Microbiologia

Microbiologia

Studio di tutti gli organismi che sono impossibili da vedere a occhio nudo (virus, lieviti, funghi, alghe, protozoi, batteri, ecc.). La microbiologia è coinvolta in molte materie scientifiche e in molte applicazioni. L’essere visibile o no ad occhio nudo dipende dalle dimensioni. I microrganismi sono più piccoli di 1mm quindi non si vedono. I batteri, come escherichia coli, hanno dimensioni di 2nm. Questo è un organismo modello sul quale si studia e che è in grado di darci informazioni anche su altri microrganismi simili. I batteri possono avere tante forme (allungato, tondo, ecc.).

Una cellula procariotica è molto più grande, anche 10 volte in più rispetto ad una procariotica. Infatti, nel citoplasma di un procariote non abbiamo tanti organuli cellulari. Quando abbiamo un organismo in micrometri (batterio) si usa un microscopio ottico, per i microrganismi in nanometri (virus) si deve utilizzare il microscopio elettronico. Poi ci sono anche eccezioni quindi posso avere un batterio più piccolo o un virus più grande.

Storia della microbiologia

Inizia con l'invenzione del microscopio. All'inizio si pensava che nei corpi inanimati ci fosse comunque una forza che potesse originare nuove forme di vita. Questa è la teoria del creazionismo e della generazione spontanea. Il padre della microbiologia moderna è Pasteur che studiava i batteri nell'industria alimentare. Lui dimostrò che la generazione spontanea non esiste.

Per fare questo lui si costruì una fiasca con un collo dotato di un’ansa in grado di catturare le particelle presenti nell'aria. Se la fiasca è in piedi non succede nulla ma se è orizzontale e viene a contatto con i microrganismi il liquido diventa torbido e a questo punto si intuisce che c'è stata una crescita.

Batteri

Sono ovunque ma non si vedono. Sulla Terra ce ne sono circa 5×10³⁰ e sono ubiquitari, cioè vivono ovunque. Infatti, sono diffusi in ogni ecosistema, anche in quelli più estremi perché riescono a vivere in condizioni estreme (temperature maggiori di 80°C o minori di 0°C) in quanto metabolicamente versatili.

Nel corpo umano ci sono un sacco di batteri. Noi abbiamo 25000 geni e 2500000 geni batterici. Per studiarli bisogna osservarli, coltivarli in laboratorio in colture liquide o solide (fattibile solo per non per l’1% di batteri in quanto in laboratorio non è possibile ricreare le condizioni favorevoli allo sviluppo di tutti i batteri) oppure sequenziare il loro DNA attraverso la decodificazione.

La cellula batterica

La cellula batterica è una cellula procariote, piccola e aploide. Può essere di bacteria o archea (via di mezzo tra una cellula eucariote e procariote). Essa comprende:

• Parete cellulare
• Membrana citoplasmatica
• Nucleoide (non c'è una membrana nucleare quindi il nucleo è addensato al centro della cellula e immerso nel citoplasma. Qui avviene la trascrizione dei geni in modo che possano essere espressi)
• Citoplasma (luogo dove avviene la sintesi proteica)
• Plasmidi (elementi genetici extra cromosomici, cioè fuori dal cromosoma)
• Ribosomi (elementi del citoplasma)

All'interno della cellula batterica non troviamo organuli e il nucleo non è delimitato da una membrana. Le similitudini con una cellula eucariote si trovano nella membrana. I batteri sono caratterizzati da una parete, ovvero quella struttura che riveste la cellula al di fuori della membrana citoplasmatica. In alcuni casi particolari possono presentare un rivestimento esterno, ovvero la capsula. Anche le cellule eucariote possono presentare una parete cellulare. Questa parete conferisce rigidità alla cellula e ne mantiene la forma.

Caratteristiche cellulari

La forma della cellula è “mantenuta” dalla parete cellulare, ma è “determinata” da proteine che presentano similarità con le proteine del citoscheletro eucariotico. Le cellule batteriche sono dotate di una diversità molto simile a quella degli insetti, sono tantissime. Tutte le cellule batteriche si possono evolvere, cioè acquisire proprietà e caratteristiche nuove, e si possono riprodurre formando nuove cellule. Alla base di questo c'è la variabilità genetica.

Hanno anche un metabolismo poiché sono in grado di assumere nutrienti che poi vengono trasformati ed espulsi sotto forma di rifiuti. Il metabolismo gli permette anche di crescere e produrre una progenie, cioè aumentare il numero di cellule. Alcune cellule invece si possono differenziare e formare nuove strutture (come una spora), possono comunicare tra loro e si possono scambiare materiale genetico e sono dotate di motilità cellulare (flagelli, pili, ecc.). Un'altra caratteristica è la germinazione che dà origine ad una nuova cellula batterica quando le condizioni sono favorevoli.

Impatto sulla salute

I microrganismi hanno un impatto sulla nostra salute. Infatti, nel 1900 si moriva molto per malattie infettive che oggi hanno un impatto molto inferiore rispetto ad altre come problemi cardiaci o tumori (cancro). Le malattie infettive sono “scomparse” grazie alla presenza di cure, vaccini e condizioni igieniche migliori. Le malattie patogene più frequenti erano polmonite, cistite, carie, meningite, ulcera, ecc. I batteri che generano un'infezione si chiamano patogeni e sono tantissimi. Questi batteri sono un'eccezione rispetto ad altri perché non tutti causano infezioni.

Batteri benefici

I batteri che presentano dei benefici, come per esempio, gli azoto fissatori, sono la maggioranza. Nell'uomo i microrganismi sono anche d'aiuto perché svolgono delle funzioni importanti come aiutare la digestione. Sono utili anche nella produzione di cibo (formaggi e yogurt) e nel mantenimento degli alimenti (aceto). Vengono usati nei processi di biorisanamento ambientale perché trasformano sostanze tossiche per l'ambiente in sostanze non tossiche per loro.

Crescita e identificazione

In ambiente naturale i batteri vivono in colonie e per identificare una specie di batteri è fondamentale avere dei terreni solidi. Per ottenere una coltura pura si deve prelevare una colonia e si deve isolare. L’invenzione dei terreni solidi stata fatta da Robert Koch nel 1881, dove fu aggiunto un agente solidificante, quale la gelatina, anche se essa presenta delle criticità, ad un terreno solido. Infatti, si arrivò all’aggiunta dell’agar-agar, agente solidificante proveniente da un’alga, dove la stessa non viene metabolizzata dai batteri in coltura.

Per sviluppare una determinata colonia di batteri vi è bisogno di un terreno selettivo che seleziona solo certi batteri in modo che crescano solo quelli. Se si vuole far crescere tutti microrganismi ma in maniera tale che appaiono in maniera diversa l’uno dall’altro si deve far uso del terreno differenziale. C'è anche la tecnica delle culture di arricchimento nelle quali si va ad aumentare la popolazione batterica.

Colorazione di Gram

Per lo studio delle cellule batteriche in campo chiaro, le stesse devono essere colorate. Quando si studiano i batteri, si usa la colorazione di Gram. Queste colorazioni mettono in risalto le differenze strutturali della parete batterica e quindi si ha che fare con una colorazione differenziale. Le cellule batteriche si possono dividere in due gruppi presentando differenze a livello della composizione della parete cellulare batterica. Alcuni presentano uno spesso rivestimento di un eteropolimero che si chiama peptidoglicano, formato da una parete zuccherina, ovvero l’unità di base, che si avvolge attorno alla cellula creando uno spessore. Questi tipi di batteri vengono chiamati Gram positivi. L’altro gruppo, ovvero i Gram negativi, hanno una parete con una seconda membrana esterna, e tra le due membrane vi è uno strato simile al citoplasma chiamato periplasma, dove si trova il peptidoglicano compattato in uno strato più piccolo.

Il processo di Gram prevede due tappe per la colorazione:

1. Colorazione del campione con colorante blu, esso penetra all’interno delle cellule. Subito dopo vi è la fissazione e poi si procede con la decolorazione con alcool. L’uso della decolorazione fa sì che lo strato di peptidoglicano si compatti, e quindi dove vi è una maggior concentrazione di questo elemento il colorante non riesce ad uscire al di fuori e quindi fa sì che le cellule rimangano colorate. Al contrario, dove vi è una minor concentrazione, il colorante fuoriesce e le cellule diventano neutre.
2. Si esegue una contro colorazione con rosso sulle cellule decolorate e alla fine si ottiene che le cellule Gram positive sono rosse e le negative sono blu.

La cellula procariote

Come già detto, all’interno non vi è la presenta di una compartimentazione, il nucleoide presente è deputato alla replicazione, in questa tipologia di cellula la trascrizione e la traduzione sono quasi simultanei. I batteri prendono il nome a seconda di qual è la loro forma, e, qualsiasi sia la loro tipologia, si dividono per scissione. Quando si ha la divisione, una proteina (Ftsz) polimerizza al centro della cellula e segna la rotazione e la posizione della scissione.

Per i batteri la forma sferica è la più vantaggiosa, poiché la sfera ha il miglior rapporto superficie/volume, tutto questo quando le dimensioni sono molto piccole. Questa cellula deve poter interagire con l’ambiente in tutte le sue funzioni e normalmente più è piccola e più sarà efficiente. La sua maggior velocità ha un riflesso positivo sul suo metabolismo e quindi donerà al batterio una maggior velocità di crescita.

La membrana citoplasmatica

La membrana è formata da un doppio strato lipidico, ovvero acidi grassi legati ad un glicerolo fosfato che è legato a sua volta ad una molecola polare carica positivamente. Essendo formata da acidi grassi essi sono formati da:

• Saturi: servono a mantenere la fluidità di membrana con temperature alte.
• Insaturi: servono a mantenere la fluidità di membrana con temperature basse.

La percentuale di composizione varia a seconda della temperatura alla quale gli organismi vivono. Le proteine possono essere canali, attraversare il doppio strato fosfolipidico (proteine integrali), avete una parte verso dentro o fuori oppure essere solo sulla superficie (proteine periferiche). Le molecole che conferiscono rigidità sono molecole come il colesterolo che stabilizza il mosaico fluido. Nei batteri le membrane non hanno il colesterolo, tranne qualche eccezione.

Gli archea hanno catene isopreniche con due molecole di glicerolo polari che rendono la loro membrana meno fluida. Le catene possono avere anche delle parti cicliche formando anelli che svolgono la stessa funzione degli steroidi stabilizzando la membrana citoplasmatica. Una molecola per entrare nella cellula deve attraversare la membrana. Il 70/80% di tutte le proteine sono le proteine integrali. Permettono l’ingrasso di nutrienti, l’eliminazione di sostanze di rifiuto, recepire i messaggi provenienti dall’esterno e tante altre cose. Alle proteine arrivano dei segnali che permettono alla cellula di attivare meccanismi o reagire ad essi. Le proteine integrali si possono spostare lateralmente all’interno del mosaico fluido ma non si possono spostare da uno strato all’altro.

Funzioni della membrana citoplasmatica

1. Sito di ancoraggio per proteine essenziali come quelle di trasporto, trasduzione del segnale, ecc...
2. Barriera selettivamente permeabile, riesce a mantenere all’interno i vari componenti. È molto poco permeabile alla maggior parte delle molecole. Però la cellula ha bisogno di molecole che non riescono ad entrare quindi ci sono dei sistemi di trasporto rappresentati da proteine. Il trasporto può essere attivo o passivo. Il passivo utilizza la differenza di concentrazione (la molecola si muove secondo il proprio gradiente di concentrazione). Il trasporto attivo utilizza energia che può essere rappresentata dall’ATP.
3. Conservazione e produzione di energia conservata grazie alla presenza di un gradiente (differenza di concentrazione) protonico transmembrana che si forma durante la respirazione cellulare (fosforilazione ossidativa) o prodotto grazie alla degradazione di ATP. È un gradiente elettrochimico. Vengono pompati all’esterno ioni H⁺. Quando si dissipa il gradiente (gli ioni entrano) si produce energia grazie all’ATP sintetasi. Questo gradiente viene conservato nei mitocondri e con la teoria endosimbiotica (teoria che ipotizza che le cellule eucariotiche siano nate da una cellula ancestrale che ha inglobato una cellula procariotica, che poi è rimasta in simbiosi, differenziandosi nei mitocondri. Per quanto riguarda le cellule vegetali, si pensa che essi abbiano acquisito i cloroplasti incorporando organismi procariotici fotosintetici, come i cianobatteri).

La presenza di sistemi di trasporto viene dimostrata sperimentalmente: La molecola che deve essere trasportata dipende dalla presenza di trasportatori che possono essere più o meno specifici per la molecola.

Trasporto di molecole

Se le molecole entrano per diffusione semplice, la velocità d’ingresso della molecola aumenta gradualmente. La velocità dipende dalla permeabilità e dalla differenza di concentrazione. La permeabilità dipende dal coefficiente di diffusione (D), dal coefficiente di partizione lipide/acqua (K). Area di membrana attraversata (A) e spessore della membrana (x). La diffusione è un trasporto passivo perché non richiede energia dato che va secondo gradiente. La diffusione può essere semplice (attraverso la membrana) o facilitata con un trasportatore che cambia la propria forma quando viene a contatto con la molecola che deve attraversare la membrana. Può avvenire in tutti i punti della membrana. Esistono delle acquaporine che permettono il passaggio di H₂O. La diffusione facilitata è un uniporto.

Il trasporto attivo consuma energia che può essere data dalla dissipazione del gradiente elettrochimico o al consumo di ATP. Viene utilizzato per il trasporto di molecole di dimensioni non grandi e molto importanti. Può essere un sistema di simporto o antiporto (una entra secondo gradiente e una esce contro gradiente o viceversa).

Ci sono anche i sistemi proteici ABC (ATP binding...). Ci sono tre proteine: una fuori dalla cellula esterna che lega il substrato da legare, il trasportatore e una dentro la cellula che scinde (idrolizza) ATP in ADP. Quest’ultima è all’interno della cellula perché l’ATP è solo all’interno della membrana plasmatica. Questo trasporto è utilizzato generalmente per aminoacidi “rari” (come l’istidina).

Un altro meccanismo viene chiamato traslocazione di gruppo nel quale sono coinvolte un sacco di proteine. Questo meccanismo nei batteri generalmente trasporta glucosio (zucchero). Nell’escherichia coli è stato studiato con il trasporto di glucosio. La sostanza (substrato) viene modificata chimicamente durante l’attraversamento della membrana (viene immediatamente fosforilato in Glucosio 6-P ottenendo un guadagno energetico). Così è pronto per le varie vie cataboliche e gli impedisce di uscire dalla membrana visto che è carico.

Il fosfoenolpiruvato (PE-P) si trasforma in piruvato. La catena è composta da componenti non specifici perché comuni a più enzimi. Poi ci sono due componenti specifici per ciascuno zucchero che deve essere trasportato.

La parete cellulare

È importantissima perché è quella caratteristica che rende diversi i procarioti dagli eucarioti. Avvolge la cellula batterica dalla parte esterna, è esterna rispetto alla membrana citoplasmatica. Negli unicellulari è fondamentale perché è come un esoscheletro che gli dà forma e li protegge. Distingue i Gram-positivi dai Gram-negativi. È formata principalmente dal peptidoglicano che è un eteropolimero complesso formato da una parte di zuccheri e una di aminoacidi. Il peptidoglicano è chiamato anche sacculo di moreina.

Se la cellula non ha la parete si chiama protoplasto e si ottiene solo sperimentalmente. Il ruolo della parete è stato dimostrato con degli esperimenti. La cellula, se messa in un ambiente ipotonico con all’interno il lisozima, ha la parete cellulare che si rompe e la cellula va poi in contro a lisi, dovuta all’ingresso di H₂O. Se lo stesso esperimento viene ripetuto in un ambiente isotonico, la cellula non va in contro a lisi ma diventa un protoplasto.

Ci sono due tipi di pareti che dividono i batteri in Gram-positivi e Gram-negativi. La colorazione mette in evidenza le differenze strutturali della cellula. Nei Gram-negativi la parete è formata da periplasma con al centro uno strato di peptidoglicano. Attorno al periplasma c’è la membrana esterna. Nei Gram-positivi c’è uno strato di peptidoglicano separato dalla membrana citoplasmatica.

Peptidoglicano

Eteropolimero complesso la cui unità di base (monomero) è il glican tetrapeptide. Contiene un gruppo di natura glucidica (glican) e un gruppo di natura proteica (peptide). Al glucosio, dal quale deriva la parte glucidica, è legato un gruppo N-acetile formando l’N-acetilglucosamina (G) al quale, tramite un legame beta (1,4), è legato l’Acido N-acetilmuramico (M). Questo ha legato l’Acido D-lattico che fa da ponte per legare il tetrapeptide formato da L-Alanina, Acido D-glutamico, l’Acido mesodiamino-pimelico e D-Alanina, cioè aminoacidi. Il tetrapeptide resiste alle proteasi dell’ospite. I monomeri vanno a formare i polimeri e i legami coinvolgono entrambe le parti che compongono il peptidoglicano. La struttura finale è quella di una maglia. Gli aminoacidi in forma D resistono agli attacchi enzimatici.