Microbiologia delle fermentazioni

MORFOLOGIA DEI FUNGHI FILAMENTOSI

I funghi filamentosi influenzano la tipologia di brodo colturale e sulla dispersione dell'ossigeno; a seconda del fungo e del regime di agitazione, i miceli possono avere più forme; come il micelio disperso: nel micelio disperso si notano solo ife e ramificazioni; il terreno si presenta come un liquido pastoso, con la consistenza di uno yogurt; il micelio disperso può formare aggregati lassi chiamati clumps; i clumps sono la forma intermedia tra miceli dispersi e pellets. I pellet sono aggregati sferici e compatti dei miceli dovuti al movimento rotatorio delle eliche; il micelio disperso presenta tutte le cellule attive, e il trasferimento di massa è massimo; tuttavia, nel fermentatore, si crea una viscosità molto alta, e le bolle d'aria entrano in un terreno viscoso; i liquidi viscosi, pastosi, sono non newtoniani;

Nel pellet, la zona esterna è attiva rispetto all'interno, però il brodo si mantiene

più liquido e favorisce la dispersione di nutrienti, scarti e ossigeno; la struttura del pellet diventa più compatta all’aumentare del tempo; i liquidi più fluidi sono newtoniani; più forza si applica al brodo, più questo gira; all’interno del pellet, l’accumulo di sostanze tossiche può portare all’autolisi cellulare;

SCELTA DEL MICROORGANISMO E DEL SUBSTRATO

Il microorganismo utilizzato in un processo industriale viene scelto secondo determinati criteri; il processo fermentativo è caratterizzato dalla conversione del substrato in prodotto, operata dal microorganismo nel fermentatore; il processo a monte della fermentazione è detto upstream process; la scelta del microorganismo e del terreno sono due componenti fondamentali del processo di upstream; il microorganismo può essere isolato dall’ambiente o prelevato da una collezione microbica; Se il microorganismo proviene dalla collezione microbica

è in coltura pura, è caratterizzato dal punto di vista genico e dal punto di vista nutrizionale; se il microorganismo proviene dall'ambiente, è possibile scoprire nuovi applicazioni dello stesso o nuovi prodotti metabolici, ma prima deve essere identificato dal punto di vista morfologico, studiato, isolato in coltura pura; i microorganismi sono ubiquitari, e possono essere cercati casualmente nell'ambiente; prelevando vari organismi, posso attuare un successivo screening per identificare i microrganismi di interesse; altrimenti, posso individuare un microorganismo specifico per le mie esigenze. CARATTERISTICHE DI UN MICROORGANISMO INDUSTRIALE - Un microorganismo deve essere caratterizzato da stabilità genetica; ogni volta che inserisco un microorganismo nel fermentatore, questo si duplica per N volte, e se è geneticamente instabile, per ogni evento di replicazione il tasso di mutazione è alto; se è instabile, anche seè possibile ottenere un microorganismo con caratteristiche desiderate, come una maggiore produzione del prodotto target o una riduzione dei prodotti secondari indesiderati.dalla produzione finale); inoltre, il microorganismo deve essere facilmente coltivabile e deve avere un'alta stabilitàgenetica.dal brodo di coltura, deveorganismi GRAS).flocculare, sedimentare o creare schiuma; il prodotto rilasciato nel brodo deve essere facilmenterecuperabile;Se il prodotto è intracellulare, il microorganismo deve essere facilmente lisabile per ottenere il prodotto;l'accumulo di prodotto nel brodo strutturale può inibire a feedback la via metabolica; la manipolazionegenetica strain improvement permette di evitare repressioni a feedback; alcune volte, il prodotto è tossicoper il microorganismo stesso, quindi selezionare microorganismi che tollerano alte concentrazioni diprodotto sono favoriti; Durante le produzioni eterologhe, quando un microorganismo ingegnerizzato vieneutilizzato per produrre sostanze ( che normalmente non produce), bisogna evitare che il prodotto possaavere effetti tossici;MIGLIORAMENTO GENETICOCi sono due diversi approcci per migliorare geneticamente un microorganismo: Approccio classico,random o per mutagenesi; approccio con mutazioneintenzionale; Il tasso di mutazione spontaneo può essere aumentato esponendo il microorganismo a mutageni chimici e fisici; i mutageni chimici possono essere analoghi delle basi (aggiunti erroneamente nella replicazione e letti erroneamente in seguito) o agenti intercalanti (sostanze planari che si intercalano nella doppia elica e creano scivolamenti nel quadro di lettura); un agente fisico è dato dai raggi UV; analoghi delle basi, agenti intercalanti, raggi UV, aumentano solo il tasso di mutazione, ma non garantiscono la generazione di mutanti vitali o mutanti vantaggiosi; a valle della mutagenesi, i mutanti devono essere sottoposti ad un processo di screening, per verificare se si è ottenuto l'effetto desiderato; la chance di trovare un mutante alto produttore è direttamente proporzionale al numero di mutanti utilizzati; generalmente, le collezioni microbiche giocano un ruolo fondamentale nella conservazione dei microorganismi; Oltre al congelamento a -80°C,

L'aggiunta di agenti crioprotettivi permette di evitare i danni alla cellula dovuti alla formazione dei cristalli di ghiaccio; con questa pratica aumento il tasso di sopravvivenza; il tasso di sopravvivenza varia da microorganismo a microorganismo;

Il microorganismo può essere anche liofilizzato; la liofilizzazione è una rimozione dell'acqua per sublimazione; ovvero dallo stato solido (ottenuto congelando), allo stato gassoso; si ottiene a basse temperature, basse pressioni e sottovuoto;

Un microorganismo è geneticamente stabile quando la sua frequenza di mutazione spontanea è bassa; una mutazione può essere vantaggiosa, svantaggiosa o neutrale nei confronti della mutazione; se la mutazione incide sulla capacità produttiva in modo positivo, essa deve essere conservata congelando la colonia madre; altrimenti, le ulteriori mutazioni possono portare alla perdite di caratteristiche vantaggiose dal punto di vista industriale; l'effetto

della mutazione sul processo produttivo dipende dalla fase del processo in cui si verifica; ha meno peso se avviene durante la fase di scale up, specialmente se è una mutazione vantaggiosa. Esistono dei metodi automatizzati che consentono di effettuare la mutagenesi (con UV) e il successivo screening; questi sistemi compiono la semina e i passaggi tra diversi terreni colturali in un ambiente grande e sterile; l'automatizzazione aumenta la chance di successo. Microbiologia dei processi fermentativi Il fermentatore è uno strumento ottimale all'interno del quale si allestisce la trasformazione del substrato in prodotti. È costituito da un contenitore nel quale immettiamo una cultura pura per cui si mantiene un ambiente sterile. Le prestazioni dipendono da fattori fisici e chimici chiave che devono essere controllati; questi sono la temperatura, il pH, l'ossigeno, la produzione di schiuma e l'agitazione. Un fermentatore: - deve lavorare in modo asettico per

evitare contaminazioni della cultura e fuoriuscite. Il contaminante può mangiare il substrato per il nostro microrganismo oppure formare la schiuma e altri metaboliti che intralciano la purificazione;

- Deve avere una adeguata agitazione ed areazione;

- deve dare un limitato consumo energetico siccome le fermentazioni possono durare settimane o giorni;

- deve garantire un controllo e misura di temperatura pH: ci sono delle sonde che si trovano all'interno del fermentatore per controllare il pH;

- si deve avere la possibilità di prelevare il campione in sterilità senza contaminazione;

- si deve evitare le perdite di evaporazione perché comunque si lavora a 30 °C, c'è agitazione e ossigeno immesso;

- Il contenitore deve essere costituito con un materiale che può essere vetro o acciaio, che forma superfici lisce per i microrganismi che ne aderiscono ad esse.

Le fermentazioni si possono dividere in due grandi categorie:

- strato sommerso: è

una fermentazione in cui il terreno è il liquido nel quale sono contenuti nutrienti per le cellule ed è ad alto costo. Utilizzano strato liquido come le melasse. La degradazione del substrato è molto veloce per questo si pensa ad una immissione del substrato. Ci vogliono ore per la fermentazione. Il sistema coinvolge due fasi: fase liquida dove sono dispersi gli alimenti e fase gassosa ovvero la fase attraverso cui forniamo ossigeno. La quantità di inoculo è piccola. L'agitazione è essenziale. - strato solido: il microrganismo utilizza una superficie solida; è applicata a funghi filamentosi in quanto crescono a ife. Non c'è acqua ma un'alta umidità ed è a basso costo. In questo caso si utilizzano strati solidi come cereali non troppo spessi per facilitare gli scambi gassosi. Il tempo di degradazione del substrato avviene lentamente senza immissione del substrato. Ci vogliono settimane per la fermentazione.acqua che ricopre il substrato e fase gassosa in cui l'aria circola intorno al substrato. Durante la fase solida, il substrato fornisce i nutrienti necessari per la crescita dei funghi. Durante la fase liquida, il film di acqua fornisce l'umidità necessaria per la germinazione delle spore e la crescita dei miceli. Durante la fase gassosa, l'aria fornisce l'ossigeno necessario per la respirazione dei funghi. Questo ambiente ottimale permette ai funghi di crescere e riprodursi in modo efficace.