Microbiologia

TTGACA,- sito di binding del ribosoma = sequenza Shine-Dalgarno- coding region = con il codone di STOP finale

L'operone quindi è un insieme di geni strutturali (operone monocistronico o policistronico) la cui espressione e trascrizione viene controllata in modo coordinato.

A monte si ha una regione promotore, una sequenza di DNA alla quale si lega la RNApolimerasi e che dirige l'inizio della trascrizione, seguita dalla regione operatrice (detta sito di legame dell'attivatore o operatore), alla quale si legano le proteine regolatrici che possono favorire il legame della RNA polimerasi al promotore stimolando l'inizio della trascrizione (attivatrici) oppure possono legarsi alla sequenza dell'operatore inibendo la trascrizione (repressori).

A loro volta le proteine regolatrici devono essere codificate da un gene sotto il controllo di un proprio promotore, situato tra la regione del promotore del gene regolatore e il promotore dell'operone (linee tratteggiate).

i geni di tali proteine non fanno parte dell'operone infatti spesso si possono trovare anche distanti dallo stesso, quindi la proteine per interagire deve essere diffusibile. Si può anche avere la piccola molecola effettore (effettore) che si lega all'attivatore o al repressore modificandone l'attività di regolazione: è induttore quando causa un incremento della trascrizione attivando la proteina attivatrice o disattivando il repressore, si dice invece corepressore se causa una diminuzione della trascrizione attivando il repressore. Sistemi di regolazione trascrizionale Quando un "segnale esterno" (ad esempio la presenza di uno zucchero specifico nell'ambiente) conduce all'espressione di un insieme di geni necessari (catabolismo dello zucchero), si parla di sistema inducibile: • Regolazione negativa trascrizionale: il legame della proteina regolatrice repressore all'operatore del DNA blocca la trascrizione, quindi le regioni -10 e -35 non si legano alla RNApolimerasi oppure anche se si legassero non procederebbero per l'ingombro sterico. L'aggiunta di un induttore al repressore porta alla formazione del complesso repressore-induttore che non si può legare al sito di binding e quindi la trascrizione procede. - Regolazione positiva trascrizionale: il legame dell'attivatore al sito di binding corrispondente avviene solo con l'aggiunta di induttore, ovvero è il complesso attivatore-induttore che è attivo e che favorisce la trascrizione aumentando l'efficienza e l'affinità. Operone lac: La regolazione del catabolismo del lattosio in E.coli rappresenta il sistema più noto e studiato: regolazione negativa trascrizionale di un sistema inducibile. L'utilizzazione del lattosio, disaccaride composto da glucosio e galattosio uniti da un legame 1,4-b-galattosidico, richiede la scissione dello zucchero nei suoi due costituenti che poi entreranno nelle.

Le vie metaboliche specifiche coinvolte nell'utilizzazione del lattosio sono regolate da meccanismi complessi. Il lattosio non può entrare nella cellula batterica per diffusione semplice, ma grazie alla lattosio permeasi, una proteina presente nella membrana plasmatica. La sintesi di questa proteina è normalmente repressa in assenza di lattosio e indotta in sua presenza. Allo stesso modo, l'enzima β-galattosidasi, la cui quantità dipende dall'aggiunta di lattosio, aumenta esponenzialmente se il lattosio rappresenta l'unica fonte di energia.

Un aspetto peculiare del sistema è che l'induttore dell'operone lac non è il lattosio, ma l'allolattosio, una molecola prodotta dalla catalisi dell'enzima β-galattosidasi.

I geni che governano l'utilizzazione del lattosio sono riuniti in due operoni adiacenti edivergenti. Il primo operone contiene il gene regolatore lacI, che codifica per la proteina repressore del secondo operone, il vero operone lac. Quest'ultimo raggruppa i tre geni strutturali: lacZ, lacY e lacA. Il gene lacZ codifica per l'enzima β-galattosidasi,

lacY per la permeasi e lacA (non coinvolto nell'utilizzazione del lattosio) esprime una transacetilasi che trasferisce un gruppo acetile dal coenzima A al gruppo idrossilico del galattoside, ovvero si occupa di detossificare la cellula da galattosidi solforatiti trasportati all'interno della cellula dalla permeasi.

La chiave di tutto però è nel fatto che l'operone lac non è completamente represso e anche in assenza di zucchero sono presenti nella cellula alcune molecole di galattosidasi e di lattosio permeasi, permettendo così l'ingresso nella cellula di una quantità di lattosio sufficiente per indurre l'operone a "regime".

Procedimento: il lattosio induttore si lega al tetramero del repressore, che non si può legare agli operatori, così la RNA polimerasi trascrive i geni lacZ, lacY e lacA.

Il promotore dell'operone lac non è "forte" pertanto necessita di un attivatore trascrizionale.

costituito dal complesso cAMP•CRP, ossia un regolatore positivo CRP(cAMP receptor protein, detta anche CAP) attivato dal nucleotide ciclico cAMP, la cui concentrazione intracellulare è inversamente correlata alla concentrazione di glucosio nell'ambiente. Infatti l'adenilato ciclasi, l'enzima che catalizza la trasformazione di ATP in cAMP, è attivata mediante fosforilazione dall'enzima EIIa-P, il quale viene utilizzato per la fosforilazione del glucosio, quando presente, e quindi non è disponibile per l'adenilato ciclasi: oltre al controllo esercitato dal lattosio tramite il regolatore negato lacI, l'operone lac è anche regolato dal glucosio tramite il regolatore positivo CRP. A ciò si aggiunge anche il fatto che l'enzima EIIa che si forma in seguito alla fosforilazione del glucosio è un inibitore della lattosio permeasi, il trasportatore dellattosio, nonché delle permeasi di altri zuccheri.

meccanismo di regolazione che impedisce l'espressione di un operone per il catabolismo di uno zucchero in presenza di un altro zucchero "preferito" è detto repressione da catabolita ed è alla base del fenomeno di diauxia di E.coli. Curva diauxica- Quando il lattosio è disponibile e il glucosio non lo è, il repressore allolattosio è inattivo e aumentano i livelli di cAMP che si lega alla proteina CAP formando il complesso cAMP-CRP, il quale si lega al DNA a livello di sequenze specifiche nelle regioni regolatrici dei promotori, inducendo un cambiamento conformazionale esponendo alcuni residui della superficie di CRP che ne permettono l'interazione con l'RNA polimerasi e l'attivazione della trascrizione attraverso un dato meccanismo non ancora chiaro: massimi livelli di trascrizione. In presenza di lattosio e glucosio sia la proteina CAP sia il repressore lac sono inattivi e poiché la RNA polimerasi non

può legarsi efficientemente i livelli di trascrizione sono bassi. - Se né il lattosio né il glucosio sono disponibili sia la proteina CAP che il repressore sono attivi ed entrambe le proteine si legano ai rispettivi siti regolatori, i livelli di trascrizione sono bassi. - Se si ha però un aumento nella concentrazione di glucosio e il lattosio non è disponibile, allora conseguentemente diminuisce il cAMP e non si forma il complesso quindi non si ha attivazione: livello minimo di trascrizione di operone lac. Si ha un paradigma nella regolazione dell'operone lac dato dal suo duplice controllo: negativo in risposta al glucosio, esercitato dal repressore lacI, e positivo, in risposta al glucosio, esercitato dall'attivatore cAMP-CRP.

Operone mal: a-1,4. Il maltosio è un disaccaride formato da due unità di glucosio unite dal legame il cui sistema di regolazione è positivo e comprende un vasto numero di geni implicati nel metabolismo.

del maltosio, organizzati in vari operoni che costituiscono un regulone. In assenza di un induttore, lo zucchero maltosio, né la proteina attivatrice né l'RNA polimerasi possono legarsi al DNA. Tutti gli operoni del regulone mal richiedono per la loro trascrizione la proteina MalT, che funge da regolatore positivo e la cui espressione è regolata positivamente dal complesso cAMP•CRP: si ritiene che la proteina esista in due forme attiva e inattiva. Operone arabinosio: modello di regolazione positiva che si contrappone al modello dominante di regolazione negativa dell'operone lattosio: il regolatore AraC svolge il ruolo duplice di attivatore (è richiesto per l'espressione dell'operone in presenza di arabinosio) e di repressore, esercita quindi sia un controllo positivo che un controllo negativo. E.coli può utilizzare il L-arabinosio come unica fonte di carbonio e di energia, il quale agisce come effettore allosterico alterando la

Conformazione di AraC modificandone la geometria delle interazioni. In assenza di arabinosio, AraC si trova in una conformazione dinamica tale per cui può legarsi a siti non adiacenti costringendo il DNA a formare un'ansa impedendo l'ingresso della RNA polimerasi.

Operone galattosio: il regulone per l'utilizzazione del galattosio è costituito dagli operoni galP, che codifica per la galattosio permeasi che è a bassa affinità per il galattosio (funziona ad alte concentrazioni), e mglBAC, che codifica per un trasportatore ABC ad alta affinità, e galETK, che codifica per gli enzimi necessari al metabolismo: galK, galT e galE.

L'espressione di questi operoni è indotta dalla presenza di galattosio. Le reazioni del metabolismo del galattosio catalizzate dagli enzimi costituiscono però una via anfibolica, infatti producono intermedi della via glicolitica ma anche precursori essenziali di polisaccaridi complessi della parete cellulare.

come UDP-glucosio e UDP-galattosio. Quindi il galattosio quando non è presente nell'ambiente deve essere sintetizzato a partire dal glucosio e quando è presente deve essere importato tramite la galattosiopermeasi oppure prodotto intracellularmente dall'idrolisi del lattosio. La regolazione di questo operone è di duplice natura: in presenza di galattosio gli enzimi Gal sono sintetizzati ad alto livello, mentre in assenza solo il gene galE è espresso a livelli ridotti ma sufficienti a soddisfare le esigenze anaboliche. Quando il galattosio è in concentrazioni elevate, quindi è la principale fonte di carbonio, il livello di cAMP è alto e viene attivata la trascrizione. Da notare che l'espressione della galattosio permeasi non fa parte dell'operone ed è regolata da un repressore.