Microbiologia applicata

Microbiologia applicata

Lez 1: Introduzione

La maggior parte dei microorganismi che vivono attorno a noi sono innocui o indifferenti per l’uomo e solo una piccola parte è patogena; questi ultimi possono essere virus o batteri. Nel corso dei secoli i casi di morte sono cambiati, infatti:

• USA, 1900: la maggiore causa di morte erano le malattie infettive, tra cui l’influenza, la polmonite, la tubercolosi e le gastroenteriti. Si moriva abbastanza frequentemente anche a causa di malattie cardiache e ictus.
• USA, 2000: le maggiori cause di morte sono le malattie cardiache e il cancro (che nel 1900 mieteva molte meno vittime). Le uniche malattie infettive che causano un numero considerevole di morti (comunque molto inferiori rispetto alle altre due) sono l’influenza, le polmoniti e l’AIDS.

Questo ci permette di osservare come siano scomparse certe malattie con il corso del tempo (specialmente quelle infettive) e di come ne siano comparse altre, come ad esempio l’AIDS. Questo cambiamento è determinato dai cambiamenti comportamentali e igienici delle popolazioni, ma anche dalla nascita della microbiologia, avvenuta nella seconda metà dell'‘800. La microbiologia ha studiato le malattie infettive e le sue cause, al fine di prevenire e curare tali malattie. I principali provvedimenti presi dalla scoperta della microbiologia sono:

• La prevenzione
• Il trattamento (non implica l’eliminazione del patogeno)
• La cura (implica l’eliminazione del patogeno)

Nel 1929 Flemming scoprì la penicillina grazie a un esperimento in cui si accorse che uccideva i batteri in una colonia di muffa. Iniziò così ad usarlo sugli umani. L’uso degli antibiotici ha portato quanti ad un ridimensionamento dell’incidenza delle infezioni batteriche (specialmente nei paesi sviluppati e in via di sviluppo), ma non di quelle virali, in quanto i virus sono insensibili agli antibiotici perché sono strutturalmente diversi dai batteri. I virus infatti non hanno proteine bersaglio che vengono riconosciute dagli antibiotici, mentre i batteri sì. Proprio a causa di questa resistenza dei batteri, nel 2000 le malattie infettive che ancora causano decessi sono di origine virale e non batterica.

Se il medico prescrive un antibiotico durante un’influenza (che è causata da virus) è perché un batterio si è instaurato nel corpo già debilitato dal virus, quindi si protegge il paziente dall’infezione batterica.

Microorganismi

Gruppo eterogeneo che include numerose e diversissime forme di organismi viventi e non. Essi possono essere:

• Organismi cellulari (in genere monocellulari)
• Particelle acellulari infettive e patogene.

1) Microorganismi cellulari

• Batteri procarioti
• Archea
• Funghi monocellulari eucarioti
• Protozoi
• Alghe monocellulari

L’analisi filogenetica (RNA ribosomiale) ha portato a dividere gli organismi viventi (cellulari) in 3 gruppi evolutivi, detti domini:

1. Bacteria (batteri) procarioti Intermedo tra gli altri due
2. Archaea (Archea) domini, presenta
3. Eukarya (Eucarioti) caratteristiche di entrambi.

Albero filogenetico:

I. Bacteria (batteri)

Comprendono alcune specie patogene. Sono costituiti da un’enorme varietà di specie e ambienti colonizzati:

• Sono cellula procariote
• Sono organismi monocellulari
• Possono essere chemiotrofi o fototrofi
• Contengono peptidoglicano
• Fanno la riproduzione asessuata
• Sono sensibili agli antibiotici

I batteri si dividono in diverse specie:

• Solo ambientali, apatogene: solfo batteri, cianobatteri ecc.
• Ambientali, occasionalmente patogene (ovvero lo sono se ingeriti): colera
• Alcune specie patogene: difterite, meningococco, salmonella ecc. Esse possono trasmettersi da persona a persona sessualmente o tramite l’ambiente, ovvero respirando (in questo caso passano dall’ambiente prima di entrare in un altro organismo)

II. Archaea (Archea)

Enorme varietà di specie e ambienti colonizzati, non sono stati trovati organismi di archea patogeni, infatti comprendono batteri ambientali non patogeni.

• Sono cellule procariote
• Sono organismi monocellulari
• Sono chemiotrofi
• Presentano una parete batterica priva di peptidoglicano
• Svolgono la riproduzione asessuata
• Sono insensibili agli antibiotici

Spesso sono estremofili (ovvero che vivono in condizioni ambientali estreme):

• Ipertermofili (vivono a temperatura molto alte o molto basse). Resistono alle alte temperatura perché l’acqua al loro interno non bolle perché hanno espedienti per evitare ciò e mantenerli vivi e riproduttivi.
• Alofili estremi (vivono in ambienti molto salati)
• Metanogeni (vivono in presenza di metano)

III. Eukarya (Eucarioti)

• Sono cellule eucariote
• Possono essere organismi monocellulari o pluricellulari
• Possono essere eterotrofi o autotrofi
• Hanno una parete costituita da chitina o cellulosa, ma possono anche essere privi di parete (cellule animali). Non presentano mai il peptidoglicano nella parete
• Possono fare la riproduzione sessuata o asessuata

2) Microorganismi acellulari (virus)

Sono composti dalle stesse molecole di cui sono composti gli organismi viventi, ma non presentano una struttura cellulare (anche se presentano un genoma composti da acido nucleico), inoltre non possono fare il metabolismo e la riproduzione autonomamente. Per questo sono parassiti e patogeni, ovvero usano le cellule ospite per riprodursi e metabolizzare. I virus sono sempre patogeni, ma possono essere sintomatici o asintomatici.

Lez 2: Osservazioni

I microorganismi sono visibili solo al microscopio ottico o elettronico, in quanto i batteri e i protozoi hanno una dimensione nell’ordine dei µm (massimo 1 mm per i protozoi), mentre i virus possono anche essere più piccoli (ordine dei nm). Per questo motivo sono detti microorganismi, perché sono appunto microscopici e quindi visibili solo al microscopio.

In ordine di dimensione si ha: protozoi > funghi > batteri > virus.

I motivi per cui i microorganismi non sono visibili ad occhio nudo e a volte neanche al microscopio sono:

• Caratteristiche fisiche: la loro dimensione è inferiore al potere risolutivo dell’occhio umano
• Caratteristiche chimiche: le cellule dei microorganismi sono piene di acqua e quindi risultano essere trasparenti, perciò il confine tra organismo e ambiente circostante non è ben individuabile. Dal momento che ingrandire l’immagine non basta, bisogna creare un contrasto tra l’ambiente e l’organismo usando la colorazione.

Il potere di risoluzione è la capacità di distinguere due punti vicini tra loro. Quella dell’occhio umano è 0.1 mm. Il microscopio può ingrandire oggetti ad alto contrasto, ma solitamente bisogna creare il contrasto, e lo si fa tramite la colorazione, ovvero l’applicazione di un colorante (sostanza che può anche non essere colorata) per creare un contrasto.

La colorazione permette di apprezzare la forma (morfologia) di un organismo, evidenziando le sue struttura interne, permette anche di analizzarlo, classificarlo e anche di diagnosticare (nel caso in cui si usino anticorpi marcati con una sostanza colorata che colora il campione se l’antigene ricercato è presente. Si può quindi pensare che sia presente una malattia causata da virus o batteri).

I coloranti istologici sono pigmenti colorati in polvere che si aggiungono alla soluzione. Si possono anche usare più coloranti insieme per evidenziare diverse strutture (colorazione differenziale). I coloranti si legano direttamente alle strutture del campione oppure a specifiche molecole inserite nel campione e che si possono legare ad esso. I coloranti si legano a diverse molecole a seconda delle loro caratteristiche. I coloranti possono essere:

• Acidi: hanno una carica negativa, quindi colorano strutture con carica positiva e quindi basiche (chiamate acidofile per la loro interazione con un certo tipo di coloranti) come le proteine citoplasmatiche. Esempi di coloranti acidi sono: eosina, fucsina acida, rosso Congo.
• Basici: hanno una carica positiva e colorano strutture acide (dette basofile) come le membrane o la cromatina. Alcuni esempi di coloranti sono: cristal violetto, blu di metilene, safranina, fucsina basica, violetto di genziana.

Durante l’osservazione, il campione può essere fresco, ovvero vivo e capace di muoversi, oppure fissato (chimicamente o fisicamente) cioè morto e immobile.

Tipi di colorazione istologica

1. Colorazione semplice

Si usa un solo colorante. Il campione viene applicato sul vetrino, essiccato (si lega alla parete del vetrino, ma non saldamente), fissato (effettuabile alla fiamma, lega saldamente il microorganismo, che muore) e colorato (tutti i microorganismi con le stesse caratteristiche appaiono colorati in ugual modo su quel vetrino). Nella colorazione semplice, tutti i microorganismi appariranno colorati nello stesso modo (quelli che si colorano).

2. Colorazione differenziali

Si usano più coloranti al fine di evidenziare microorganismi con strutture organiche diverse. Questa colorazione permette di evidenziare la morfologia e la struttura del microorganismo.

Colorazione di Gram

Consente di evidenziare le differenze strutturali nella parete dei batteri, ovvero i Gram positivi (blu o viola) o i Gram negativi (rossi o fucsia).

• Colorante basico (blu o viola)
• Mordenzazione: soluzione iodio/KI (mordenzante) che fissa il colore e condiziona la cellula per le successive azioni
• Decolorazione: tramite alcool o acetone, serve a decolorare alcuni batteri
• Colorante basico (rosso o fucsia): si colorano di rosso solo i batteri che si sono decolorati

Si osserva che nello stesso vetrino sono presenti batteri blu e batteri rossi.

Colorazione di Ziehl Neelsen (o acido di resistenza)

È un tipo di colorazione che permette di evidenziare i batteri acido resistenti e viene usata anche per individuare il microorganismo che causa la tubercolosi.

• Colorante basico (rosso o fucsia)
• Decolorazione: tramite acido inorganico ed eventualmente alcool. Si decolorano i batteri non acido resistenti.
• Colorazione basica (blu o viola)

Si ottiene quindi che i batteri blu sono non acido resistenti mentre i rossi sono acido resistenti.

3. Colorazione vitale istologica

Per questo tipo di colorazione si usano coloranti non tossici che non uccidono il microorganismo, che può quindi essere osservato vivo e mobile. Permette anche di distinguere le cellule morte da quelle vive perché si colorano solo quelle vive. Inoltre per questo tipo di colorazione non avviene la fissazione, perché essa uccide i microorganismi. Un esempio di colorante è il rosso neutro.

Microscopia

Analisi dei microorganismi mediante l’uso di strumenti che permettono di ingrandire l’immagine del preparato. In biologia i microscopi possono essere ottici o elettronici.

• Il microscopio ottico utilizza la luce visibile come sorgente luminosa e come sistema di ingrandimento utilizza diverse lenti di vetro disposte sequenzialmente. Questo tipo di disposizione permette di ottenere un ingrandimento finale dato dal prodotto dell’ingrandimento delle singole lenti, in quanto ognuna di esse ingrandisce un po’ l’immagine. Es. obiettivo 40x, ottica (o oculare) 10x = 400x. L’ingrandimento massimo per il microscopio ottico è di 1000x e la risoluzione massima è di 0.2 μm. Più è alto l’ingrandimento e meno le immagini sono luminose.
• Il microscopio elettronico utilizza come sorgente luminosa un fascio di elettroni che colpisce il campione, che viene ingrandito da un sistema di magneti. Ci sono due tipi di microscopi elettronici, il TEM ingrandisce al massimo a 1.000.000 x, mentre il SEM ingrandisce a 100.000 x. Entrambi hanno una risoluzione massima di 0.2 nm. Esso permette di vedere strutture più piccole di quanto permettano i microscopi ottici, quindi permette di vedere i virus, che sono proprio stati scoperti con questo microscopio.

Tipi di microscopi ottici

• Microscopio in campo chiaro: è il microscopio ottico classico che permette l’osservazione diretta del campione tramite una luce incidente che attraversa sia il campione che lo sfondo, che devono quindi essere in contrasto tra di loro. Il campione deve essere colorato ed eventualmente fissato, in questo modo la luce che colpisce il campione colorato è bianca e quando fuoriesce è colorata, in questo modo si distingue il campione dallo sfondo.
• Microscopio in campo scuro: questo microscopio permette di vedere il preparato anche senza la colorazione perché il raggio luminoso è diagonale e si disperde quindi nella stanza senza entrare nell’obiettivo, dove entra solo il raggio riflesso. In questo modo il campione è visibile ed illuminato, a differenza dello sfondo, e il contrasto ottenuto è naturale.
• Microscopio a contrasto di fase: consente di vedere il campione vivo ed è quindi il più importante in biologia. Per questa osservazione la colorazione e la fissazione non sono necessarie. Per ottenere ciò, il campione viene colpito da raggi luminosi ritardati (che attraversano le strutture cellulari) e diretti, si ottiene così uno sfasamento delle lunghezze d’onda che crea zone di ombra e il campione appare colorato con una scala di grigi. In questo caso si crea un contrasto naturale.

Il microscopio in campo scuro e quello in contrasto di fase permettono di osservare campioni non facilmente colorabili oppure campioni freschi e quindi vivi, permettendo di avere un’osservazione immediata, un apprezzamento della mobilità dei batteri e della loro crescita.

• Microscopio a fluorescenza: si usano delle sostanze fluorescenti dette fluorocromi, che assorbono la luce a una certa lunghezza d’onda e la rimandano fuori ad una lunghezza d’onda superiore. In questo modo appaiono i colori e non servono coloranti (pigmenti) per questo tipo di osservazione. Si possono usare più fluorocromi contemporaneamente e ognuno marca una struttura specifica. Alcuni di essi sono:

• Fluoresceina (gialla-verde): Marcano strutture specifiche e si legano ad esse perché vengono legati ad anticorpi che riconoscono strutture specifiche, che sono le uniche a colorarsi.
• Rodamina (rossa)
• Dapi (blu): Colorano DNA e cromatina
• Acridina orange (arancione)
• Bromuro di etidio (rossa-arancione)

Il campione marcato con coloranti fluorescenti è visibile solo al buio e con la lampada a UV del microscopio accesa. Il microscopio a fluorescenza ha anche il contrasto di fase.

Microscopi elettronici

Preparazione dei campioni

1. Fissazione: essa è chimica, quindi non si possono vedere i campioni vivi. Si usa glutaraldeide o OsO₄
2. Inclusione: il campione è incluso in una sostanza solida, solitamente resina Epon o Araldite
3. Sezione: il corpo solido viene sezionato tramite il MICROTOMO con una lama di diamante. Avviene solo per l’osservazione al TEM
4. Colorazione: si fa con sali di metalli pesanti perché essi, avendo un alto numero atomico, fanno rimbalzare gli elettroni rendendo i bordi delle strutture più spessi e meglio visibili e creando quindi il contrasto. La colorazione è sempre in bianco e nero.

• TEM, microscopio elettronico a trasmissione: gli elettroni colpiscono il campione e quelli che non colpiscono una struttura biologica lasciano un’impronta sullo schermo sottostante (fluorescente e verdastro). Quelli che la colpiscono rimbalzano lasciando una zona d’ombra.
• SEM, microscopio elettronico a scansione: per questo tipo di microscopio non è necessario sezionare il campione. Esso è meno potente del TEM perché non permette di vedere le strutture interne. In questo tipo di microscopio, il campione è inclinato rispetto al fascio di elettroni e lo schermo è sempre fluorescente e verdastro.

Lez 3: Morfologia batterica

Molti microorganismi sono unicellulari, come i batteri, quindi la forma della cellula coincide con la forma dell’organismo, che è costante durante la sua vita. L’unica eccezione in cui una cellula batterica non mantiene sempre la sua forma è quando essa diventa una spora batterica (o endospora batterica), tale trasformazione permette alla cellula di assumere una forma che le conferisce maggiore resistenza per superare un momento con condizioni sfavorevoli.

I funghi e i protozoi possono assumere forme diverse a seconda dello stadio del ciclo vitale. In particolare i funghi possono essere monocellulari (lieviti) o pluricellulari (muffe, funghi fruttiferi), mentre i protozoi possono essere ambientali (hanno una forma circa costante) oppure patogeni (hanno un ciclo vitale complesso durante il quale la loro forma cambia e di conseguenza anche il nome).

Gli amnioceti sembrano muffe e non si capisce se sono unicellulari o organismi pluricellulari. Essi inoltre producono spore a scopo riproduttivo.

I batteri possono avere morfologie molto variegate e le più caratteristiche sono: cocco, bacillo, cocco bacillo, bacillo fusiforme, vibrione, spirillo (struttura rigida) e spirocheta (struttura flessibile). Gli ultimi due fanno dei movimenti su se stessi. Esistono anche cocchi e bacilli di interesse medico:

• Cocchi gram positivi: pneumococchi, streptococchi, stafilococchi
• Cocchi gram negativi: neisserie (meningococco, gonococco)
• Bacilli gram positivi: carbonchio (antrace)
• Bacilli gram negativi: salmonelle, peste, pertosse
• Bacilli acido-resistenti: micobatteri (tubercolosi, lebbra)