Microbiologia e igiene

GENOMA

Esistono più di 5000 diversi genotipi, suddivisione in Famiglie, Superfamiglie e Generi. Nel 1933 una

Conferenza di Microbiologia (Mosca) istituì l'ICTV Comitato interazione per tassonomia virale, il quale

sviluppò uno schema tassonomico universale, ma furono trovate poche caratteristiche comuni per poter

classificare.

Solo DNA o RNA, ss o ds, lineare, circolare e segmentato; elica- e elica+ (stessa polarità l'mRNA)

Struttura.

e ambisenso. Le dimensioni del genoma sono molto diverse: 3500 nt per fagi e Leviviridae; 47000nt per

poxv. e herpesv; 76000nt per PhycoDnaviridae e Mimivirus.

Mimivirus Acanthamoeba polyphaga mimivirus (APMV).

È il virus più grande conosciuto, lontanamente correlato ai poxvirus; capside più grande fra tutti quelli noti

(diametro 400nm) circondato da filamenti proteici, diametro finale di 600nm e molto più grande di piccole

cellule. Genoma complesso: molecola lineare dsDNA 1,2 x10^6 bp (coppia di basi), il più grande genoma

virale mai riscontrato, circa il doppio del miovirus (fago G) ritenuto finora il più grande; hanno 911 geni

codificanti con geni mai riscontrati in altri virus.

L'informazione genica virale è complessa: le dimensioni del genoma sono correlate con quelle della

particella virale; nei virus più piccoli i geni sono sovrapposti (overlapping).

Poxv. ed herpes (circa 250nm) con genomi di grande dimensione (circa 200kb), molti geni per la

replicazione.

HIV (100nm) con genoma di piccola dimensione (circa 10kb), 9 geni (3 strutturali, 3 regolatori, 3

accessori).

La replicazione dipende dal genoma virale.

nei virus a DNA: il genoma è simile a quello dell'ospite e la replicazione viene condivisa con la

cellula ospite ed è generalmente nucleare sfruttando enzimi comuni.

Nei virus ad RNA: il genoma è diverso da quello dell'ospite, i virus possiedono enzimi che la cellula

ospite non possiede. Ad esempio RNA pol RNA dip (replicasi) hanno funzioni analoghe agli enzimi

cellulari; la replicazione è generalmente citoplasmatica.

La velocità di replicazione rispecchia quella dell'ospite; 20-30 minuti nei batteri e 12-24 h nelle cellule

eucariote.

Nel 1971 D. Baltimore propose una nuova classificazione basata sul diverso tipo di replicazione; si

distinguono 7 classi per superare le diverse classificazioni esistenti, basate su morfologia e patogenesi (virus

con morfologia simile > diversa patologia; virus con patologia simile > diversa morfologia).

Herpes, Adeno, Papilloma: replicazione nucleare che dipende da fattori cellulari. Poxvirus:

1. dsDNA.

replicazione solo citoplasmatica (eccezione), posseggono tutti i fattori per la trascrizione e

replicazione.

Parvovirus: replicazione nucleare, formano un dsDNA intermedio che funge da stampo per

2. ssDNA.

sintetizzare la progenie ss.

Reovirus (Rotavirus): causano per lo più gastroenteriti nei bambini, la replicazione è

3. dsRNA.

citoplasmatica e il genoma segmentato.

Picorna (Poliov. Rhinov. FMDV), Coronavirus (SARS), Togavirus (sindbis,

4. ssRNA elica +.

rosolia): replicazione generalmente citoplasmatica; il virus codifica generalmente per la sua RNA-

pol RNA dip, dopo essere entrato nella cellula la polimerasi sintetizza RNA- che fa da stampo per

RNA+ genomico. Rabbia, Ebola, Hanta, Paramixo (morbillo, parotite, RSV): a replicazione

5. ssRNA elica -.

citoplasmatica tranne Orthomixo (influenzale A, B, C) a replicazione nucleare. Il virus codifica per

la sua RNA-pol RNA-dip durante il ciclo replicativo precedente e la inserisce nella particella virale;

polimerasi sintetizza RNA+ (che produce le proteine) che fa da stampo per RNA-genomico.

Retrovirus: genoma diploide, RNA+ non serve direttamente

6. ssRNA elica+ con intermedio a DNA.

quale mRNA ma serve da stampo per RT (retrotrascittas); il DNA provirale serve da stampo per

RNA+ genomico e per mRNA per la sintesi proteica (trascrizione mediata da RNA pol II cellulare).

Epatite B (Hepadnavirus): infettano gli epatociti, infezione virale.

7. dsDNA con intervallo ad RNA.

Traslocazione del nucleo, circolarizzazione DNA genomico > cccDNA (covalenting closed circular

DNA), trascrizione ed accumulo RNA sfruttando pol II dell'ospite in sRNA (RNA progenomico),

traduzione RNA nei prodotti P, C, S, X, poi incapsidazione di pgRNA e RT (P, hanno

retrotrascrittasi che permette al virus di fare doppia elica), sintesi del genoma e sullo stampo di RA

viene sintetizzato DNA-, digestione RNA sull'ibrido, sullo stampo DNA- viene sintetizzato DNA+,

gemmazione attraverso ER per acquisire gp env.

Nei virus RNA+ la replicasi viene sintetizzata subito dopo la penetrazione (per sintetizzare RNA- serve

RNA+ genomico), invece nei virus RNA- la replicasi è gia presente nel core (per sintetizzare RNA+ serve

RNA genomico e proteine).

COLTIVAZIONE VIRALE

Nel 1881 Pasteur produsse il primo vaccino artificiale (vaccinazione di Jenner, sempre legata ad un virus

naturale, come quello della vacca, che era patogeno per l'uomo). Attualmente gli animali vengono utilizzati

per la produzione di virus non propagabili in virus, per lo studio patogeno di infezioni virali e per i test sulla

sicurezza dei vaccini. Le conseguenze sono però economiche, etiche e possono portare ad una risposta non

omogenea dovuta alla variabilità dell'ospite.

La coltivazione virale necessita:

della scelta del substrato cellulare specifico per recettori specifici a cui il ligando, o antirecettore del

1. virus, può legarsi. Es. HIV entra solo nei linfociti. Questa scelta dipende quindi dal diverso tropismo

virale.

dell'uso di terreni di coltura per le cellule con parametri di crescita specifici per favorire la

2. replicazione e per impedire il sopravvento di altre specie.

I primi substrati cellulari sono state le uova embrionate; la replicazione però avviene in compartimenti

diversi in base ai diversi virus: Poxvirus, Herpes e RSV nella membrana carion-allantoidea, Orthomixo nella

cavità amniotica, Orthomixo, Coronavirus e Paramyxo nella cavità allantoidea, Rhabdo e Picorna nel sacco

vitellino; i poxvirus formano pocks emorragici su CAM.

Ad esempio HIV ha come recettore principale il CD4 che definisce il tropismo per macrofagi e Th (linfociti

T). Il CCR5 e CXCR4 sono corecettori (aiutano il recettore) e definiscono il diverso tropismo per macrofagi

o Th.

Alcuni virus non sono ancora coltivabili in vitro, crescono solo su alcuni tessuti o animali. Ad esempio HPV:

lesioni solo a livello cutaneo o mucosale; HIV replica solo in alcuni animali (tropismo ristretto); CRPV solo

sul coniglio (papilloma virus); virus epatite C, D, E crescono in animali da laboratorio.

Esistono anche meccanismi intracellulari che bloccano il processo replicativo dei virus. Alcuni poxvirus

come EP (virus del pollo) e CP (v del canarino) replicano solo in cellule aviarie, bloccano la post-

penetrazionale nelle altre cellule; esprimono Ag senza produzione di virus, vengono utilizzati quali vettori

solo per esprimere Ag (es. per la preparazione vaccinali). I virus oncogeni murini replicano invece solo su

cellule specifiche, o di specie uguale a quella di origine o di specie diversa da quella di origine (v. ecotropi,

xenotropi, anfotropi).

I dipendono dalle cellule utilizzate, hanno una composizione specifica: soluzione salina

terreni di coltura

iso-osmolare per equilibrare la pressione osmotica intracellulare esercitata sulla membrana. Contengono una

sorgente di energia (glucosio 4,5 g/litro), complessi polivitaminici, amminoacidi essenziali e non; fattori di

crescita aspecifici, soprattutto il siero di mammifero (5-10%) e si parla o di siero di vitello neonato o fetale;

fattori di crescita specifici come EGF (crescita di cellule epiteliodi) e IL-2 (crescita di linfociti T).

Nel terreno vengono inseriti antibiotici e antifungini (penicillina, streptomocina, amphotericina B), per

controllare le contaminazioni presenti nell'involucro del virus e causate dall'operatore. I batteri e lieviti

avrebbero il sopravvento e i loro prodotti catabolici inibirebbero o ucciderebbero le cellule. Nei terreni

inoltre vengono inseriti indicatori del PH come il rosso fenolo presente nel mezzo di coltura (bluastro = 7.6,

rosso = 7.4, arancio = 7 e giallo = 6.5).

Il sistema tampone utilizzato è il bicarbonato di sodio e Hepes per riequilibrare l'anidride carbonica del

terreno; l'aumento di CO2 provocherebbe la morte cellulare. Le cellule trasformate o molto concentrate

producono CO2 e acido lattico. Le cellule a bassa concentrazione perdono CO2 e bicarbonato sciolti nel

mezzo.

Vengono utilizzate le piastre Petri e Flask aperte, semi-aperte e gas permeabili per evitare aumento o

diminuzione del PH.

Le colture cellulari vengono manipolare sterilmente in cappe a flusso laminare verticale, consentono di

lavorare in modo antisettico (ambiente sterile) e proteggono l'operatore. Le cellule vengono cresciute in

incubatoio che mantengono al temperatura a 37° e contengono una miscela di aria e CO2 5% (CO2 mantiene

il PH a 7-7.2 in presenza di bicarbonato).

Le cellule che crescono adese al substrato vengono propagate mediante trattamento enzimatico con tripsina,

promasi e collagenasi; previo trattamento con PBS o agenti chelanti (EDTA), gli enzimi non danneggiano

generalmente la cellula e alcuni enzimi rimuovono recettori di superficie.

Ci sono delle cellule che crescono in sospensione e vengono propagate mediante aumento di volume del

terreno previa rimozione del terreno acidificato. A questo punto le cellule vengono contate utilizzando

generalmente un colorante non-vitale (tripan blu) e camere di conta (es. Bunker).

Talora è necessario agarizzare il terreno; l'agar è un polisaccaride estratto dalle alghe, atossico e non influisce

sul metabolismo, solidifica il terreno (polvere aggiunta al terreno all'1-2%, fonde ad una temperatura

maggiore di 90° e solidifica a temperature minori di 45°). Limita il trasporto passivo da una cellula all'altra

(es. durante le titolazioni); è stato utilizzato anche per evidenziare la capacità proliferativa di cellule

trasformate, e le cellule hanno perso inibizione di contatto. La crescita soft agar è un metodo di Macpherson

e Montagnier.

Le colture cellulari vengono distinte in: primarie, quelle derivate da animali, e a linea continua, quelle con

cellule immortalizzate o di derivazione tumorale. Hanno una diversa crescita: quelle in linea continua

crescono in modo indefinito (linea cellulare), e quelle primarie vengono estratte direttamente dal tessuto

(cellule non subcoltivate) con un numero di passaggi limitato, poi degenerano e muoiono.

Le cellule vengono infettate al fine di

identificare un virus (es. mediante ME),

amplificare un virus,

verificare l'effetto citopatico virale (CPE),

isolare un mutante o ricombinante: trasferimento delle placche con membrana originale e replica la

prima membrana; trattamento del DNA adsorbito sulla membrana con denaturazione,

neutralizzazione e fissazione del DNA