Microbiologia applicata e sperimentale (batteriologia e virologia)

Il vettore di clonaggio e la resistenza all'ampicillina

La resistenza all'ampicillina (Amp) è una caratteristica di un vettore di clonaggio che contiene un sito di clonaggio inserito all'interno di un pezzo di DNA che codifica per una proteina chiamata β-galattosidasi. Oltre ai suoi componenti di base, il vettore contiene anche un gene che codifica per il peptide alfa della β-galattosidasi.

Quando questo vettore viene trasformato in una cellula, conferisce innanzitutto la resistenza all'ampicillina. Inoltre, se viene trasformato in un ceppo mutante di E. coli che è difettivo per la β-galattosidasi, il vettore ripristina il fenotipo funzionante reintroducendo il peptide alfa all'interno della cellula.

Il vettore contiene un sito di clonaggio multiplo, che consiste in una serie di siti di restrizione per diversi enzimi. Questi siti di restrizione possono essere visualizzati nella figura a destra, nella seconda riga, dove sono indicati HindIII, EcoRV,...

EcoRI ecc… Ma se andiamo a vedere la terza riga, vediamo la freccia con scritto ß-Gal-alfa-fragment ed è il punto in cui inizia il DNA, il gene, codificante per il frammento alfa della ß-galattosidasi e vediamo, dalla direzione della freccia, deve essere letto nell’altro verso, verso in cui poi troviamo il codone ATG che è il codone di inizio di tutte le proteine. Quindi, se prendo il ceppo di E.Coli difettivo per la ß-Gal, nelle scorse lezioni abbiamo definito la mutazione ∆M15 ma ce ne sono anche altre e questo ceppo di E.Coli non ha ß-galattosidasi proprio per l’assenza di alfa-fragment, ma se vi metto il vettore che contiene il gene codificante per il peptide alfa, ristabilisce l’attività normale ß-galattosidasica. Se uso il sito di clonaggio multiplo per inserirvi, con enzimi di restrizione, un vettore che voglio clonare, succede che ci infiliamo questo qualcosa che voglio clonare e quindi interrompo il gene.

Che la percentuale di colonie bianche non è alta, spesso, anzi spesso è una percentuale che è la metà molte volte delle cellule blu; infatti, una buona parte dei vettori risulteranno vuoti, senza inserto, ed è una cosa fisiologica.

• Vettori a selezione indiretta, che possono essere selezionati, ma con un passaggio aggiuntivo. In questo caso non si sfrutta l'attività β-galattosidasica della cellula, ma si sfrutta la capacità o meno a un antibiotico. La struttura tipica del vettore è quella in figura, con un origine Ori e abbiamo due geni colorati, uno per conferire R Amp e poi un gene che conferisce resistenza ad un secondo antibiotico, in questo caso la tetraciclina (Tet ). Esistono anche delle varianti con determinanti però di resistenza diversi dalla tetraciclina. Vediamo comunque che in ogni sito di resistenza abbiamo tanti siti di restrizione, ognuno rappresentante per questo un potenziale punto di inserzione.

per un inserto genico. Quindi, se per esempio voglio inserire un inserto usando Pst1R (collocato in Amp), il ceppo batterico che porta all'interno il vettore che ho inserito nel gene rosso, sarà Rtetracicilina resistenza, perché Tet è intonso, non l'ho toccato, ma sarà sensibile all'ampicillina. Se il vettore è scarico quindi il ceppo è resistente sia all'ampicillina che alla tetracicilina, ma se è carico diventa sensibile per- 49 -il farmaco, quel farmaco per cui ho interrotto la resistenza. Viceversa, quindi, se scelgo di mettere l'inserto nel Rgene Tet, avrò un fenotipo invertito, diventa sensibile alla tetracicilna e resistene all'ampicillina. Ma come posso a questo punto andare a distinguere i ceppi, quello ricombinato dal non ricombinato? Posso capirlosoltanto piastrandoli in terreni che contengono l'uno o l'altro, o anche entrambi, gli antibiotici. RImmaginiamo quindi di avere un

• TA cloning, detto anche T vector, sfrutta un principio molto semplice, economico e generalmente di buona resa. Si sfrutta una particolare attività della Taq polimerasi, enzima che si usa per la PCR, esistono alcune Taq più "da battaglia" anche per i costi e altre invece più sofisticate, dotate di certe affidabilità particolari e esattezza nel copiare certi filamenti senza commettere errori perché dotati del classico proof reading. Le Taq più semplici hanno una specifica caratteristica, ovvero aggiungere 1 nt all'estremità 3' di un frammento ds, questo vuol dire che se prendo un pezzo di DNA copiandolo in PCR, se uso una Taq adatta, mi trovo di fronte a un frammento di DNA che se amplificato è fatto dal pezzo di DNA e due codine di A alle estremità 3' che gliele aggiunge proprio la Taq che usiamo. Posso sfruttare

Questa attività serve per fare un clonaggio veloce, disponendo per esempio di un vettore già linearizzato che porta alle sue estremità A aperte, un nucleotide singolo complementare alla A dell'inserto, ovvero una T. Quindi, ricapitolando, mi trovo con l'inserto amplificato, dove ogni copia termina al 3' con un'adenina libera, e il vettore di clonaggio che è aperto e alle sue estremità 3' nel punto di apertura, porta due timine libere. Quello che succede è che si appaiono A e T, andando a completare il vettore e quindi si forma una molecola circolare completa a questo punto. Se io rilego i punti di taglio con la ligasi che rilega i pezzi di DNA staccati, ottengo quindi un vettore circolare completo capace di trasformare una cellula batterica. È chiaro che è una tecnica rapida, veloce, a basso costo perché non usa enzimi di restrizione, e soprattutto mi permette di usare grandi numeri, infatti non devo

tagliare/purificare DNA, così come escono dal termociclatore posso lavorare con questa tecnica.

È anche chiaro che in realtà ci sono delle tecniche che permettono delle ulteriori complicazioni e mezzi di discriminazione. Uno dei vettori più usati è per esempio pGEM T-Vector riportato nella figura alla pagina dopo, Rin cui vediamo che ha un origine Ori, un gene Amp per la resistenza all'ampicillina e poi ha il gene (LacZ) che codifica per l'alfa-peptide della β-galattosidasi e di fatto è proprio il sito in cui può essere aperto per il clonaggio AT; quindi, nel momento in cui ci ho inserito un inserto con le estremità AT, non solo posso clonare come abbiamo visto, ma poi posso farci anche la selezione bianco-blu. E questo vettore è particolare, perché presenta alle due estremità prima delle due T, tanti siti di restrizione per tanti enzimi diversi, infatti, non sempre, anzi MAI, questo vettore è