrganismo, si moltiplica e si va a concentrare nella saliva, che ha un’azione pro-

infiammatoria sul corpo umano (vasodilatazione).

Le infezioni da vettori sono sostenute da virus, batteri e protozoi; più difficilmente da

funghi.

Alcune volte però, l’insetto funziona da VEICOLO e non da vettore: in questo

caso si parla di vettori ospiti o meccanici. Questo tipo di vettore funziona solo da

tramite: il microrganismo non infetta l’insetto, ma si deposita semplicemente sulle sue

parti esterne come ali o zampe. L’insetto vola e si posa dappertutto, depositando così

il microrganismo che in questo modo si diffonde. Questo concetto è alla base delle

ad esempio, le mosche sono attratte dagli escrementi animali,

infezioni alimentari:

che sono pieni di microrganismi, se si depositano poi sui cibi possono eventualmente

trasmettere l’infezione.

Gli arbovirus sono virus che vengono trasmessi agli uomini da vettori artropodi. Il

nel 2007 circa ci sono stati

West nile è un arbovirus trasmesso dalla zanzara comune,

casi anche in Italia, generalmente provoca febbre benigna che passa in pochi giorni

ma può evolvere nella forma neuro invasiva che causa microcefalie. Nel 2008, ci sono

stati casi a Bologna e Ferrara. Questo virus si trova negli uccelli e viene trasmesso

dalla zanzara. Le zone in cui è presente sono Emilia Romagna, Veneto, Lombardia,

Sardegna: qui è presente stabilmente. Nei periodi in cui ci sono le zanzare, si

controllano obbligatoriamente tutte le sacche di sangue ed espianti per verificare che

non siano presenti arbovirus. Malaria e Arbovirus sono i virus principali delle infezioni

da vettore (17% malattie infettive, provocano 100.000 morti l’anno, sono in continua

espansione a causa di cambiamenti climatici e surriscaldamento globale, ma anche

per la deforestazione che altera l’ambiente in cui sono abituati a vivere, per cui la

nicchia ecologica si estende, oppure la presenza di insetti nei container che girano

tutto il mondo). Ad esempio, la zanzara tigre è arrivata in Italia solo agli inizi degli anni

2000 nei container di pneumatici riciclati.

Le ZOONOSI sono infezioni con serbatoio in animali, hanno una difficile trasmissione

agli umani ma in alcuni casi si trasmettono (rabbia), oppure ci infettano per via

alimentare (carne o derivati contaminati). Esempi classici sono le salmonelle presenti

nelle uova, formaggi non stagionati, latte e derivati; West nile con serbatoio abituale

un uccello (poi l’insetto trasmette); Zoonosi virali, batteriche, fungine e parassitarie.

Gli insetti vettori di malattie esotiche vengono introdotti in Italia tramite: Container;

Animali viaggiatori trasmettono le infezioni che portano a lunga distanza (epidemia

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dell’influenza aviaria del 2003, H5N1, arrivato in Europa dalla Cina grazie agli uccelli

migratori).

Le principali vie d’ingresso dei microrganismi:

PELLE NO, è una barriera protettiva grazie allo stato cheratinico, che non

 permette la crescita dei virus e dei batteri. Sede di difficile infezione;

MUCOSE, via di ingresso principale. In comunicazione con l’esterno,

 fisiologicamente contaminate, hanno sia una flora batterica normale

indispensabile, sia una flora potenzialmente patogena. Le mucose hanno

anch’esse sistemi di difesa, come barriere fisiche, chimiche e immunologico;

LESIONI il microrganismo riesce ad entrare direttamente in via parenterale.

BATTERI

Sono cellule procarioti, con moltissimi ribosomi. Questo perché la velocità di

replicazione nei batteri è molto rapida, quindi devono essere in grado di produrre

un’enorme quantità di proteine.

MEMBRANA CELLULARE: doppio strato fosfolipidico + proteine integrate, i lipidi non

sono gli stessi delle membrane umane, però hanno la stessa costituzione. Questa

membrana delimita il citoplasma e regola gli scambi tra interno ed esterno, ma la sua

caratteristica principale è la presenza di invaginazioni di forme irregolari dette

MESOSOMI. Questi entrano in gioco nella divisione, perché permettono di produrre la

membrana necessaria per formare il setto tra le due cellule figlie nel processo di

citodieresi. La fosforilazione ossidativa avviene sulla membrana cellulare, grazie ai

mesosomi viene notevolmente aumentata la superficie in grado di produrre energia.

Da questo deriva che più la cellula è metabolicamente attiva, più mesosomi saranno

presenti per bilanciare la produzione di ATP. Inoltre, i mesosomi servono alla sintesi

delle spore.

ACIDO NUCLEICO: il protoplasma contiene la singola molecola di DNA a doppio

filamento circolare, super avvolta (viene chiamato cromosoma batterico). Sul

cromosoma ci sono tutte le informazioni per i caratteri indispensabili alla vita del

batterio, in più può essere presente DNA extra-cromosomico organizzato in strutture

dette plasmidi. Questi non sono sempre presenti quindi i caratteri che portano non

sono essenziali alla vita del batterio. Queste informazioni aumentano la resistenza del

batterio, oppure gli permettono di metabolizzare substrati di norma non

metabolizzerebbe. Alcuni possono conferire resistenza ad antibiotici, sono facili da

trasmettere.

Lezione 3

Un aspetto importantissimo è che i ribosomi batterici sono diversi rispetto a quelli di

una cellula eucariote, hanno un coefficiente di sedimentazione pari a 70S, con una

subunità di 50S e una di 30S, è importante sottolineare questo aspetto perché se le

cellule del nostro organismo fossero uguali a quelle batteriche non esisterebbero

molecole in grado di distinguere le cellule batteriche. I batteri sono bersaglio degli

antibiotici. Ci sono diversi classi di antibiotici che hanno come bersaglio i ribosomi.

Unici altri organuli che possono essere presenti, ma non sempre, sono i vacuoli che

possono avere la funzione di accumulo di sostanze di riserva, generalmente polimeri

(ad es. glicogeno), da cui produrre energia o per racchiudere in un compartimento una

qualche attività enzimatica importante per la cellula che deve essere limitata per

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evitare che l’attività si disperda e agisca su altri bersagli. Infine alcuni batteri per poter

muoversi presentano vacuoli gassosi, a seconda di quanto si gonfiano e sgonfiano

permette al batterio di muoversi.

Il citosol è circondato dalla membrana costituita dal doppio strato

fosfolipidico con le proteine inserite. La membrana limita il citoplasma e regola gli

scambi tra interno ed esterno (diffusione semplice, facilitata). Gli antibiotici

raggiungono l’interno della cellula batterica attraverso questi meccanismi, alcuni

meccanismi di resistenza agli antibiotici si instaurano proprio a questo livello, cioè le

pompe vanno incontro a mutazioni, che fanno sì che non internalizzino più

l’antibiotico. La membrana è coinvolta nella formazione di vescicole di esocitosi nella

liberazione di componenti, molto importante è la liberazione delle esotossine (tossine

batteriche prodotte nel citoplasma e poi rilasciate dal microrganismo). Infine la

membrana sintetizza i componenti delle strutture che si trovano al suo esterno: la

parete batterica.

PARETE BATTERICA: conferisce la forma tipica del batterio e soprattutto protegge la

cellula batterica dall’osmosi: i batteri possono trovarsi in qualsiasi ambiente compreso

quello acquatico, quindi devono avere un sistema di protezione. La parete batterica

è bersaglio del lisozima, che fa parte dei meccanismi di difesa innati in quanto

costituisce una barriera di difesa per la colonizzazione da parte di microrganismi; il

lisozima è una glicosidasi, divide i componenti del peptidoglicano. Tutte le secrezioni

(saliva, lacrime, liquidi genitali) contengono lisozima. La componente base della

parete batterica è il peptidoglicano. Grazie alla diversità della parete cellulare, si

distinguono i Gram + dai Gram -. Lo spazio peri-plasmatico è interposto tra il

peptidoglicano e la membrana fosfolipidica. Nei Gram + vi è uno spesso strato di

peptidoglicano lunghissime catene, intrecciate tra di loro e legate tramite legami

trasversali, formando una vera e propria rete tridimensionale estremamente compatta

e spessa; nella parete dei gram + ci sono altre molecole come gli acidi teicoici e

lipoteicoici che rappresentano tossine e sono importanti antigeni che vengono

riconosciuti dal sistema immunitario. Nei Gram – la struttura del peptidoglicano è

molto sottile e inoltre vi è un numero inferiore di legami tra le catene del polimero,

quindi si tratta di una struttura meno compatta che esternamente presenta però

un’altra struttura, chiamata appunto membrana esterna.

Il peptidoglicano è un polimero formato dal ripetersi di unità dimeriche ciascuna

costituita da una molecola di n- Acetilglucosammina e una di acido N-

acetilmuraminico, che sono tra loro legati da un legame delta 1,4, è questo il legame

che viene tagliato dal lisozima che quindi rompe le unità disaccaridiche. A ciascuna di

queste unità è attaccato un piccolo peptide (5 AA) che consente di formare ponti

trasversali, quali si formano tra filamenti diversi, non solo tra filamenti paralleli,

formando così una struttura tridimensionale. Gli ultimi due AA del penta-peptide sono

D-Alanine. Questa struttura disaccaride + penta-peptide è presente nel momento in

cui si sta formando il peptidoglicano, una volta che il penta-peptide si è attaccato con

l’altro filamento, viene rilasciata l’ultima D-Alanina, quindi durante la formazione del

ponte per consentire il legame si perde l’ultima Alanina. Il legame crociato si forma dal

terzo AA, che a quel punto è diventano il penultimo. I ponti trasversali sono diversi nei

Gram - dai Gram +. Per quanto riguarda i Gram +, legato all’ acido N-

acetilmuramico c’è il penta-peptide che ha già perso l’ultima D-Alanina, dal terzo che è

la lisina si forma il ponte trasversale, costituito da 5 glicine legate da quello che si

chiama ponte di penta-glicine. Quest’ultimo rappresenta il legame che collega il terzo

AA di una catena laterale di un filamento con il quarto AA del penta-peptide della

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catena parallela. Le penta-glicine collegano la Lisina di un disaccaride alla D-Alanina

del disaccaride del filamento parallelo. In realtà questo tipo di legame può formarsi in

filamenti diversi e non solo paralleli. In mezzo a questo reticolo tridimensionale vi è la

presenza degli acidi teicoici e lipo-teicoici, una struttura più articolata. Per quanto

riguarda i Gram –, il penta-peptide è formato da AA diversi e in questo caso non si

forma il ponte di penta-glicine, ma il terzo AA del penta-peptide di una catena si lega

direttamente, quindi con un legame peptidico, al quarto AA di una catena parallela. Si

tratta di un legame più semplice, senza il ponte di penta-glicine.

Nei Gram - esternamente vi è la membrana esterna, che è un’organizzazione a doppio

strato fosfolipidico in cui sono inseriti componenti importanti come proteine che

fungono da canali: le porine, che regolano l’ingresso e l’uscita di molecole, ed è

presente il LIPO-POLISACCARIDE (LPS). La porzione lipidica di LPS è quella che si

affonda nel doppio strato fosfolipidico, tenendo ancorata la catena polisaccaridica,

prende il nome di lipide A e contiene 4 catene di acidi grassi, ed è la porzione

E' l’endotossina tipica dei Gram – che contribuisce all’azione di danno

tossica di LPS.

provocato sulle cellule (è un fattore di virulenza). Tutti i Gram – hanno segni comuni

che sono dovuti proprio alla presenza di LPS . Al lipide A segue una lunga catena

polisaccaridica che è formata da due porzioni, una costante in tutti i batteri Gram –

che prende il nome di CORE (sono una decina di zuccheri) in seguito vi è la porzione

terminale che può essere di lunghezza variabile e prende il nome di POLISSACCARIDE

-O, questa coda è diversa non solo nelle diverse specie dei Gram – ma anche nei

diversi sierotipi della stessa specie. Quindi quando si parla di sierotipo denominato da

O- seguito da un numero, significa che è stato identificato tramite questa

diversificazione dell’antigene O, che è un antigene importantissimo contro cui viene

Ad esempio le Salmonelle sono enterobatteri Gram –

costituita la risposta immunitaria.

che sono appunto identificati tramite questo antigene.

La sintesi del peptidoglicano avviene in tre comprarti diversi: citosol,

membrana citoplasmatica, e all’esterno, sulla parete che si sta formando. La sintesi

parte da N-acetilglucosammina che, attraverso diversi passaggi, viene legata all’acido

N-acetilmuramico e al penta-peptide, tutto questo avviene nel citoplasma.

Dopo di che si lega ad un vettore lipidico, avviene una reazione ciclica in cui si ha la

liberazione del mattone che costituisce il peptidoglicano, sull’altro versante della

membrana. Qui avvengono una serie di reazioni chiamate transpeptidazione che

permettono di allungare il perimetro e attaccare ciascuna subunità a quella

successiva, permettendo di formare i ponti crociati tra un filamento e l’altro. L’insieme

delle reazioni avviene sulla parete che si sta formando e sono determinate da un

insieme di enzimi che si chiamano Transpeptidasi, anche dette PDP proteine leganti le

Penicilline, perché l’azione delle penicilline si esercita su questi enzimi. Ciascuna fase

di formazione del peptidoglicano, inoltre, può essere inibita da vari antibiotici, già la

primissima fase, quella in cui l’acido N-Acetilglucosammina viene coniugato all’acido

fosfoenolpiruvato, è inibita dalla fosfomicina, anche la fase della formazione del penta-

peptide viene inibita da ciclo-serina.

Esternamente alla parete ci può essere uno strato più o meno spesso costituito

capsula

da glucidi e proteine che prende il nome di . La capsula non è una

strutturata come le membrane e svolge varie funzioni, è un’importante fattore di

virulenza perché presenta le adesine, molecole che permettono l’adesione del batterio

alle superfici (se non vi è adesione non vi è infezione, ma si parla solo di contatto). Se

È stato

un batterio ha la capsula quindi è avvantaggiato nel processo infettivo.

effettuato un esperimento nel quale è stata inoculata una determinata quantità di

16

batterio (Pneumococco Pneumonie) non capsulato nell’animale e lo stesso batterio

capsulato. L’inoculazione del batterio capsulato comportava la morte dell’animale,

mentre l’inoculazione del batterio senza capsula anche in grande quantità non

causava la morte dell’animale. È un fattore di virulenza anche per un altro motivo:

impedisce al batterio di essere fagocitato, quindi favorisce l’evasione dalla risposta

immunitaria. Essendo fortemente glicosilata, questa struttura trattiene l’acqua il che è

estremamente importante in quanto permette la sopravvivenza anche in ambienti in

cui vi è scarsità di acqua. Nella capsula rimangono intrappolati gli antibiotici.

le appendici,

Altre strutture opzionali sono cioè strutture che sporgono dalla

superficie della membrana del batterio, possono essere:

flagelli, utili per il movimento, sono molto lunghi, sono pochi (1-8), hanno un

 movimento a colpo di frusta, di conseguenza il movimento non sarà mai

rettilineo ma a zig zag. Questo movimento può essere direzionato da un

gradiente di nutrienti. Un movimento regolato dalla concentrazione di una

sostanza chimica è denominato chemiotassi;

fimbrie o pili, più corti dei flagelli e molto più numerosi, in genere disposti su

 tutta la superficie del batterio, utili per agganciarsi e quindi aderire ad un

tessuto e fanno parte delle adesine (molecole di adesione), sono molto efficaci,

permettono di resistere ai flussi di liquidi che ci possono essere in un tessuto

(ad es. nelle infezioni urinarie, nell’uretra vi è un continuo passaggio di urina

con getto forte, se i batteri non avessero la capacità di resistere al flusso

verrebbero espulsi);

pilo sessuale, più lungo rispetto ai pili normali ed è unico, si chiama pilo

 sessuale perché svolge un ruolo fondamentale in un processo genetico

denominato Coniugazione. Il pilo sessuale di una cellula si attacca formando un

ponte ad un’altra cellule e queste possono scambiare materiale genetico.

Le dimensioni dei batteri sono circa 1µm o poco meno di 1 µm fino a 5 µm. A seconda

della forma, data dalla parete batterica, si hanno:

cocchi, batteri sferici, che possono essere raggruppati a coppie (diplo), possono

 essere legati a catenelle (strepto) o raggruppati a grappoli (stafilo);

bacilli, di forma allungata, se sono bacilli corti un po’ rotondeggianti prendono

 il nome di coccobacilli;

spirilli, batteri con forma spiraliforme (come la sifilide);

 vibrioni, a forma di falce.

Conoscere la forma del batterio è estremamente utile all’esame microscopico,

addirittura in alcuni casi la sola osservazione al microscopio può permettere di

effettuare la diagnosi abbastanza precisa e iniziare la terapia. Ad esempio per la

meningite si può avere un’idea se si tratta di Streptococco Pneumonie (unici

diplococco Gram +) o Neisseria meningitidis (unici diplococco Gram -) o da

Haemophilus influenzae (bacilli gram -).

REPLICAZIONE BATTERICA

La replicazione batterica avviene per scissione binaria che porta alla formazione di due

cellule figlie con lo stesso corredo cromosomico della cellula madre, in realtà pur

essendo una replicazione asessuata possono avvenire mutazioni genomiche per cui vi

è un’evoluzione delle specie batteriche. La divisione cellulare può avere una durata di

anche solo 5-10 minuti fino a 30, tranne alcune eccezioni come ad esempio i

17

micobatteri che presentano una parete particolare che comporta una replicazione

lenta.

Inizialmente vi è un ingrossamento della cellula e quindi un aumento del volume,

quando si raggiunge il volume soglia, inizia la replicazione del DNA che avviene

esattamente come la replicazione del DNA delle cellule eucariote, utilizzando la DNA

Polimerasi e tutto il corredo enzimatico. Si duplica il cromosoma, circolare chiuso,

avvolto in super elica.

Il cromosoma è attaccato ad un prolungamento della membrana citoplasmatica

(mesosoma) ed a un certo punto i due cromosomi si separano tra loro. La membrana

cellulare è importante nella divisione perché allungandosi, viene sintetizzata della

neomembrana, formando il setto che porterà a dividere le due cellule, consentendo la

separazione. Se la membrana si allunga i due cromosomi ovviamente si allontanano

sempre più. Via via che si allunga la membrana, parallelamente è coinvolta nella

produzione di peptidoglicano che deve rivestire il setto. Quando le cellule saranno

complete sarà completa anche la loro parete batterica. Durante il processo di

divisione cellulare si formano le spore. Non tutti i batteri sono in grado di produrre

spore, ma solo due generi che riguardano la patologia umana e vengono detti batteri

sporigeni e sono il genere Bacillus e il genere Clostridium, ciascuno contiene dei

batteri importanti responsabili di infezioni gravissime. Tra i Bacillus vi è il Bacillus

anthracis, questo batterio produce una tossina che colpisce tutti gli organi. Il

Bacillus cereus, responsabile di infezioni alimentari e produce tossine che

danneggiano la mucosa intestinale. Tra i Clostridium vi è il Clostridium tetani

(tetano) e Clostridium botulino (botulino) che causano malattie derivante dalla

tossina prodotta dai batteri ed entrambe agiscono sul sistema nervoso (neurotossine).

La tossina tetanica causa paralisi spastica, contrazione contemporanea a tutti i

muscoli che possono causare frattura delle ossa o morte per blocco respiratorio,

invece la tossina botulinica causa paralisi flaccida, quindi incapacità di tutti i muscoli

di contrarsi. Il tetano lo si contrae con ferite che si sporcano di terriccio, perché nel

terriccio ci sono le spore del batterio, ad esempio eliminate dalle feci di animali come

cavalli; la spora che entra nella ferita da origine alla cellula attiva che inizia a produrre

la tossina. La tossina botulinica viene introdotta per via alimentare, in questo caso

quindi viene introdotta direttamente la tossina e questo si verifica con le conserve,

soprattutto quelle fatte in casa in quanto possono essere non correttamente

sterilizzata, la bollitura non protratta sufficientemente comporta che al centro del

barattolo non si è raggiunta la temperatura adeguata per inattivare il Clostridium, ma

anzi da questo calore viene stimolata la spora a passare allo stato di cellula vegetativa

che produce la tossina. Un altro batterio è il Clostridium difficile, estremamente

diffuso nella zona microbica intestinale e normalmente non crea problemi, ma in

soggetti immunodepressi o negli anziani può dare origine a forme di diarrea

gravissime, è resistente a quasi tutti gli antibiotici, per cui le infezioni da clostridium

difficile possono portare a morte ed è una delle infezioni maggiormente contratte in

ambienti ospedalieri.

CARATTERISTICHE DELLA SPORA

All’interno della spora non è presente acqua, quindi non possono avvenire reazioni

enzimatiche, dal punto di vista metabolico è inattiva, la respirazione è al minimo, per

garantire la sterilizzazione viene utilizzato il processo dell’autoclave. Sono

estremamente resistenti a sostanze chimiche e alle radiazioni. Dal punto di vista

antigenico ci sono antigeni specifici della spora. Il processo di formazione della spora

prende il nome di Sporulazione e poiché si formano all’interno della cellula prendono

18

il nome di endospore. Il processo di sporulazione si verifica quando ci sono condizioni

Per esempio se si

sfavorevoli. La sporulazione avviene solo nell’ambiente esterno.

vuole indurre la sporulazione nei batteri coltivati, bisogna aspettare che si esauriscono

tutti i nutrienti contenuti nel terreno, la curva di crescita dei batteri presenta una fase

esponenziale poi una fase latente (dove non si moltiplicano più) e infine i batteri

vanno incontro a morte. Quindi quando il terreno si è esaurito, una parte inizierà a

produrre spore un’altra andrà incontro a morte. Nel momento in cui si vengono a

creare le condizioni ottimali si ha la Germinazione, cioè il batterio dalla forma di

spora passa alla forma vegetativa. Il citoplasma della molto condensato, la cromatina

è addensata, esternamente a questo si ha un residuo di peptidoglicano e segue uno

spesso strato di CORTEX, componente più dura e consistente della spora, contiene una

grossa quantità di Sali di calcio e una grossa quantità di acido dipicolinico che è un

componente esclusivo della spora. Successivamente sono presenti due membrane,

una interna e una esterna, che sono formate sia da proteine stabili, sia da lipidi, sia da

residui di peptidoglicano. Infine vi è uno spesso rivestimento esterno che prende il

nome di esosporio, formato da più strati di membrane lipidiche e acidi teicoici. La

spora presenta molti rivestimenti contenenti molecole che stabilizzano questa

struttura rendendola resistente e impenetrabile. A seconda di dove si forma la spora

se altera o meno la struttura del batterio si hanno vari tipi di spore. La sporulazione è

legata al processo di divisione cellulare, nel momento in cui inizia la divisione il setto

non si divide esattamente nella posizione centrale ma risulta eccentrico, i due

cromosomi si separano e uno rimane nella porzione più piccola. Nel frattempo la

porzione più piccola va incontro alla trasformazione in spora: si condensa il DNA, si

comincia a perdere acqua a questo punto cominciano ad essere prodotti i vari

componenti:

Primo strato o esosporio;

 Secondo strato o tunica, strato rigido di natura proteica che conferiscono

 stabilità e resistenza alla struttura;

Terzo strato o cortex: strato di residui di peptidoglicano;

 Quarto strato o core: DNA, ribosomi, acido dipicolinico.

Tutto questo è ancora contenuto all’interno della parete batteriche, quindi c’è un

batterio contenente la spora.

La cellula che riveste la spora prende il nome di sporangio, quando la spora è matura

vi è la lisi dello sporangio con liberazione della spora. Il tutto è un processo molto

lungo in quanto richiede la sintesi di molti componenti, va dalle 10 alle 20 ore.

Nella fase della germinazione, la corteccia comincia a perdere calcio e acido

dipicolinico diventando quindi più sottile e formando delle crepe, l’acqua così inizia a

penetrare e le attività enzimatiche iniziano a riprendere, il batterio comincia a

produrre soprattutto peptidoglicano. La cellula comincia a crescere, si ingrandisce, così

tanto che non può essere più contenuta nei rivestimenti della spora, si ha cosi la

fuoriuscita della cellula in forma vegetativa. Le condizioni per cui può avvenire la

germinazione (impiega 90min) possono essere colpi di calore, shock termico, crea

delle crepe e quindi comincia ad entrare acqua (come per il Clostridium botulinico)

altri meccanismi sono il trovarsi in condizioni favorevoli come nutrienti che possono

penetrare all’interno della spora, radiazioni ionizzanti, trovarsi in ambiente acquatico e

quindi quando c’è acqua c’è vita. In generale le spore sono estremamente importanti

perché rappresentano spesso il meccanismo di trasmissione all’uomo.

Lezione 4 19

I virus sono parassiti intracellulari obbligati, submicroscopici e

subcellulari:

Parassiti intracellulari obbligati in quanto sono in grado di replicarsi

• solo ed esclusivamente all’interno di un’altra cellula;

Submicroscopici presentano delle dimensioni da essere visibili col

• microscopio elettronico;

Subcellulari presentano un’organizzazione più semplice e primitiva di quella

• cellulare.

I virus sono particelle infettanti, infatti sono in grado di infettare qualsiasi tipo di

cellula che sia essa procariotica o eucariotica. Presentano sempre un solo acido

nucleico, DNA (desossiribovirus) o RNA (ribovirus), e per questa loro caratteristica

non sono in grado di attuare autonomamente qualsiasi tipo di biosintesi. Non

possiedono un meccanismo di divisione binaria, si replicano per aggregazione di

componenti prodotte all’interno della cellula ospite.

Un’altra caratteristica dei virus è non poter accresce la propria dimensione quindi

una volta prodotti rimangono tali per tutta la durata della loro emivita, tuttavia col

passare del tempo i virus vanno incontro ad un processo di degradazione finché non

sono più in grado di infettare.

I virus umani più piccoli hanno un diametro introno ai 20 nanometri (o poco meno)

(parvus

infatti fanno parte della famiglia Parvoviridae in latino significa piccolo), si

arriva fino a quelli più grossi ovvero i Poxvirus (primo tra questi il virus del vaiolo)

che hanno delle dimensioni di qualche centinaio di nanometri che significa appena al

di sotto del potere di risoluzione del microscopio ottico.

Struttura del Virus

L’acido nucleico è contenuto in un rivestimento proteico, detto capside, composto da

proteine semplici virus-codificate ovvero le informazioni genetiche per sintetizzarlo si

trovano sul genoma del virus. Una parte di virus è costituita da solo questi due

elementi, si parla quindi di virus nudi. Nel caso in cui ci siano altri rivestimenti si

parla di virus rivestiti, essi presentano un rivestimento più esterno al capside

mantello),

denominato envelope o peplos (dal greco si tratta di una membrana

formata dal doppio strato fosfolipidico con inserite delle glicoproteine. Si origina dalla

membrana biologica della cellula infettata, tuttavia le proteine che troviamo in questa

struttura sono virus-specifiche, quindi codificate da geni virali, perciò la parte lipidica

è di derivazione cellulare mentre le proteine cellulari vengono sostituite con

glicoproteine virali. Non sempre i virus rivestiti presentano un rivestimento

organizzato, bensì presentano proteine posizionate in maniera amorfa, non

organizzate in strati ben definiti; questo tipo di struttura prende il nome di matrice.

CAPSIDE: ha la caratteristica di essere estremamente resistente in quanto le proteine

virali sono organizzate in modo tale da determinare una struttura altamente stabile.

Questa disposizione permette alle proteine di annullare le cariche superficiali della

membrana, quindi le proteine virali si dispongono in modo tale da ottenere la struttura

termodinamicamente più favorevole ovvero quella che richiede il grado maggiore di

energia per essere disgregata, in condizioni normali questa struttura non va incontro a

degradazione spontanea. Il capside si compone di un’aggregazione di unità proteiche

singole, le quali prendono il nome di protomeri; alcuni virus costituiscono il proprio

capside utilizzando un unico tipo di protomero, mentre altri possono utilizzare diversi

tipi di protomeri che si assemblano tra di loro per formare delle subunità che prendono

20

il nome di capsomeri; queste strutture possono essere composte da 5 o 6 elementi,

parliamo quindi di pentomeri o esameri.

Siccome le proteine virali sui capsidi presentano un’organizzazione regolare mirata

all’eliminazione delle cariche superficiali, ne derivano delle strutture geometriche

molto precise. La maggior parte dei virus presenta un capside che rientra in due tipi

di geometrie:

1. Icosaedrica che presenta 3 assi di simmetria, è di una struttura formata da

almeno 20 facce triangolari equilateri dove il lato del triangolo che costituisce

spigolo

ogni faccia prende il nome di dell’icosaedro, invece dove si incontrano

vertici.

più facce dell’icosaedro si parla di In realtà i capsidi di geometria

icosaedrica sono molto più complessi di quanto descritto; infatti presentano

generalmente più di 20 facce e non corrispondono perfettamente a triangoli

equilateri, ciò che ne deriva è più riconducibile ad una sfera; spesso in

microscopia elettronica appaiono rotondeggianti. Nel capside notiamo delle

subunità esagonali, corrispondenti agli esameri, mentre ai vertici dell’icosaedro

sono presenti delle strutture pentameriche; si formano partendo dall’unione di 5

subunità che formano il vertice, ciascuna di queste viene circondata dagli esoni

che si aggregano tra di loro e si forma il capside. Quindi il vertice dell’icosaedro

è la struttura da cui parte l’assemblaggio dei virioni. Questo tipo di geometria è

tipica delle tipologie di virus che hanno un capside di almeno due protomeri.

2. Elicoidale che corrisponde ad una simmetria più semplice rispetto a quella

icosaedrica, ed è tipica di quei capsidi che si formano per il ripetersi di un unico

tipo di protomeri quindi non sono presenti nella struttura i capsomeri. Tutti i

virus presentano un genoma a RNA infatti non esistono virus a DNA con questa

simmetria, siccome il filamento di RNA sintetizzato dai virus all’interno della

cellula ospite è un filamento singolo è per questo molto sensibile all’attività

digestiva delle ribonucleasi. Per proteggere il neo-filamento man mano che

esso viene assemblato vi si attaccano i protomeri che formano il capside,

quindi si tratta di due processi che avvengono contemporaneamente. Si tratta

di uno stratagemma che i virus a RNA hanno escogitato a protezione del

proprio genoma. I protomeri tipici di questa simmetria presentano una sorta di

avvallamento dove l’RNA va a stabilirsi in conseguenza ad opportuni segnali,

quindi l’acido nucleico presenta un andamento elicoidale i protomeri che

Un esempio di questa

costituiranno il capside ne seguiranno l’andamento.

simmetria si può trovare nel virus del mosaico del tabacco che è stato il

primo virus ad essere scoperto alla fine dell’800 da parte di un botanico russo

che stava appunto studiando una malattia delle foglie di tabacco, egli

osservando dei campioni fu in grado di vedere un tipo di microrganismo nuovo,

che battezzò con il nome di virus, esso in quanto vegetale presenta rigido e

privo di envelope. Al contrario i virus animali sono sempre rivestiti con

envelope.

Quindi basta ricordare che se virus ha simmetria elicoidale allora è un virus a RNA e,

se si tratta di un virus animale, sarà sicuramente rivestito da envelope.

Che forma hanno i virus?

I virus a simmetria icosaedrica, se osservati al microscopio presentano a grandi linee

tutti la stessa forma a meno che ci sia l’envelope; quindi l’unica possibilità di

distinguerli è misurarne il diametro ed osservare se sono localizzati nel citoplasma o

nel nucleo. Se si presenta l’envelope la situazione si complica, essendo una struttura

21

chiusa il virus può assumere forme anche molto diverse. L’osservazione con il

microscopio elettronico può aiutare nella distinzione:

Forma di proiettile  rhabdovirus (virus della rabbia)

 Forma molto allungata, parecchie centinaia di nanometri  virus ebola

 Forma reniforme  virus influenzali

 spicole (spike)

Forma a corona  coronavirus presentano delle corrispondenti ad

 una glicoproteina

Simmetrica icosaedrica con envelope  herpes virus, è distinguibile da altri virus

 con la stessa forma perché questo presenta una matrice particolarmente densa

Virus icosaedrico nudo, dai cui vertici parte un filamento detto fibra del

 pentone  adenovirus

Utilità dei rivestimenti (capside, matrice ed envelope)

La prima funzione è quella di proteggere l’acido nucleico da agenti fisici e

chimici. Essi permettono all’acido nucleico di passare da una cellula all’altra;

infatti se non fossero presenti queste protezioni ogni volta che entrerebbe in un

liquido intracellulare (sede di RNAasi e DNAasi) andrebbe incontro a distruzione.

Il passaggio da una cellula all’altra viene permesso da questi meccanismi di

protezione non è casuale, infatti permettono il passaggio tra cellule considerate

giuste; non tutte le cellule permettono la replicazione del virus. Su queste

strutture di protezione sono localizzati dei recettori specializzati nel

riconoscimento delle cellule utili alla proliferazione del virus, in questo modo si

viene a formare un legame specifico tra le due componenti.

Queste strutture di protezione presentano un’importanza fondamentale

nell’ingresso del virus all’interno della cellula da infettare. Se si vuole far

entrare in una cellula dell’acido nucleico esogeno, si deve forzare la membrana

utilizzando sostanze che la compaginino in modo da creare dei varchi

attraverso cui l’acido nucleico possa poi entrare. Per permettere l’ingresso si

possono utilizzare anche dei campi elettrici, la cosiddetta elettroporazione.

Quindi far sì che la componente esogena penetri nella cellula essa deve essere

danneggiata, per quanto riguarda la membrana.

La matrice, quando è presente, corrisponde alla proteina più abbondante della

particella virale; stabilizza il capside all’interno dell’envelope (si trova solo nei virus

rivestiti). Il suo compito è impedire interazioni dirette tra capside ed

envelope, potrebbe destabilizzare questa morfologia, da immaginare come un

cuscinetto isolante posizionato tra le due strutture. Guida il processo di

fuoriuscita del virus, quel processo con cui il virus arriva ad acquisire l’envelope, è

grazie ad una prima interazione che essa ha con il capside e successivamente di una

seconda interazione che ha con le proteine dell’envelope che il virus è in grado di

rivestirsi.

Resistenza dei virus nell’ambiente esterno

Per ambiente esterno si considera tutto ciò che si trova all’esterno di una cellula

ospite. Si è parlato di persistenza e resistenza, non di vita o di morte in quanto

parlando di virus è molto complicato stabilirne la morte, si parla di quanto un virus è

in grado di mantenere la propria capacità di infettare organismi diversi. Questa

capacità può variare molto tra i virus in quanto ne esistono tipologie in grado di

resistere poche ore mentre altri resistono per mesi. La variabilità di questa

persistenza deriva dalle caratteristiche del virus stesso: 22

Presenza o assenza dell’envelope;

 Dimensioni: i virus più grossi sono più fragili dei virus di piccole dimensioni;

 Quante proteine compongono l’envelope dei virus rivestiti: più proteine sono

 presenti nella struttura più la stabilizzano.

La variabilità della resistenza del virus in ambiente esterno può dipendere

anche da caratteristiche dell’ambiente stesso:

Temperatura: infatti con più essa e alta con più sarà facile che il virus vada

 incontro ad inattivazione;

Umidità: non condiziona molto la resistenza dei virus anche se comunque gioca

 a loro favore (più importante per la sopravvivenza dei batteri);

Superficie su cui il virus viene a contatto: una superficie di tipo poroso permette

 una resistenza maggiore rispetto a superfici completamente lisce;

Presenza di enzimi degradativi.

I virus nudi risultano essere molto più resistenti rispetto ai virus rivestiti poiché

l’envelope a causa della sua natura lipidica risulta essere una struttura di facile

degradazione; infatti i lipidi vengono degradati da molte lipasi presenti negli

organismi. Possono resistere anche mezz’ora/un’ora anche alla temperatura di

50/60°C alcuni addirittura per qualche minuto a 100°C, resistono molto bene anche a

pH estremi. Al contrario i virus vestiti sono più labili, però hanno una resistenza molto

variabile. HBV è uno dei virus più resistenti in assoluto, anche più dei virus nudi.

Questa particolare resistenza è dovuta al fatto che il suo envelope è particolarmente

infarcito di proteine e questo permette che si stabilizzi di più rispetto ai rivestimenti di

altri virus. Un materiale biologico infettato da questo tipo di virus può mantenere la

propria capacità infettiva anche per 6 mesi a 30°C (temperatura ambiente),

addirittura può resistere 4 ore a 60°C; è resistente a moltissimi disinfettanti come ad

esempio l’alcool, anche altre sostanze solitamente utilizzate a concentrazioni

abbastanza esigue, le quali devono essere utilizzate in modo più intensivo. Lo stesso

ragionamento si può fare con un’altra famiglia di virus, i coronavirus, che presentano

delle proteine che rendono l’envelope una struttura estremamente stabile quindi

anche questo tipo di virus presentano un elevato grado di resistenza in ambiente

esterno. Lo stesso vale per virus rivestiti dell’influenza, i quali presentano un grado

di resistenza che permette di persistere in ambiente esterno anche per alcuni giorni;

sono in grado di contaminare una superficie e renderla veicolo di infezione per diversi

giorni.

Quindi il fatto che un microrganismo possa resistere a lungo nell’ambiente esterno

per esempio i virus rivestiti non possono

condiziona il meccanismo di trasmissione,

portare nell’ospite virus gastrointestinali poiché il pH acido dello stomaco, il pH

alcalino del duodeno e la bile con i sali biliari (specifici per l’emulsione dei grassi) sono

mirati alla disgregazione dell’envelope. Infatti tutti i virus responsabili di questo tipo di

infezione sono dei virus nudi che resistono anche nell’ambiente esterno.

I virus rivestiti, soprattutto quelli più fragili, devono trasmettersi per modalità diretta

ovvero il virus non deve soggiornare all’esterno quindi deve essere trasmesso per

rapporto sessuale, trasfusione, trapianto d’organi oppure nel caso di virus respiratori

per uno scambio diretto di saliva.

Il genoma virale

Il genoma virale può essere costituito da DNA o RNA, alcuni virus presentano un tipo

di acido nucleico che durante il processo replicativo all’interno della cellula ospite

diventi l’altro genoma quindi: virus a DNA con un intermedio replicativo a RNA (HBV) e

23

viceversa sono i retrovirus presentano RNA che però dopo l’ingresso nell’ospite viene

retro-trascritto in DNA. DNA ed RNA possono essere a singolo filamento o doppio; sono

in circolazione virus (HVB) che presentano una parte doppio filamento e una a singolo

filamento (una molecola più lunga appaiata ad una molecola più corta). Quando si

parla di virus con genoma a singolo filamento è necessario indicare la polarità di

quest’ultimo (positiva o negativa) per definizione si considera:

Polarità positiva quella che si legge in direzione 5’  3’ quindi con la stessa

 polarità dell’mRNA

Polarità negativa quella che si legge in direzione 3’  5’

Questa diversa polarità condiziona la strategia replicativa, in quanto un virus che nel

capside presenta un RNA a singolo filamento a polarità positiva funziona egli stesso

come mRNA del virus, il quale non dovrà sintetizzarlo; viceversa se un virus presenta

nel capside un genoma a RNA a singolo filamento a polarità negativa dovrà

trascriverlo prima in RNA positivo (mRNA), in quanto corrisponde all’anti-sequenza

dell’mRNA, e poi andrà a sintetizzare le proteine. Esistono anche dei virus con una

parte della molecola genomica che presenta una parte della molecola con polarità

positiva e una parte con polarità negativa.

Per quanto riguarda l’organizzazione spaziale possiamo avere:

- genoma lineare quindi una singola molecola con gli estremi liberi;

- genoma circolare chiuso quindi una singola molecola circolare chiusa

come nel caso dei plasmidi batterici;

- genoma circolare aperto come troviamo nel genoma di HBV che è

parzialmente bicatenario con un intermedio replicativo a RNA ed è circolare

aperto in quanto gli ultimi due nuclei esterni della sequenza non si legano tra di

loro ma semplicemente si sovrappongono,

- genoma segmentato (famiglia dei virus influenzali) i caratteri invece di essere

diffusi su un’unica molecola sono suddivisi in tante molecole più piccole,

ciascuna che codifica per una proteina, questi sono detti segmenti mono-

cistronici. Questa caratteristica conferisce a questi tipi di virus una capacità di

scambiarsi dei segmenti e quindi di acquisire caratteristiche diverse da quelle

questo è il meccanismo che rende possibile la formazione di virus che

originali,

compaiono all’improvviso in una popolazione che non possiede gli anticorpi

necessari per difendersi dall’infezione.

Le dimensioni del genoma sono molto inferiori rispetto a quelle delle altre cellule

procariote. Le dimensioni del genoma virale è correlata alle dimensioni totali del virus

e la complessità del genoma stesso.

Un fenomeno importantissimo per la sopravvivenza dei virus è la compattazione

genica infatti un virus con il proprio genoma originario non sarebbe in grado di

ad esempio

sintetizzare tutto il corredo proteico di cui necessita per la sopravvivenza,

HBV che possiede un genoma di piccole dimensioni è in grado di sintetizzare

solamente 8/9 proteine quindi come si può ben capire è assurdo pensare che ad ogni

gene sia affidata la sintesi di una e una sola proteina del corredo . Per questo motivo i

virus sono in grado di sfruttare al massimo il loro patrimonio genetico, uno stesso

pezzo di acido nucleico viene utilizzato per codificare più proteine utilizzando

meccanismi diversi; per i virus invece di parlare di geni, sì parla di ORF (Open

Reading Frame). Questi ORF corrispondono a “cornici” di acido nucleico a lettura

aperta, ovvero un segmento di acido nucleico che può essere letto in vari modi dando

origine a proteine diverse; ad esempio è possibile 24

- più siti di inizio della trascrizione;

- più codoni di stop in modo da interrompere la trascrizione a livelli diversi;

- trascrizione sovrapposta e quindi che una stessa porzione di genoma

venga utilizzata e sia in grado d trascrivere più proteine;

- formazione di una poli-proteina ovvero una proteina che viene tagliata da

enzimi per formare altre proteine, questi tagli non avvengono sempre negli

stessi punti.

Quindi nel caso di un virus non si può dire che un segmento di RNA o DNA è

un gene in quanto può codificare per più proteine (eccetto i segmenti

monocistronici).

Mutazione Virale

Essendo il genoma virale aploide anche una singola mutazione (eccetto mutazione

nonsense), corrisponde alla sintesi di una proteina con una sequenza

amminoacidica differente da quella originaria. Per i virus, le mutazioni

corrispondono ad un meccanismo per favorirne la sopravvivenza; queste

mutazioni sono importanti per studiare il funzionamento dei virus in questione

perché, tale mutazione fa perdere la capacità di sintetizzare una proteina e si

acquisisce la capacità di sintetizzarne un’altra.

Parlando di replicazione virale si intende un’aggregazione di componenti, quindi da

una cellula infettata da una singola particella virale possono originarsene moltissime.

Ogni fenomeno genetico relativo alle particelle virali risulta accelerato rispetto a

quello di una cellula, e grazie a questa velocità che una singola mutazione può essere

efficace in tempi brevissimi sulla popolazione virale. Anche tra gli stessi virus

esistono differenze tra la frequenza in cui avvengono le mutazioni

genetiche, infatti i virus a DNA presentano la stessa frequenta di mutazioni delle

8 11

cellule (1 nucleotide mutato ogni 10 -10 inseriti), poiché la replicazione del genoma

in alcuni

virale a DNA segue le stesse strategie della replicazione del DNA cellulare;

casi, il virus divide esattamente a metà tutto quello di cui la cellula dispone per

replicare il proprio DNA; quindi utilizzano la DNA-polimerasi che per sua caratteristica

ha attività di correzione dei miss-match (corregge le mutazioni = i nucleotidi variati).

Al contrario i virus a RNA utilizzano l’enzima RNA-polimerasi che non ha attività di

correzione dei miss-match (neanche l’RNA-polimerasi cellulare presenta

quest’attività) quindi sono più frequenti arrivando più o meno ad 1 nucleotide ogni

4

10 inseriti. Questo permette di andare incontro a processi evolutivi più velocemente

come può ad esempio capitare per la variazione del tropismo. Il tropismo può

essere di due tipi:

- tropismo di organo o tessuto che corrisponde alla specificità di una

particella virale di posizionarsi ed agire in un organo /tessuto dell’ospite

(l’epatite ha un tropismo per la zona epatica);

- tropismo di specie che corrisponde alla specificità di una determinata

particella virale di infettare un tipo di organismo (esclusivo) o diversi tipi di

organismi (non esclusivo).

UNA MUTAZIONE DEL TROPISMO DI UNA PARTICELLA VIRALE, PUO’ RENDERLA

PIU’ INFETTIVA

Parlando di variazione di tropismo favorevole alla capacità infettiva di un virus si

prende come esempio il virus ebola; tipico nei pipistrelli, si è adattato benissimo

all’organismo ospite, provoca infezioni asintomatiche; può, successivamente ad

opportune mutazioni genetiche, acquisire la capacità di infettare altre specie e

25

provocare infezioni gravi nell’uomo. Un altro esempio è il virus dell’influenza

aviaria comunissimo negli uccelli ai quali non provoca alcun tipo di problema, ma in

caso di opportune mutazioni può acquisire la capacità di infettare l’uomo con effetti

devastanti.

Quindi più è alto il tasso di mutazioni maggiori sono le possibilità che il virus ha di

diffondersi anche in specie diverse con conseguenze di gravità variabile.

La capacità di un virus all’interno di un ospite di andare incontro a mutazioni può dare

diversi tipi di vantaggi: sviluppare resistenza agli anticorpi dell’organismo ospite

i quali impiegano più tempo ad adattarsi alla mutazione. Questa mutazione del

genoma scatena una rincorsa del sistema immunitario dell’ospite ed è tipica delle

infezioni croniche; sviluppare resistenza a determinati farmaci e terapie,

perché ogni farmaco/terapia è mirata ad agire su determinati bersagli e nel caso

mutino non sono in grado di eliminarli.

Prendendo in considerazione le mutazioni a cui può andare incontro un virus si è

iniziato a parlare di fitness ovvero quanto quel determinato virus è stato in grado fino

a quel momento di adattarsi all’ospite che ha infettato e quanto in esso è in grado di

replicarsi con facilità.

Esistono delle mutazioni che aumentano la fitness, mentre altre la diminuiscono infatti

in seguito ad alcune mutazioni può capitare che il virus perda totalmente o in parte

alcune capacità quali potersi replicare utilizzando i processi replicativi dell’ospite che

fino al quel momento era stato in grado di utilizzare. O addirittura mutazioni che

mutazioni letali

rendano il virus incapace di replicarsi in qualsiasi ospite ( ).

Quindi una mutazione che determina un aumento della fitness avrà un aumento della

replicazione e quindi, a causa dell’aumento della velocità replicativa del virus

modificato sulle altre popolazioni di virus presenti, la popolazione di virus modificato

prevarrà sulla popolazione di virus non modificato; si crea quindi una barriera

selettiva. Nel caso in cui si verifichi una mutazione che va a diminuire la fitness di un

determinato virus, questa popolazione verrà “schiacciata” dalle altre popolazioni,

sparirà dall’organismo ospite. In conclusione una mutazione si fissa in una

popolazione se è in grado di aumentarne il fitness con l’ospite. Nonostante le

quantità enormi di particelle virali presenti in un organismo sottoposto a terapia per

inibirne la replicazione, basta che se ne venga a formare solo una resistente a quel

tipo di terapia per far sì che in pochissimo tempo all’interno di quell’organismo si

Il virus HIV con

possa rilevare solo quel tipo di popolazione mutata resistente.

genoma composto da RNA, che presenta quindi una frequenza di mutazioni molto

alta, risulta essere molto particolare in quanto è in grado di eseguire la retro-

trascrizione ovvero è in grado di sintetizzare DNA a partire da RNA attraverso la retro-

trascrittasi inversa che oltre a non avere un’attività di controllo nei confronti dei miss-

match possiede un meccanismo di funzionamento che è soggetto a mutazioni. Questi

due fattori uniti insieme nel complesso sistema di replicazione del virus aumenta

notevolmente la frequenza di mutazioni genetiche, si arriva addirittura all’aumento di

10 volte rispetto alla frequenza replicativa dei normali virus a RNA. HIV possiede circa

10000 basi ed una frequenza di mutazione di 1 ogni 10 , ciò vuol dire che ogni

4

genoma avrà da 1 a 10 mutazioni; questo fa sì che all’interno di un soggetto con

un’infezione cronica da HIV non esista una particella virale che abbia lo stesso

genoma delle altre particelle presenti. Le differenze tra i genomi delle varie particelle

virali sono minime. Queste variazioni se considerate in percentuale sono poche quindi

si parla di quasi-specie. Quindi un soggetto infettato da HIV avrà una quasi-specie

26

dominante, che costituisce quasi la totalità della popolazione virale presente, poi una

miriade di quasi-specie più o meno differenti dalla quasi-specie predominante.

Nonostante vi sia la predominanza di una quasi-specie su altre non è una situazione

stabile ed immutabile, visto che le mutazioni avvengono con frequenza si evolve

continuamente; le variazioni possono avvenire senza causare conseguenze anche se

l’aspetto principale è: una volta che la quasi-specie dominante verrà bloccata dal

sistema immunitario si avrà la prevalsa di un’altra. Lo stesso problema si riscontra

con la resistenza ai farmaci: una volta inibita l’azione della quasi-specie dominante si

avrà la prevalsa di un’altra quasi-specie immune alla terapia; questo rende

impossibile per le conoscenze attuali trovare un vaccino in grado di eliminare

completamente le particelle virali di HIV. Attualmente esistono delle terapie mirate,

che cambiano nel tempo per tenere bassa la carica virale del virus agendo man mano

su un tipo di quasi-specie diverso.

La Replicazione Virale

La replicazione di un virus è composta da tappe , che avvengono

contemporaneamente o sono sfasate di un tempo pressoché nullo. Avendo a

disposizione poco materiale, utilizzano i meccanismi della cellula che infettano

pirateria molecolare

per portare a termine la propria replicazione ( ); si crea

un’interazione tra le componenti virali e quelle cellulari, ma questi meccanismi

cellulari non si sono sviluppati nel tempo per adattarsi a questo tipo di

interazione al contrario è il virus che col tempo è stato in grado di evolversi in

modo tale da aggirare i meccanismi di difesa cellulari. Le fasi sono:

1. Attacco del virus alla superficie della cellula: il virus per poter entrare

nella cellula ospite deve creare un legame con la membrana cellulare del

un

bersaglio. Non si attaccano casualmente, ma possono legarsi solo a cellule con

recettore per il proprio anti-recettore. Gli anti-recettori sono localizzati

sull’envelope (virus vestiti) o sul capside (virus nudi) ed è per questa

rivestiti sono più labili

localizzazione più esterna degli anti-recettori che i virus

rispetto a quelli nudi; le strutture che permettono l’interazione con la cellula,

nel primo caso si trovano su un rivestimento più fragile in quanto formato da

fosfolipidi e se questo rivestimento viene distrutto il virus perde la capacità di

creare un legame con le cellule bersaglio e quindi la sua capacità infettiva.

L’attacco è un processo che non richiede né che la cellula sia

metabolicamente attiva né che sia viva: frammenti di membrane cellulari che

posseggono il recettore sono in grado di legare il virus. L’interazione tra

recettori e anti-recettori comporta una modifica conformazionale di entrambi

questi elementi che comporta l’attivazione della tappa successiva, quindi un

processo a cascata che porterà all’ingresso del virus. I recettori sono:

a. Proteici: molto specifici in quanto ogni popolazione cellulare esprime

determinate proteine sulla propria superficie;

b. Glucidici: sono poco specifici in quanto le catene saccaridiche esterne

(ad

delle glicoproteine sono costituire sempre dagli stessi zuccheri

esempio l’acido sialico ovvero uno zucchero presente non solo sulla

superficie di tutte le cellule anche in maniera molto abbondante, ma si

trova libero nel muco quindi si parla di una molecola diffusa);

c. Lipidici.

Quindi il tropismo cellulare dipende dall’interazione chiave-serratura; un virus è

in grado di infettare tutte le cellule che esprimono i recettori specifici per il

Esistono anche virus come HIV o gli Herpes Virus in

proprio anti-recettore.

grado di utilizzare più recettori cellulari per permettere la penetrazione del 27

proprio genoma nell’ospite, possiedono uno spettro di cellule bersaglio

maggiore ad altri tipi di virus. In alcuni casi, come per HIV, per permettere la

penetrazione del virus nella cellula bersaglio non è sufficiente l’interazione con

un’unica molecola ovvero le modifiche conformazionali che avvengono dopo la

prima interazione non sono sufficienti; quindi prima si ha un’interazione con il

recettore e si crea un legame a bassa affinità dopodiché il virus si lega ad una

seconda molecola detta co-recettore il quale si attiva solo in un secondo

momento. Una volta legato anche il co-recettore si passa alla tappa successiva.

Esistono anche dei meccanismi di ingresso virale nell’ospite aspecifici quindi

ad esempio sulla

che non si avvalgono del meccanismo recettore-anti-recettore,

superficie di macrofagi e su molte cellule del sistema immunitario sono presenti

dei recettori in grado di riconoscere e legare il frammento costante delle

immunoglobuline attivando la fagocitosi. Può accadere che a queste cellule si

leghi un anticorpo legato ad un virus, ovvero legano immunocomplessi virali e

quindi successivamente alla fagocitosi di questi complessi si ha come risultato il

fatto che il virus sia entrato nella cellula senza però aver mai interagito con essa

direttamente tramite recettore; questo in alcuni casi può provocare effetti

devastanti sui soggetti in cui si verifica;

2. Ingresso o penetrazione;

3. Uncoating: il virus perde i suoi rivestimenti perché la parte essenziale è il suo

genoma. Può avvenire insieme alla fase 2;

4. I virus a RNA rimangono nel citoplasma dell’ospite mentre quelli a DNA

si spostano nel nucleo: il passaggio dal citoplasma al nucleo è molto difficile

infatti la cellula ospite prova in tutti modi ad evitare che il genoma virale si

replichi, quindi questo passaggio viene evitato dai virus a RNA in quanto non

necessitano degli enzimi presenti nel nucleo per replicarsi al contrario del DNA.

Nonostante questa distinzione esistono delle eccezioni:

virus influenzali: pur avendo il genoma a RNA vanno nel nucleo;

 retrovirus sono anch’essi a RNA, vanno nel nucleo con modalità

 diverse in quanto una volta entrati nel citoplasma vanno incontro a

retro-trascrittasi diventando a DNA e solo dopo si spostano nel nucleo;

i Poxvirus nonostante posseggano un genoma a DNA sono in grado di

 codificare talmente tanti enzimi che non necessitano di quelli presenti

nel nucleo cellulare per replicarsi.

5. trascrizione dei geni virali;

6. traduzione e formazione delle proteine: si ha la formazione dei vari

componenti delle strutture virali;

7. assemblaggio dei componenti;

8. rilascio del virus.

Lezione 5

Penetrazione

Avviene sfruttando dei meccanismi fisiologici della cellula, che richiedono che la

cellula sia viva e metabolizzante, avviene solo a 37°C perché la cellula deve essere in

grado di attivare una serie di reazioni. I virus possono entrare all’interno della cellula

in due modalità:

1. ENDOCITOSI: il virus entra all’interno di una vescicola;

FUSIONE: (virus rivestiti) l’envelope si fonde con il plasmalemma.

2. 28

Una volta che il virus si è attaccato, avviene una modificazione in tutte e due le

molecole (recettore ed anti-recettore). Comporta un avvicinamento delle molecole che

si accorciano fino ad arrivare ad una distanza minima che permette all’envelope di

fondersi con la membrana citoplasmatica con formazione di pori nella membrana. La

proteina di fusione favorisce l’interazione fra le due membrane. A volte è lo stesso

anti-recettore, altre sono 2 proteine diverse. Le proteine di fusione hanno una porzione

idrofobica: ci sono peptidi che si infilano nello strato lipidico della cellula portando le

membrane a fondersi. I virus con envelope possono entrare all’interno di una vescicola

di endocitosi, si forma un’invaginazione della membrana che si richiude formando una

vescicola. Perciò si presenta una vescicola nel citoplasma che contiene materiale

esogeno; la cellula deve digerirlo attraverso un metodo enzimatico. L’endosoma si

fonde con un lisosoma formando l’endo-lisosoma, il quale contiene enzimi (idrolasi

acide), che agiscono a pH acido e digeriscono il contenuto endosomiale. Il virus deve

scappare prima che si formi l’endo-lisosoma. I virus rivestiti, per attivare la proteina di

fusione non basta che si formi il legame recettore-anti-recettore, ma questa proteina è

pH-sensibile, agisce solo a pH acido. Quindi si forma la vescicola di endocitosi,

all’interno dell’endosoma si abbassa il pH e questo abbassamento modifica la proteina

di fusione permettendole di agire.

I virus nudi possono entrare solo per endocitosi. La fibra del pentone lega il

recettore e questo determina l’interazione del co-recettore con la base del pentone.

Questo insieme di eventi attiva la formazione dell’endosoma. Il legame recettore-

antirecettore modifica le proteine iniziando una disgregazione del capside. All’interno

dell’endosoma il virus inizia a perdere dei pezzi. Questi pezzi, una volta iniziata

l’acidificazione, si attivano grazie al pH acido e modificano la permeabilità della

membrana. Quello che rimane del capside esce dall’endosoma, il capside si dice

“parzialmente digerito” perché non è integro ma sufficiente per proteggere l’acido

nucleico.

Le prime fasi delle sintesi molecolari del virus possono avvenire prima che il

capside sia digerito o dopo. Dopo la degradazione completa di tutti i rivestimenti

non rimane solo l’acido nucleico ma anche delle molecole che servono al virus per

iniziare la sintesi. Il virus deve impossessarsi della cellula, deviando la sintesi in modo

che tutto l’apparato biosintetico della cellula possa essere sfruttato. Il virus deve

trascrivere il genoma, tradurre i suoi messaggeri, effettuare la replicazione. Queste

fasi non avvengono allo stesso modo, ogni virus ha un genoma diverso. I virus,

vengono divisi in sette classi dalla classificazione di Baltimore:

1. Prima classe: costituita da virus con DNA a doppio filamento, comprende tutte

le famiglie di virus a DNA (tranne 2). Si replicano nel nucleo dell’ospite (tranne i

Poxvirus);

2. Seconda classe: che sono i Parvovirus, piccoli, con genoma con DNA a singolo

filamento. Durante la loro replicazione, però, si forma una molecola di DNA e

doppio filamento. Quindi hanno un intermedio replicativo, double friends, alla

fine i due filamenti si separando andando rispettivamente in due distinte

particelle virali;

3. Terza classe: famiglia dei Reovirus che ha un genoma con RNA a doppio

filamento segmentato (ogni ORF è un gene);

4. Quarta classe: (Poliovirus) troviamo i virus con RNA a singolo filamento a

polarità positiva; una volta entrati questi virus andranno incontro a traduzione

dell’RNA messaggero; 29

5. Quinta classe: virus con RNA a singolo filamento a polarità negativa;

6. Sesta classe: abbiamo i Retrovirus;

7. Settima classe: ci sono gli Hepadnavirus, virus a DNA con intermezzo

replicativo a RNA, in particolar modo il virus dell’epatite B. In questo caso

troviamo DNA nella particella virale, poi, nelle fasi finali del ciclo replicativo,

viene inserito nel capside RNA e trascrittasi inversa. All’interno del capside,

l’RNA viene poi retrotrascritto in DNA.

Nella quarta classe: Fra gli orf non ci sono codoni di stop, ne deriva una poli-

proteina, lunga come il messaggio. All’interno di questa ci sono delle sequenze con

attività proteasica, proteasi che come substrato hanno la poli-proteina (taglio auto-

catalitico). E’ la molecola stessa che si taglia grazie a queste sequenze, ripiegandosi,

la parte proteasica trova i siti di taglio e taglia le varie proteine in diversi passaggi,

fino ad ottenere le proteine finali. Con VP1, VP2, VP3, VP4, si intendono le proteine

il poliovirus, sintetizza 4 proteine strutturali, le restanti sono

della struttura del virione,

proteine funzionali.

Il virus deve replicare il suo genoma: lo stampo è una molecola di RNA e il prodotto

finale è una molecola di DNA ottenuta grazie all’RNA polimerasi. L’RNA in questione

non è quello della cellula perché l’RNA della cellula si forma a partire da DNA ed è,

RNA polimerasi DNA dipendente

quindi, . Il virus, invece, dato che in questo caso ha

come genoma RNA, deve utilizzare un RNA polimerasi che come stampo riconosca un

RNA polimerasi RNA dipendente,

RNA, chiamato che sintetizza RNA a partire DNA.

L’RNA polimerasi RNA dipendente del virus, utilizzando lo stampo di RNA, come prima

cosa sintetizza una molecola complementare creando un intermedio a polarità

negativa da utilizzare per sintetizzare molecole a RNA positive. L’RNA parentale si

chiama così in quanto è presente nella particella virale che è infetta, viene poi tradotto

e si formano le proteine come la proteasi e la polimerasi. La polimerasi, sintetizza,

partendo da un filamento positivo, un filamento negativo che funziona da stampo per

la polimerasi che sintetizza una molecola di RNA a polarità positiva di cui una parte

viene tradotta, un’altra entra nelle particelle di neoformazione.

Nella quinta classe replicativa troviamo famiglie di virus importantissime

(influenzali). Paramyxovirus, che comprende il virus del morbillo, parainfluenze,

polmoniti. In questa circostanza il genoma è a polarità negativa, quindi una volta che il

virus si trova nel citoplasma deve trascrivere gli RNA messaggeri a polarità positiva

che poi vengono tradotti. Il denudamento del virus (a volte) non è completo ma

restano componenti che servono al virus e che non si trovano nella cellula. I virus della

quinta classe, all’interno del capside attaccato all’RNA, hanno l’RNA polimerasi RNA

dipendente. Sul genoma a polarità negativa vengono trascritti gli RNA a polarità

positiva corrispondenti ai vari ORF, quindi gli RNA messaggeri di ciascun ORF vanno

sui ribosomi e vengono così tradotte le proteine corrispondenti. Oltre a sintetizzare

degli RNA a polarità positiva corrispondenti ai messaggeri, l’RNA polimerasi è in grado

di “forzare” la trascrizione sintetizzando un’unica molecola a polarità positiva lunga

quanto il genoma senza fermarsi ad ogni ORF (full length). La stessa RNA polimerasi,

poi, a stampo di questa molecola, sintetizza la molecola a polarità negativa che sarà

incapsidata. Indipendentemente che si tratti di quarta o quinta classe, c’è un RNA

polimerasi che spostandosi sintetizza una catena complementare, prima che il

processo sia completato si forma all’interno della cellula un RNA a doppio filamento.

I virus della terza classe entrato nella cellula (le prime fasi della trascrizione

avvengono nel capside), il virus trascrive solo il filamento a polarità negativa. Questi

30

virus, come quelli della quinta classe, hanno già con sé l’RNA polimerasi RNA

dipendente; quelli della quarta classe non lo hanno.

La prima classe: sul DNA della cellula abbiamo geni precoci e geni tardivi, quindi

distinguiamo: trascrizione precoce e tardiva. I geni precoci codificano per proteine

funzionali, proteine che servono al virus per portare avanti il suo ciclo replicativo. Dopo

averle sintetizzato, il virus può replicare il genoma. La duplicazione sarà operata da

una DNA polimerasi DNA dipendente; in alcuni casi è quella della cellula, ed il virus va

nel nucleo, in altri il virus fra le sue proteine precoci ha la DNA polimerasi. Utilizzando

come stampo le nuove molecole di DNA, vengono trascritti i geni tardivi, che sono le

proteine strutturali. Queste proteine si dicono “precoci” e “tardive” rispetto alla

duplicazione del genoma. Anche i virus che codificano una loro DNA polimerasi hanno

un genoma molto grosso e codificano molti enzimi, vanno nel nucleo. Questo perché il

virus non sintetizza l’RNA polimerasi seconda perché utilizza quella presente nel

nucleo.

La sesta classe ha dei virus rivestiti da envelope, con una matrice e un capside a

simmetria icosaedrica con genoma costituito da due filamenti di RNA entrambi a

polarità positiva, single strand (se fossero double strand i due filamenti si

appaierebbero) generano un genoma diploide. Queste due molecole non sono

indipendenti ma sono appaiate in una regione di poche decine di nucleotidi.

All’estremo 5’ abbiamo una porzione non codificante, così come all’estremo 3’. Quella

all’estremo 3’ inizia con una regione chiamata “R” che sta per “ripetizione”, in quanto

costituita da sequenze ripetute. Successivamente troviamo una regione unica indicata

“U”, che contiene i promotori della trascrizione virale: i retrovirus hanno dei promotori

potentissimi che fanno avvenire la trascrizione a livelli molto intensi. Segue la regione

“PBS” che sta per “Primer-binding site” ed è il sito di attacco del primer ed è qui che

inizia la retro-trascrizione. Nella particella virale è già attaccato il primer che è

costituito da un tRNA cellulare che si è legato prima che avvenisse l’incapsidamento.

Poi abbiamo la regione DLS (dimer linking site), il sito dove le due molecole si

appaiono: solo in questa piccola regione si trova la sequenza complementare fra le

due catene. Di seguito abbiamo la sequenza Ψ (psi), che è il segnale di

incapsidamento: piccola sequenza che viene riconosciuta dalle proteine capsidiche le

quali fanno sì che entri, nel capside, solo l’RNA che ha quella determinata sequenza di

incapsidamento. Inizia la sequenza codificante che è costituita da 3 ORF:

Il gene GAG: codifica per proteine strutturali del capside, della matrice e piccole

 proteine nucleo-capsidiche;

Il gene POL: codifica per la trascrittasi inversa, per l’integrasi che permette al

 DNA virale di integrarsi al DNA cellulare e per la proteasi che serve a tagliare

una poli-proteina virale;

Il gene ENV: codifica per le proteine dell’envelope.

A valle della sequenza codificante, c’è un’altra sequenza non codificante, che inizia

con una regione +P o PPT (tratto poli-purinico): è una sequenza in cui sono abbondanti

i nucleotidi purinici. Segue una regione che contiene i promotori e una regione

ripetuta. Quindi, ai due estremi abbiamo una sequenza ripetuta e palindromica.

Ciclo replicativo di un retrovirus

Il virus entra nella cellula, la retro-trascrizione avviene nel capside non digerito

completamente e si forma il DNA virale, chiamato cDNA (DNA copia) virale, detto pro-

31

virus, il quale entra nel nucleo e grazie all’integrasi, si integra nel genoma della cellula

e quindi gli ORF virali diventano geni cellulari, quindi trascritti dalla cellula come se

fossero suoi. Si formano di conseguenza i vari RNA messaggeri corrispondenti agli ORF

che formano le proteine e si forma anche un RNA lungo quanto l’intero genoma. La

catena di RNA ha già il suo primer (tRNA), quindi la trascrittasi inversa, dopo essersi

legata, inizia a duplicare la prima porzione. Normalmente, andrebbe in direzione 5’→3’,

partendo da PBS e andando a retro-trascrivere gli ORF, la trascrittasi inversa, invece,

va in direzione 3’→5’, partendo da PPT e andando verso l’estremo 5’, quindi retro-

trascrive U5 ed R, e, contemporaneamente, questi che sono già stati retro-trascritti

vengono digeriti dalle ribonucleasi.

Avviene quello che si chiama “arresto brusco”, questo pezzo di DNA che si è già retro-

trascritto si va ad attaccare all’estremo della molecola e finisce di sintetizzare il primo

filamento che sarà costituito da DNA a polarità negativa. Quando poi si completa la

catena l’estremo non è più R-U3, ma è U5-R-U3, quindi l’estremo si è raddoppiato.

DNA polimerasi RNA dipendente

L’enzima in questo caso si è comportato da (1). Una

volta passato all’altro estremo, viene retro-trascritto U3 e poi il resto della molecola.

ribonucleasi

L’altra funzione è di (2) digerisce lo stampo di RNA che non serve. Resta il

singolo filamento di DNA. Verso l’estremo 3’ è presente il tratto poli-purinico: i

nucleotidi purinici si legano con tre legami a idrogeno, quelli pirimidinici con due

legami a idrogeno. La ribonucleasi deve tagliarne uno in più impiegando più tempo: il

tratto poli-purinico viene digerito per ultimo. La trascrittasi inversa, ora, deve

DNA polimerasi DNA dipendente

comportarsi come una (3), la quale si lega al tratto

poli-purinico che funge da primer. Partendo dal tratto poli-purinico, arriva alla fine dello

stampo di DNA a polarità negativa e quindi si stacca e si attacca all’altro estremo in

corrispondenza della regione PBS (secondo arresto brusco). Qui la sintesi prosegue e si

forma il DNA a doppio filamento (cDNA). Proprio per questo meccanismo di “salto da

un estremo all’altro” le regioni estreme sono raddoppiate: un “R” fiancheggiato da due

regioni uniche, che nel complesso prendono il nome di LTR. Il DNA, ora, passa nel

nucleo, si circolarizza e prende il nome di pro-virus e grazie all’integrasi si integra nel

DNA della cellula (non c’è un unico punto di integrazione).

La settima classe ha virus che sono molto piccoli, hanno un envelope, non hanno

matrice e hanno capside a simmetria icosaedrica contenente un DNA molto piccolo,

poco più di 3 chilo-basi che servirebbero per sintetizzare poco più di una proteina. Il

DNA in questione ha un filamento completo a polarità negativa, e un secondo

filamento che si appaia al primo che non è completo a polarità positiva. Quindi il DNA

è per un pezzo a doppio filamento e poi a singolo filamento. Il genoma a DNA è

circolare però aperto perché gli estremi della catena completa non si saldano

covalentemente. Il genoma di HPV presenta 4 ORF:

1. il primo, che è anche il più lungo, codifica per la trascrittasi inversa che,

anche qui, ha 3 funzioni (DNA polimerasi RNA dipendente, ribonucleasi,

DNA polimerasi DNA dipendente);

2. il secondo, codifica per HBsAg (Antigene di superficie S del virus

dell’epatite B che si trova sull‘envelope). L’ORF 2 presenta 3 siti di inizio

della trascrizione nella regione:

a. un sito di trascrizione, il più a monte di tutti e viene trascritto

dando un RNA che ha la massima lunghezza (L);

b. all’interno della regione preS, abbiamo un secondo che

determinerà un messaggero più corto (M); 32

c. un inizio di trascrizione alla fine della regione preS che dà origine

ad un messaggero ancora più corto (S).

Abbiamo 3 antigeni S differenti, chiamati L (LARGE) -M (MEDIUM) -S (SMALL).

Uno stesso pezzo di DNA ha sintetizzato un numero molto diverso di

proteine.

3. L’ORF 3 presenta due siti di trascrizione, uno più a monte e uno più a

valle, quindi un messaggero più lungo e uno più corto. Il messaggero più

corto, quindi quando la trascrizione parte a valle, dà origine all’HBcAg

(Antigene del capside del virus dell’epatiteB) quindi alla proteina che

costituisce il capside. Quando la trascrizione inizia a monte si forma una

proteina con una porzione in più che funziona da segnale di secrezione: la

proteina che si forma prende il nome antigene E, HBeAg, che è una

proteina non strutturale ma viene secreta: questa proteina favorisce

l’infettività del virus, in assenza dell’antigene E il virus infetta molto più

difficilmente l’ospite;

4. L’ORF 4 codifica per la proteina X, che è trans attivante (proteina si lega

con una regione del DNA promuovendone la trascrizione). L’RNA

messaggero viene sintetizzato nel nucleo, va nel citoplasma viene

tradotta la proteina, torna nel nucleo e va ad attivare la trascrizione dei

geni virali.

Ciclo Replicativo

Il virus si lega al suo recettore, è una molecola che si trova sugli epatociti. Avviene la

fusione, il capside arriva parzialmente digerito fino al nucleo, il virus viene scapsidato

e rimane il DNA virale (parzialmente double strand un pezzo della catena S manca).

Una volta arrivato nel nucleo, intervengono gli enzimi di riparo del DNA. Questi

completano il filamento corto della del genoma virale: in questo modo il DNA si chiude

covalentemente e diventa cccDNA ovvero “DNA circolare chiuso covalentemente”

andando a questo punto a costituire quello che viene definito mini-cromosoma virale.

L’RNA polimerasi trascrive il genoma virale formando:

i messaggeri degli ORF che sono RNA sub-genomici, più corti dell’intero

 genoma;

un RNA lungo come il genoma del virus che prende il nome di “RNA pre-

 genomico”. I messaggeri dell’RNA pre-genomico passano nel citoplasma, i

messaggeri vengono tradotti e si forma la proteina capsidica che va a formare il

capside.

Dentro il capside immaturo entra l’RNA pre-genomico e la trascrittasi inversa. Può

avvenire, ora, la retro-trascrizione che avviene in modo simile ai retrovirus: la

trascrittasi inversa retro-trascrive il primo filamento di DNA a polarità negativa, la

proteasi digerisce l’RNA e parte la sintesi del secondo filamento a polarità positiva. Il

capside, ancora immaturo, subisce le ultime modifiche. Quando diventa maturo non è

più permeabile: quei pochi nucleotidi presenti vengono esauriti e la sintesi si

interrompe. Il secondo filamento è più corto perché, ad un certo punto, la retro-

trascrittasi esaurisce i nucleotidi: il filamento completo è a polarità negativa perché è

la retro-trascrizione di un RNA positivo e il secondo filamento polarità positiva.

Lezione 6

ASSEMBLAGGIO 33

La prima cosa che si forma è il capside. L’assemblaggio inizia quando le proteine

strutturali e i genomi hanno raggiunto un livello intracellulare critico; il processo è

inizialmente spontaneo, poi:

Per i virus nudi rimane spontaneo, si forma il pro-capside. Bastano quindi le

 sole proteine del capside, nella giusta quantità e nelle giuste condizioni di

temperatura e pH, per avere la formazione spontanea del capside, dove si

Un esempio è il Papilloma

aggregano tra loro due subunità formando il capside.

virus, responsabile di lesioni cutanee (verruche) e lesioni cervicali che possono

evolvere in carcinoma della cervice; basta anche solo una proteina nelle giuste

condizioni di pH e temperatura per avere l’inizio della formazione del capside,

processo assolutamente spontaneo. Questo fenomeno è sfruttato per la

creazione del vaccino contro il papilloma virus (si auto-generano capsidi vuoti

formati da una sola delle due proteine virali, in modo da attivare la risposta

immunitaria). Per i virus a simmetria elicoidale (tutti a RNA), le proteine

capsidiche avvolgono la catena di RNA in allungamento, in modo da proteggerla

dalla degradazione, in quanto l’RNA è una molecola con emivita molto breve,

perché le RNAasi cominciano subito la degradazione, quindi deve essere

protetta mentre viene sintetizzata;

I virus rivestiti possono richiedere altri componenti, che possono essere:

 Proteine di scaffold (impalcatura) che permettono alle proteine capsidiche

o di assemblarsi nel modo corretto, e alla fine vengono rimosse dalle

proteasi;

Queste proteine intervengono anche per la maturazione delle altre

o proteine capsidiche, le quali vanno incontro a tagli proteolitici e fanno in

modo che il capside si chiudi;

Chaperonine della cellula: determinano la corretta conformazione

o spaziale delle proteine, e se non riescono ad ottenerla ne causano la

degradazione.

Durante la sintesi delle proteine virali si formano sub-aggregazioni di pezzi di capside,

dove le proteine si assemblano in vario modo: a volte una catena unica diventa un

trimero, come nel caso di assemblaggio da un precursore polipeptidico, altre un

monomero si unisce in una struttura pentamerica, e altre volte ancora si aggregano

insieme formando il vertice del Pentone con la sua fibra.

MATURAZIONE

Maturazione e fuoriuscita possono essere due fasi distinte (virus complessi) o

unite (virus semplici). Maturazione è lo stadio in cui il virus ha raggiunto la sua

forma infettante.

I virus che sono già maturi sono i virus nudi, non devono acquisire nessun altro

componente per essere infettanti, quindi maturano con il completamento

dell’assemblaggio, e diventano maturi quando sono dentro alla cellula (maturazione

intracellulare). Si accumulano nella cellula come ammassi ed a ad un certo punto, la

cellula, troppo danneggiata, va in contro a lisi, liberandoli nello spazio interstiziale. I

virus rivestiti maturano quando acquisiscono l’envelope attraverso il “budding” o

gemmazione. L’envelope può essere acquisito da: Retrovirus,

Membrana esterna: viene acquisita dalla maggior parte dei virus (

 Paramyxovirus, Rabdovirus, e Togavirus). La maturazione coincide con la

fuoriuscita. Le proteine che formano l’envelope vengono glicosilate e si

depositano sulla membrana citoplasmatica, prendono contatto con le proteine

34

della matrice, creando interazioni fisiche tra proteine capsidiche e versante

interno della membrana. Il complesso crea tensione nella membrana cellulare

dando l’avvio alla gemmazione; questa comincia a sporgere creando una

gemma che diventa sempre più grossa fino a che gli estremi non si saldano e il

virus viene liberato portandosi dietro la membrana della cellula ospite. Le

conseguenze di questo fenomeno è che ogni particella di gemma si porta un

pezzo di membrana, la cellula deve quindi rigenerare costantemente la

membrana, ma il virus blocca la sintesi della cellula, quindi questa non riesce a

sostituire la membrana persa e va incontro a morte.

Membrana del RER o del Golgi: Si ha maturazione intracellulare seguita da

 (Bunyavirus, Coronovirus

fuoriuscita per esocitosi ). Le proteine vengono

sintetizzate dai ribosomi del RER, non vengono liberate nel citoplasma, ma

rimangono sul RER ed il virus gemma dentro la membrana del reticolo.

Viaggiando per la cellula all’interno di una vescicola, dal RER si sposterà al

Golgi (dove per alcuni virus avviene la maturazione), poi i virioni fuoriescono

per esocitosi dal Golgi e successivamente per esocitosi dalla membrana

plasmatica. Questo processo è meno d’impatto sulla membrana

citoplasmatica, perché il virus gemma nel RER dove le membrane sono più

abbondanti, e per ogni vescicola ci sono più particelle virali. I virus che

gemmano in questo modo disperdono il danno sulla cellula in modo

prolungato nel tempo, consentendo alla cellula di vivere più a lungo.

Membrana nucleare: si ha maturazione intracellulare seguita da fuoriuscita

 (Herpes-virus). Per il virus HIV i vari ceppi fuoriescono con

per esocitosi

modalità diverse tra loro, quelli più aggressivi sono quelli che si selezionano

come più infettanti nelle fasi della malattia, quando cioè il soggetto passa da

sieropositività ad AIDS conclamato.

FUNGHI

Gruppo di microrganismi estremamente vasto in natura, con estrema variabilità di

forme e dimensioni, solo in parte conosciuti. Comprendono: lieviti, muffe e

funghi eduli; sono responsabili di buona parte dei processi degradativi.

Si stima che ci siano 1,5 milioni di specie di miceti, delle quali si conosce una minima

parte (74.000-120.000 specie), della quale una minima parte (300) risultano essere

potenzialmente patogene per l’uomo e gli animali, e appena un quarto di queste sono

state isolate in laboratorio. Si adattano a tutti gli ambienti, riescono a vivere in zone

sfavorevoli per altri microrganismi, ad esempio si riproducono meglio in ambiente

acido (pH 5,6), mentre gli altri hanno bisogno di un pH neutro Crescono bene in

presenza di alte concentrazioni di glucosio, e l’umidità favorisce la loro specie. Oltre a

causare malattie e degradare la materia hanno anche utilizzi pratici molto importanti:

(Phanerochaete chysosporium);

Per sbiancare la carta

 (Candida krusei, Geotrichum);

Fermentazione del cacao per farlo dolce

 (Saccharomyces cerevisiae);

Per lievitare:

 (Penicillium camembertii);

Formaggi:

 Per fare antibiotici: scoperto da Alexander Fleming nel 1928.

ALTRE UTILITÀ

Si può fargli produrre le molecole che ci interessano, utilizzandoli come vettori di

ad esempio inserire il gene che vogliamo esprimere nel lievito, che ha

espressione;

alto metabolismo, ci consente di avere alte quantità di ciò che vogliamo . Antibiotici ed

altri farmaci:

Penicillina: Penicillium chrysogenum;

 Cefalosporine: Cephaolosporium acremonium;

 35

Griseofulvina: Penicillium griseofulvum;

 Ciclosporina (nei trapiantati): Cordyceps subsessilis.

Nel campo delle biotecnologie, i miceti si usano:

A scopo terapeutico per la produzione dell’insulina;

 A scopo vaccinale produzione vaccino anti-HBV: vaccino anti epatite B, nel

 quale si fa produrre l’antigene S, antigene dell’envelope che attiva la risposta

immunitaria, a saccaromiceti transgenici, in modo da averne grandi quantità per

produrre il vaccino.

Settore agro-alimentale: migliorare le colture

I miceti possono dare 2 possibili tipologie di patologie nell’uomo:

1. MICOSI: tessuto dell’ospite colonizzato dal fungo e viene danneggiato. Può

essere un’infezione endogena o esogena (acquisita per inalazione o inoculazione), è

spesso OPPORTUNISTICA (immunodepressi) e presenta quadri infettivi con decorso

sub-acuto o cronico.

2. MICOTOSSICOSI: dovuta all’ingestione di alimenti contaminati da tossine

quella dovuta

prodotte da funghi; una è particolarmente importante e letale:

alle aflatossine, prodotte da un fungo con funzione tossica potentissima. Non si

ha l’infezione del soggetto, ma l’introduzione diretta della tossina.

3. MICETISMO: ingestione di funghi velenosi che causa un’intossicazione

alimentare da funghi.

CARATTERISTICHE CELLULA FUNGINA

Sono organismi eucarioti, quindi hanno un nucleo definito e delimitato da una

membrana; DNA organizzato, cromosomi multipli di numero variabile in base alla

specie, tutti gli organuli delle cellule eucariote; mitocondri nel citosol (la membrana

citoplasmatica non avrà funzione di respirazione); numerose tipologie di vescicole,

coinvolte nella secrezione degli enzimi digestivi, nella sintesi di nuova parete, come

deposito di sostanze nutritizie, come depositi di enzimi per azioni metaboliche che

devono avvenire in comparti specifici. Possono essere unicellulari (lieviti) o

pluricellulari (muffe o funghi filamentosi); per la riproduzione alcuni funghi hanno

solo la riproduzione asessuata (conidi), altri possono alternare cicli di

replicazione asessuata con cicli di replicazione sessuata (spore); sono

chemio-eterotrofi (necessitano di molecole organiche esterne preformate essenziali

come carboidrati e nitrati); non hanno strutture per il movimento; possono stabilire

qualsiasi tipo di rapporto con gli ospiti, sono saprofiti, commensali o parassiti; le

cellule sono 20-50 volte più grosse dei batteri, ma più piccole delle cellule umane.

MEMBRANA CELLULARE

La membrana cellulare delimita il citoplasma, formata da un doppio strato di

fosfolipidi e steroli, in particolare ergosterolo (non presente nelle cellule animali,

per questo l’ergosterolo e la sua sintesi sono bersagli dei pochi farmaci disponibili

contro i funghi, in quanto sono cellule eucariote simili a quelle umane, e quindi è più

difficile trovare molecole bersaglio) non contengono colesterolo! Le sue funzioni

sono: protezione del citoplasma; regolazione di assunzione e secrezione dei soluti

tramite proteine che formano pori/canali; inducono la sintesi della capsula e della

parete cellulare.

PARETE CELLULARE

E’ una struttura multi-stratificata prevalentemente glucidica (90% ); nello strato più

interno c’è della chitina (polimero di N-acetil-glucosammina) che compone il 2-10% e

forma un piccolo strato, al di sopra del quale si trovano vari polimeri: glucani 60%

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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in tecniche di laboratorio biomedico
SSD:
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher manfredini_francesco di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Microbiologia e virologia medica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Modena e Reggio Emilia - Unimore o del prof Cermelli Claudio.

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