Microbiologia e igiene

Microbiologia applicata

Esame e modalità

Antonia Radaelli

Esame scritto: 30 domande vero o falso, durata 1h30. Appello tutti i mesi (11), tutti i compiti diversi, entro tre giorni. Presentarsi comunque alla registrazione, via Vanvitelli, 32 Dip. di Farmacologia 0250317061. Corretta 0.25, errata -0.15.

Generalità sui batteri

Confronto fra microrganismi

Cellule eucariote (funghi): 2000-5000 nm, DNA+RNA, divisione binaria.

• Lieviti: DNA+RNA, gemmazione.
• Muffe

Cellule procariote: tutti divisione binaria, tutti DNA+RNA.

• Batteri
• Micoplasmi (PPLO)
• Antibiotici vari - Rickettsie
• Antibiotici vari - Clamidie

Agenti infettivi acellulari: resistenti agli antibiotici 15-250 nm, DNA o RNA, replicazione unicellulare.

• Virus
• Proteina Prp, replicazione enzimatica - Prioni

Caratteristiche comuni tra procarioti e eucarioti

Membrana cellulare, parete cellulare, materiale nucleare, citoplasma (ribosomi).

Differenze

• Dimensioni batteri: 2-3 μm.
• Nucleo con membrana per i procarioti.
• Genoma diploide per i procarioti; la lunghezza del DNA batterico è circa 1000 volte superiore a quella delle sue dimensioni (82 mm = 2000 micro).
• Citoplasma: mitocondri, Golgi e RE assenti negli eucarioti; ribosomi in tutti e due ma con velocità diverse, membrana citoplasmatica con steroli nei eucarioti, parete cellulare è una struttura complessa nei procarioti, riproduzione sessuata o asessuata nei procarioti; nucleoide nei procarioti.

La vita di un batterio

Metabolismo: la cellula microbica è un sistema aperto in cui le sostanze dell'ambiente esterno entrano, vengono trasformate conservando parte dell'energia ed infine vengono eliminati i prodotti di scarto.

Riproduzione (crescita): duplica tutto; la cellula necessita di proteine e macromolecole per i componenti della nuova cellula, quindi anche di energia ATP per fare una copia del genoma. Sono capaci di dirigere una serie di eventi biochimici che risultano nella crescita e nella divisione per dare origine a due cellule.

Differenziamento: (non tutti i batteri) i batteri che compiono questo processo, nel quale si formano nuove sostanze o strutture, sopravvivono meglio e di più; le cellule possono avere strutture cellulari particolari (es. spore).

Sporulazione: processo temporaneo messo in atto in condizioni difficili, può durare anche migliaia di anni, torna alla forma vegetativa quando non è più in pericolo.

Interazione: interagiscono tra loro per mezzo di sostanze chimiche (segnali) rilasciate nell'ambiente o assunte da questo.

Movimento: strutture specifiche (flagelli) permettono il movimento autonomo degli organismi viventi; si avvicinano agli anaboliti e si allontanano da fonti di rifiuto o calore.

Evoluzione: le cellule si evolvono mostrando nuove proprietà biologiche evidenziata da alberi filogenetici; l'evoluzione è condizionata da fattori ambientali e basata su mutazioni genomiche e fenotipiche.

Organismi procarioti

Gli organismi procarioti sono comparsi prima degli eucarioti, in successione sono comparsi gli anaerobi, i fotosintetici, i cianobatteri, gli aerobi. (Nessuna forma primordiale è scomparsa). I batteri sono organismi singoli, ogni cellula batterica può vivere un'esistenza indipendente. I cianobatteri sono fotosintetici responsabili della comparsa di ossigeno nell'atmosfera.

Omologia tra microrganismi procarioti/eucarioti

Viene rappresentata da un albero filogenetico: viene determinato dal sequenziamento comparato del gene che codifica per l'rRNA 16S presente nella subunità minore del ribosoma. Questa tecnica è usata quotidianamente e si basa sul principio che maggiore è la differenza nella sequenza di RNA ribosomiale tra due o più organismi, più grande è la loro distanza evolutiva.

• Estrazione del DNA delle cellule; il gene codificante l'RNA ribosomiale viene isolato.
• Amplificazione (PCR= metodologia che permette di amplificare ciò che è presente in piccole quantità, ad esempio amplificazione genica, anche su cellule morte) del gene che codifica l'rRNA.
• Sequenziamento del gene.
• Confronto (allineamento) computerizzato delle sequenze, e un algoritmo le paragona generando un albero filogenetico.

Archea

Organismi estremofili scoperti negli anni '70.

• Hanno un progenitore comune con gli Eukarya (i batteri derivano da un ramo diverso).
• Ambienti estremi: laghi salati, temperature elevate, gas a pressioni elevate.
• Non si riesce a riprodurre le condizioni per riprodurli.
• Peptidoglicano non è presente, al contrario degli altri batteri.

Luis Pasteur

(1822-1895) padre della microbiologia. È stato il primo a dire che i batteri non si producono da soli, dimostrando l'erroneità della teoria della generazione spontanea.

Eseguì il seguente esperimento:

• Un brodo non sterile viene versato in un matraccio.
• L'apertura del matraccio viene ripiegata a collo di cigno.
• Il brodo viene bollito al calore (sterilizzato).
• Il liquido resta sterile pur essendoci l'apertura verso l'ambiente sterile.
• Se si ripiega il matraccio e il liquido viene messo a contatto con i batteri, prima bloccati nell'ansa, il liquido si contamina.

Scoprì che nell'aria erano costantemente presenti cellule microbiche che non potevano essere distinte dagli organismi trovati in un gran numero di materiali in putrefazione.

Agenti patogeni e non

Solo alcuni batteri sono causa di malattie. Le patologie microbiche che erano le cause di morte maggiori nel 1900 erano influenza, polmonite, malattie dell'infanzia, difterite; cento anni dopo sono maggiori le morti per cancri, malattie al cuore, rispetto a quelle microbiche. Dal 1880 al 1900 si sono scoperte la maggior parte delle patologie (gonorrea, malaria, difterite, salmonella, ...).

La maggior parte dei microorganismi non svolge funzioni patogene. Possono svolgere un'azione nella catena alimentare: uccidendo i batteri, bloccando la loro moltiplicazione mediante il freddo creando un ambiente sfavorevole, aggiungendo additivi al prodotto finito. Possono anche essere sfruttati per processi fermentativi di cibi e bevande.

Alcuni batteri svolgono un ruolo nel ciclo dell'azoto, del carbonio e dello zolfo: fissazione, nitrificazione, denitrificazione. Altri ancora vengono studiati per preparare vaccini e curare malattie, caratterizzati con metodi biotecnologici.

Altri batteri vengono utilizzati per produrre energia o risanare l'ambiente: fermentazione, biorisanamento di acque e suolo, biocarburanti, per trasformare prodotti minerali grezzi; altri usati nelle biotecnologie farmaceutiche: batteri geneticamente modificati per produrre sostanze farmaceuticamente utili (ormoni della crescita GH precedentemente preso dai cadaveri in piccole quantità, insulina che verrà clivata dall'organismo per essere utilizzata e IFN), per la terapia genica di alcune malattie per produrre un gene corretto in grande quantità.

Batteri nel nostro corpo che convivono con noi impedendo ad altri di sopraggiungere (nel naso, sulla cute, sull'area vaginale, nell'intestino, area faringea); sono soprattutto batteri delle mucose.

Coltivazione dei batteri

Terreni

I batteri vengono coltivati su terreni di coltura liquidi o solidi, sia a scopo diagnostico (es. tampone) sia tassonomico. I progressi in batteriologia sono legati alla messa a punto di terreni di coltura per studiare i batteri.

I terreni devono soddisfare le esigenze metaboliche del batterio; il primo è stato il brodo di carne che è ricco di proteine, però non si conosceva la sua composizione e doveva essere preparato ogni volta, consentiva la crescita di molti microorganismi ma non era utilizzabile per tutti. I batteri dopo un po' smettevano di moltiplicarsi e la crescita modificava le caratteristiche del brodo perché il terreno si acidificava.

Componenti del terreno:

• Peptoni (triptoni): peptidi di lunghezza molto elevata, proteine vegetali parzialmente digerita da tripsina per penetrare facilmente nel batterio.
• Amminoacidi essenziali e non.
• Sistema tampone per non far diventare il terreno troppo acido (anche se alcuni prediligono un pH acido bisogna mantenere pH neutro).
• Solfato di ferro, AGCT.
• Non contengono generalmente siero, rispetto al terreno delle cellule eucariote; solo per batteri esigenti viene aggiunto il siero animale (contiene elementi trofici derivati da vari organi che non si è ancora in grado di preparare sinteticamente).

I terreni solidi sono preparati come quelli liquidi, ma prima della sterilizzazione viene aggiunto l'agar (terreno agarizzato), una sostanza che solidifica il terreno. Serve per separare batteri diversi, non conferisce vantaggi nella crescita batterica e le caratteristiche del terreno liquido non variano.

Venne utilizzato per la prima volta nel 1881 da Fannie Hesse. L'agar è un polisaccaride estratto dalle alghe, atossico, che solidifica a 42 °C e liquefa a 95 °C, quindi resta semisolido a 60 °C. Non permette movimento dei batteri, consente l'isolamento di diversi stipiti batterici talora riconosciuti da forma, colore e dimensione; consente la diffusione dei nutrienti ma non viene metabolizzato dai batteri. I terreni agarizzati servono per clonare i batteri; i cloni possono essere poi cresciuti sia su piastre agarizzate che in terreno liquido.

Le colonie batteriche posso presentare una diversa morfologia, possono presentare batteri satellitari (quando il terreno è vecchio); la pigmentazione permette di classificarli; i terreni vengono sterilizzati in autoclave prima dell'inoculo batterico.

La manipolazione batterica avviene con delle tecniche asettiche, il materiale viene precedentemente sterilizzato (anse, piastre, provette). La sterilizzazione distrugge tutte le forme di vita (incluse le spore) mediante stufe (a secco), autoclavi (120 °C, 1 atm), filtrazione (con siringhe), agenti chimici o fisici a seconda del substrato da analizzare.

Le tecniche antisettiche impediscono l'apporto di contaminanti su un substrato già sterile mediante cappe per colture di microorganismi, stanze per confezionare prodotti iniettabili, sale operatorie. La disinfezione (antisepsi) uccide i microorganismi patogeni e riduce i saprofiti mediante agenti chimici poco tossici (disinfettanti) applicati anche su tessuti viventi (mani, ferite), decontaminano oggetti e superfici inanimate (cute). L'igienizzazione serve a ridurre la carica microbica utilizzata nell'industria alimentare (trattamento diverso se l'oggetto deve entrare o meno in contatto con gli alimenti).

Diversi tipi di terreni

Vengono distinti in selettivi o elettivi:

• Selettivi: favoriscono la crescita di particolari batteri pur in presenza di una popolazione mista come in vivo, quindi inibiscono selettivamente la crescita di alcuni microrganismi ma non di altri. Contengono sostanze che inibiscono i saprofiti (es. verde-metile è in grado di inibire i saprofiti e lascia moltiplicare i patogeni) e consentono la selezione di un certo stipite batterico.
• Ad esempio nel terreno all'agar sangue, arricchito di globuli rossi prima della sterilizzazione, i globuli restano intatti e l'obbiettivo è quello di vedere i batteri che sanno lisare i globuli; serve per selezionare i batteri emolitici che formano un alone (Strept. pneumoniae = polmonite, pyogenes = scarlattina, faecalis, Bordetella pertussis, Corynebacterium diphtheriae).
• Ad esempio invece nel terreno all'agar cioccolato i globuli vengono aggiunti dopo la sterilizzazione distruggendo i globuli per vedere i batteri che semplicemente utilizzano l'emoglobina; il terreno diventa più scuro, sangue aggiunto al calore (120 °C), emoglobina cotta (Neisserie meningitidis, gonorrhoeae).
• Elettivi: migliorano la capacità moltiplicativa di alcuni batteri prescelti, e non vengono inibiti gli altri batteri; per esempio variando il pH (pH più basico favorisce Vibrio cholerae); terreni a scopo diagnostico e tassonomico.

Preparazione dei campioni da coltivare

Possono derivare da sangue, urina, liquor, secreti mucosali. I campioni vengono distribuiti su Petri utilizzando anse di platino che hanno dimensioni calibrate per recuperare una quantità definita di campione; oppure spatole di vetro generalmente alla fiamma per distribuire i batteri sul terreno agarizzato.

I batteri vengono distribuiti in modo diverso a seconda della necessità:

• Striscio: consente l'isolamento di colonie singole e separate, per isolare ceppi batterici diversi, anche partendo da una carica di partenza elevata.
• Spatolamento: consente una crescita uniforme quando la carica batterica non è molto elevata senza avere una patina uniforme.
• Infissione in agar: consente la caratterizzazione di aerobi stretti e facoltativi, i batteri crescono ad albero rovesciato (i batteri crescono di più in profondità e gli aerobi più vicino all'apertura).
• Inclusione: consente crescita anche tridimensionale (le sarcine crescono nello spessore all'interno dell'agar).

⟨strong⟩Petri⟨/strong⟩: diede il nome ad un tipo di piastra da lui inventata, formata da una piastra doppia che permetteva la sterilizzazione delle due parti separatamente da terreno; inoltre, in seguito all'aggiunta di terreno fuso nella piastra più piccola, la più grande poteva fungere da coperchio, prevenendo così le contaminazioni.

Condizioni di crescita

La crescita batterica dipende da vari fattori:

• Nutrienti: (esigenze metaboliche): organismi differenti richiedono differenti categorie di nutrienti spesso in forma specifica.
• Temperatura: ogni batterio cresce in un intervallo di temperatura definito da tre temperature cardinali: minima, ottimale e massima. La T di crescita è più ampia di quella ottimale ma alla T min/max il batterio si moltiplica in modo non ottimale; sotto la T min sopravvive ma non si moltiplica (fino a -180 °C) e sopra la T max muore (temperatura di inattivazione). La temperatura ottimale permette la classificazione di batteri: psicrofili <20 °C, mesofili 10 °C-44 °C (comprendono i batteri patogeni, si sono adattati ai nostri 37 °C, sono responsabili dei cicli della materia e delle malattie, della fermentazione e del deterioramento dei materiali e degli alimenti), termofili 45 °C-70 °C, ipertermofili 70 °C-90 °C e 90 °C-110 °C. L'inattivazione viene effettuata generalmente al calore e non avviene con il raffreddamento.
• Gli Archea invece sono estremofili e le loro proteine sono in grado di sopportare ambienti a condizioni estreme, vengono quindi sfruttati per isolare geni con funzioni estreme; ad esempio per Taq polimerasi (PCR).
• La diversa temperatura di crescita è legata a particolari caratteristiche strutturali: diversa stabilità alle proteine a T elevate e presenza di acidi grassi diversi che determinano una diversa fluidità della membrana (insaturi consentono crescita a T basse, saturi consentono a T elevate). es. Micobacterium hominis (acquisito dagli adulti), M. bovis (bambini), M. avium (adulti immunodepressi): isolati in vitro su terreno di Petragnani a 41 °C.
• Ossigeno: a seconda del fabbisogno di ossigeno vengono classificati in: aerobi stretti, aerobi preferenziali, O₂ tolleranti, anaerobi facoltativi, anaerobi stretti. La classificazione è stata resa possibile grazie all'utilizzo del terreno al tioglicollato di sodio, nel quale si separa un gradiente di O₂ che consente la crescita a diverse concentrazioni di O₂ (la parte bassa è sempre più povera di ossigeno, mentre quella alta ne è ricca).
• Le cabine anaerobiche hanno sostituito i terreni al tioglicollato per manipolare batteri anaerobi stretti. Ad esempio infatti il tetano, causato da spore tetaniche, è difficilmente isolabile perché le spore non possono essere coltivate a causa della presenza di O₂.
• Inoltre alcuni batteri vengono identificati in base alla capacità di fermentare zuccheri, tali batteri vengono evidenziati introducendo uno zucchero nel terreno di coltura e controllando la produzione di gas (non producono gas non fermentano, producono gas fermentano).
• Concentrazione di NaCl: a seconda del fabbisogno di NaCl i batteri vengono classificati in: non alofili che non tollerano sali (Escherichia coli), alotolleranti tollerano basse concentrazioni (Staphylococcus aureus), alofili (Vibrio fischeri), estremi alofili che vivono nelle saline (Halobacterium salinarum).

Duplicazione batterica

La divisione avviene per scissione binaria ed è preceduta da un metabolismo intenso che implica 2000 reazioni biochimiche di diverso tipo. Alcune riguardano la trasformazione dell'energia, altre la biosintesi di piccole molecole, componenti elementari delle macromolecole, altre ancora forniscono i vari cofattori e coenzimi necessari per le reazioni enzimatiche. Tuttavia le principali reazioni di sintesi sono di polimerizzazione, nelle quali, a partire da monomeri, vengono sintetizzati polimeri, le macromolecole. Queste si accumulano nel citoplasma per essere assemblate in nuove strutture come la parete, la membrana citoplasmatica, i flagelli, i ribosomi, i complessi enzimatici, ecc.

La cellula replica il DNA e accresce notevolmente le sue dimensioni fino alla formazione del setto, un tramezzo divisorio formato dall'introflessione della membrana citoplasmatica e della parete cellulare.

Il tempo di duplicazione è l'intervallo di tempo necessario affinché la popolazione batterica raddoppi il numero di cellule, è generalmente di 20 minuti in condizioni ottimali; e il numero di batteri aumenta in modo esponenziale, dopo n generazioni (duplicazioni) N = N₀ × 2ⁿ.

Le diverse fasi di crescita comprendono:

• Fase di latenza (lag): non avviene aumento delle cellule vive, è una fase lunga se l'inoculo viene prelevato da una coltura vecchia in fase sta...