Microbiologia

Introduzione ai microrganismi

Microrganismo = cellula di un organismo vivente, procariote o eucariote, non visibile a occhio nudo (si rende necessario l’uso del microscopio ottico): dal Saccharomyces cerevisiae all’E.coli.

Tipi di cellule

Cellula procariote = cellula priva di un nucleo delimitato da una membrana: es. batterio.

Cellula eucariote = cellula avente il nucleo racchiuso da una membrana, morfologicamente più complesse e generalmente di dimensioni maggiori rispetto alle cellule procarioti.

Virus = non sono cellule, sono i più piccoli microrganismi, responsabili di patologie importanti, possono infettare e uccidere le cellule batteriche.

Caratteristiche delle cellule

Tutti gli organismi sono costituiti da cellula/e (organismi unicellulari e organismi pluricellulari), ognuna delle quali ha una propria “identità” garantita da un rivestimento che permette loro di mantenere la propria integrità (omeostasi), ma anche di comunicare e interagire con l’ambiente, la membrana cellulare.

Il mantenimento nel lungo periodo di una specie cellulare è garantito dalla riproduzione della cellula stessa in due cellule identiche alla parentale, grazie alla metabolizzazione di molecole provenienti dall’ambiente al fine di ottenere una fonte di carbonio e di energia; metabolismo che è anche coinvolto nella motilità, comunicazione e differenziamento cellulare (es. processo di sporulazione).

Perciò le cellule sono dotate dell’informazione necessaria, rappresentata dalle proteine e dal DNA, grazie alla quale duplicazione si riproducono fedelmente le informazioni geniche che vengono trasmesse dalla cellula parentale verso le figlie, al fine di garantire il mantenimento delle caratteristiche specifiche. È anche evidente che bisogna duplicare il DNA il più fedelmente possibile al fine di evitare mutazioni.

Classificazione degli organismi viventi

La classificazione generale degli organismi viventi risale al 1886 con E.Haeckel il quale all’usuale classificazione propose e aggiunse il regno dei protisti, dentro al quale si potevano inserire tutti quegli organismi come protozoi, funghi, alghe e batteri che non rientravano nei due regni tradizionali di piante ed animali.

Successivamente, con l’uso del microscopio elettronico tra il 1938 e il 1962, divenne evidente e ben distinguibile l’esistenza di due tipologie differenti di cellule: i procarioti ed eucarioti.

Nel 1969 Whittaker propose una scissione dei protisti proponendo come regni: monera (batteri), protisti (protozoi e alghe), funghi, piante, animali.

Infine nel 1990 C.Woese, insieme ad alcuni ricercatori americani e grazie agli studi filogenetici con metodi molecolari sul sequenziamento del RNA ribosomiale, costruì l’albero filogenetico descritto non più da regni ma da domini: Bacteria, Archaea, Eukarya.

Elementi chimici in un organismo

Quali sono i principali elementi chimici che compongono un organismo?

In una cellula batterica tipo, il carbonio (50%), l’azoto (14%), l’ossigeno (20%), l’idrogeno (8%), il fosforo (3%) e lo zolfo (1%) sono elementi chimici presenti strutturalmente nelle macromolecole biologiche (proteine, DNA, RNA, polisaccaridi semplici) e anche nelle altre molecole organiche semplici (aa, zuccheri, basi, cofattori, vitamine). La presenza dei CHNOPS si rende quindi necessaria nei terreni di coltura in precise quantità sia per la crescita della popolazione che per la duplicazione.

Fonti di energia e tipi di organismi

Dalle fonti di energia utilizzate per la fabbricazione, attraverso complesse reazioni metaboliche che consumano energia a partire da metaboliti precursori e molecole inorganiche come ammonio e solfato, di macromolecole come proteine, DNA e RNA, si possono distinguere gli organismi in:

• Eterotrofi = fonte di carbonio è organica, come il glucosio ma anche il petrolio.
• Autotrofi = fonte di carbonio è l’anidride carbonica.
• Fototrofi = fonte di carbonio è la luce (cianobatteri e alghe procarioti), con fotosintesi ossigenica o anossigenica.
• Chemio-organotrofi = fonte è l’ossidazione completa della sostanza organica.
• Chemio-inorganotrofi o chemiolitotrofi = fonte è l’ossidazione completa della sostanza inorganica, tipica solo di alcuni batteri coinvolti nel ciclo degli elementi.

Importanza dei microrganismi

L’importanza dei microrganismi è data dal fatto che costituiscono il gruppo più popoloso di organismi (2.5*10³⁰ sole tipologie di batteri), si trovano in ogni parte del globo e hanno un ruolo fondamentale nel riciclo degli elementi essenziali, alcuni di questi sono anche fonte di nutrienti (batteri lattici e fermentazione) mentre altri sono capaci di fotosintesi. Sono quindi definibili come piccole bioindustrie, oggetto di studio da parte della microbiologia.

Dominio dei Bacteria

Nel dominio dei Bacteria si trovano tutti microrganismi procarioti, di cui la maggior parte è costituita da singole cellule e contenente nella parete il peptidoglicano. La maggior parte non sono patogeni (si stima siano noti solo il 5% di batteri di cui il 5% sono patogeni) ed hanno un ruolo fondamentale nel riciclo dei nutrienti, possono sopravvivere anche in una infinità di ambienti.

Dominio degli Archaea

Gli Archaea sono tutti procarioti, abitanti ambienti estremi che si distinguono dai Bacteria non solo per sequenze ribosomiali caratteristiche ma anche perché non contengono peptidoglicano nella parete e non si conoscono fino ad oggi specie patogene.

Dominio degli Eukarya

Negli Eukarya sono presenti tutti gli eucarioti come animali e piante e microrganismi eucarioti (protisti: alghe unicellulari, protozoi e muffe) e funghi, i quali possono essere unicellulari o pluricellulari, caratterizzati da un nucleo ben definito e da dimensioni notevolmente maggiori.

Storia della scoperta dei microrganismi

La scoperta dei microrganismi si deve a Antony van Leeuwenhoek (1632-1723), il primo ad osservare e descrivere accuratamente i microorganismi come batteri, lieviti e protozoi. Si sviluppò allora la teoria cellulare, secondo la quale ogni organismo vivente è formato da unità fondamentali dette cellule, ed ebbe inizio la diatriba sul fenomeno della generazione spontanea, secondo la quale gli organismi viventi potevano svilupparsi dalla materia non vivente o in decomposizione; grande contributo fu dato da Francesco Redi (1626-1697), il quale la smentì per gli animali di grandi dimensioni con un semplice esperimento: prese tre pezzi di carne, uno lasciato all’aria senza protezione, uno contenuto in un recipiente sigillato con un foglio di carta che impediva l’ingresso delle mosche e l’ultimo ricoperto da una fitta garza che impediva l’ingresso delle mosche ma non il passaggio dell’aria, inoltre se la garza veniva posta su un pezzo di carne fresca con il recipiente sigillato con il foglio di carta si osservava lo stesso la crescita delle larve. Si rese noto allora che le larve potevano derivare solo dalle uova e non dalla carne per generazione spontanea.

Contributo di altri studiosi

Un altro studioso, John Needham (1713-1781), riprese la discussione, essendo convinto sostenitore della teoria della generazione spontanea: bollito e sigillato il brodo di montone nelle beute, osservò infatti che questi diventavano torbidi a causa della presenza di microrganismi (le spore sono resistenti alla bollitura).

Lazzaro Spallanzani (1729-1799), noto naturalista italiano, al contrario sperimentò che se la beuta era sigillata ermeticamente allora il brodo si manteneva intatto. Diatriba che si risolse definitivamente con Louis Pasteur (1822-1895), il quale, ponendo in un matraccio il brodo di coltura, la cui imboccatura venisse poi rimodellata a collo di cigno tale da permettere il passaggio di aria ma non di “particelle” e successivamente portando a ebollizione, dimostrò che il brodo si conservava, ma se il collo del pallone fosse stato rotto, questo avrebbe permesso l’intorbidimento.

Da John Tyndall (1820-1893), invece, venne il contributo della dimostrazione che la polvere conteneva microrganismi e l’esistenza di forme batteriche eccezionalmente resistenti al calore (le spore).

Ruolo dei microrganismi nelle malattie

L. Pasteur riuscì inoltre anche a capire il ruolo dei microrganismi nelle malattie, fatto non poi così ovvio e difficile nello stabilire una connessione che dipendeva dallo sviluppo di tecniche specifiche per lo studio dei microbi, partendo da un problema pratico (colera dei polli, rabbia).

Età dell'oro della microbiologia

Durante l’età dell’oro della Microbiologia (1857-1914) furono identificati molti organismi responsabili di malattie, si intraprese lo studio del metabolismo microbico e la raffinazione delle tecniche microbiologiche e miglioramento della comprensione del ruolo dell’immunità e di come controllare e prevenire le infezioni microbiche: es. Agostino Bassi sempre partendo da un problema pratico dato dalla presenza di un fungo nei bachi da seta.

Postulati di Koch

La vera prova finale appartiene a Robert Koch che stabilì la relazione tra l’antrace (patologia) e il bacillo del genere Bacillus anthracis, sviluppando dei postulati detti postulati di Koch (1881) al fine di correlare la presenza di un agente patogeno con lo sviluppo della data malattia:

• Il microrganismo deve essere presente in tutti gli individui affetti dalla malattia e assente negli individui sani: esistono tuttavia i portatori sani che sviluppano la malattia si immunizzano con anticorpi naturali.
• Il microrganismo deve essere isolato dall’individuo affetto e, posto in coltura, deve dare origine a una popolazione cellulare omogenea: in un campione biologico bisogna dimostrare la presenza del microrganismo trattando il campione e inseminando una coltura, al fine di ottenere una popolazione omogenea con tutte le colonie dello stesso ceppo.
• L’inoculo di una coltura pura del microrganismo in individui sani può causare la comparsa della malattia di cui è ritenuto responsabile: un’aliquota della coltura è utilizzata per infettare un animale modello che riproduca lo stesso tipo di patologia e sintomi.
• Il microrganismo deve essere reisolato dall’organismo infettato sperimentalmente in cui la malattia sia insorta: dal modello animale devo isolare lo stesso microrganismo che ha infettato l’uomo.

Tuttavia si stima che solo il 5% dei batteri siano conosciuti e ancora meno dei quali è possibile creare un terreno di coltura (es. modello animale non disponibile). Inoltre, si incominciò a capire con il passare del tempo che l’insorgenza delle patologie era dovuta alla codificazione di geni e talvolta anche di proteine, definendo così i postulati di Koch molecolari:

• Il gene implicato nella patogenicità o virulenza deve trovarsi in tutti i ceppi patogeni di una data specie ed essere assente nelle specie non patogene: patogenicità = microrganismo che induce la patologia, il ceppo può essere patogeno oppure no; virulenza = manifestazione violenta della patologia, il ceppo è patogeno con una virulenza variabile (es. E.coli ceppo B, E.coli K12).
• L’inattivazione selettiva del gene deve portare a una diminuzione misurabile della patogenicità o virulenza.
• La complementazione o reversione della mutazione deve ripristinare il livello originario di patogenicità o virulenza. Parimenti l’introduzione del gene in un ceppo non patogeno lo trasforma in patogeno. Il wild type è patogeno, mentre il mutante ha il gene inattivato e quindi ha perso la patogenicità; pertanto se il mutante lo trasformo introducendo il gene tolto al wild type, allora il ceppo dovrebbe tornare a sintetizzare il prodotto coinvolto nella patogenicità.

Il lavoro di Koch ha permesso la scoperta o lo sviluppo di:

• Agar = agente gellificante/solidificante del terreno.
• Piastre di Petri = in sostituzione alle fette di patate.
• Nutrient broth e nutrient agar.
• Metodi per isolare i microrganismi.

Altri sviluppi furono apportati da Charles Chamberland (1851-1908) che mise a punto dei filtri di porcellana per studiare la malattia del mosaico del tabacco (perforazione delle foglie) causata da quello che si scoprì essere un agente infettivo ancora più piccolo del batterio, ovvero il virus del mosaico del tabacco in grado di passarci attraverso.

Microbiologia e suoi impatti

La microbiologia è lo studio dei microrganismi (batteri, alghe, funghi, protozoi), organismi microscopici che si presentano sia in forma unicellulare che pluricellulare; comprende anche lo studio dei virus, che sono microscopici, ma non cellulari e si comportano come esseri viventi quando entrano in una cellula.

La microbiologia ha anche impatto nella microbiologia industriale e ecologia microbica: studi e sviluppi basati sul lavoro di Pasteur dimostrano che la fermentazione alcolica ed altre erano risultato di attività microbica e non chimica e sviluppa anche il processo di pastorizzazione per conservare il vino (che fu allargato al trattamento del latte successivamente). La microbiologia di base studia i gruppi individuali di microbi, fisiologia, genetica, biologia molecolare e tassonomia microbica, ma se applicata affronta problemi pratici come malattie, acqua, cibo e microbiologia industriale.

Cellula procariote

I microrganismi comprendono cellule sia eucariotiche che procariotiche: i miceti (lieviti e muffe) e le alghe hanno cellule eucariotiche, i batteri e gli Archaea invece possiedono cellule procariotiche (anche se filogeneticamente gli Archea, dati studi di sequenziamento dell’RNA, sono collocati più vicini agli Eukarya).

Morfologia, dimensione e distinzione

I batteri sono invisibili a occhio nudo e hanno generalmente dimensioni dell’ordine dei micrometri (2/20μm), sono quindi favoriti dal rapporto superficie/volume ed essendo per lo più unicellulari presentano una varietà di forme:

• Cocco: forma sferica più o meno ovale, alla divisione possono rimanere attaccati formando i diplococchi oppure formare catene di streptococchi, se invece si dividono su due piani restando uniti in un gruppo di quattro formano le tetradi e su tre piani invece le sarcinie, costituite da otto gruppi di cellule.
• Coccobacillo
• Bacillo: forma bastoncellare, possono rimanere appaiati formando i diplobacilli, oppure catene di streptobacilli e ancora a forma di spirale gli spirilli/spirochete.
• Vibrione: forma di una virgola.

Alcuni batteri, come gli streptomiceti, assumono forme originali formando ife costituite da lunghe catene di cellule dando origine a un micelio simile a quello dei funghi; altri invece, detti batteri peduncolati/prostecati, presentano un peduncolo/prosteca che consente loro di aderire al substrato inerte e di aumentare la superficie di adesione.

Citoscheletro

La proteina FtsZ (Filamentous temperature-sensitive protein Z), simile alla tubulina eucariotica, agisce durante il processo di divisione cellulare, localizzandosi in posizione mediana e formando un anello, il quale coordina la sintesi della nuova parete cellulare che separerà le due nuove cellule (setto). La sua funzione quindi è fondamentale.

La proteina MreB, nei batteri a bastoncello, simile all’actina, forma una struttura elicoidale/a spirale a livello della membrana citoplasmatica, che porta a un allungamento, inoltre se inattivata comporta a un progressivo aumento del diametro cellulare fino a causare una modificazione morfologica delle cellule, portando a un arrotondamento.

Nel batterio vibrione Caulobacter crescentus, primo batterio dove fu isolata per la prima volta, è anche presente un altro tipo di proteina CreS (crescentina) simile ai filamenti intermedi e responsabile della curvatura della cellula. In generale queste proteine hanno la funzione di mantenere la forma della cellula batterica, definirla e controllarla interagendo anche con i meccanismi della biosintesi della parete.

Membrana plasmatica interna

Le cellule interagiscono in modo complesso, completo e selettivo con l’ambiente che le circonda grazie alla membrana plasmatica che delimita il contenuto cellulare in uno spazio definito, separandolo dall’esterno. In alcuni batteri fotosintetici rossi sulfurei è presente un complesso sistema di membrane interne connesse alla membrana citoplasmatica, mentre membrane interne ad assetto lamellare si trovano nei batteri nitrificanti: modificazioni correlate all’attività metabolica di conversione dell’energia luminosa in energia chimica e ossidazione dei composti organici.

La maggior parte dei lipidi che compongono la membrana di Bacteria e Eukarya sono fosfolipidi in cui la testa polare è rappresentata da D-glicerolo 3–fosfato e la coda da due molecole di acidi grassi (in maggioranza saturi) non ramificati esterificati al C₁ e C₂ dello scheletro, mentre al fosfato esterificato al C₃ possono essere legati gruppi funzionali come l’etanolamina eparina: bilayer lipidico.

È importante il rapporto tra acidi grassi insaturi/saturi poiché contribuisce a controllare la fluidità della membrana in quanto la presenza di catene lipidiche con doppio legame ne diminuisce la viscosità. La struttura generale dinamica è stabilizzata da interazioni idrofobe e da cationi divalenti come Mg²⁺ e Ca²⁺.

La differenza sostanziale è però l’assenza nei batteri degli steroli, ovvero dei lipidi caratterizzati da un nucleo a quattro anelli aromatici come il colesterolo, cui però fanno eccezione i batteri metilotrofi e i micoplasmi, i parassiti obbligati intracellulari che non possiedono parete ma sono dotati di una membrana citoplasmatica più rigida e che ricavano gli steroli dall’ospite, poiché non sono in grado di sintetizzarli. Nella maggior parte dei batteri invece sono presenti gli opanoidi, molecole analoghe agli steroli, di cui il più comune è il diploptene.

Contengono inoltre anche svariati tipi di proteine come le proteine integrali di membrana, proteine periferiche e lipoproteine, che nei Gram-positivi svolgono varie funzioni.