Microbiologia

Camilla Mancassola microbiologia

Introduzione alla microbiologia

La microbiologia è la scienza che studia i microrganismi (organismi microscopici quali procarioti, eucarioti oltre che elementi non cellulari come i virus) e le loro attività in relazione all’ambiente in cui essi vivono. Comprende lo studio della loro distribuzione in natura, delle relazioni tra loro e con gli altri esseri viventi, degli effetti benefici e dannosi che hanno sugli esseri umani, delle modificazioni fisiche e chimiche che provocano nel loro ambiente. Si tratta di una materia che ne racchiude molte altre: biologia cellulare, biochimica, genetica, biologia molecolare, ecologia ecc.

Aree applicative della microbiologia

Possiamo avere diverse aree applicative: microbiologia medica che si occupa principalmente dello studio delle infezioni umane, l’ecologia microbica che studia le fluttuazioni delle popolazioni microbiche sia nell’ambiente che su organismi viventi, microbiologia agraria legata a processi industriali e tante altre.

La maggior parte delle conoscenze sul mondo microbico risalgono a circa 60 anni fa, ma la storia della microbiologia risale all’antichità (consumo di funghi eduli, produzione di alimenti e bevande, tecniche di conservazione degli alimenti, misure di contenimento del contagio).

Eventi storici in microbiologia

• 1676 a.C. – Anton van Leeuwenhoek descrive protozoi e batteri.
• Fin dall’antichità si credeva in una forma di generazione spontanea secondo cui gli organismi viventi si sarebbero sviluppati dalla materia in decomposizione. Si ipotizzava una vis vitalis (forza vitale) responsabile di questi fenomeni.
• 1668 – Francesco Redi (medico) confuta la teoria della generazione spontanea con un esperimento con la carne e le mosche.
• 1775 – Spallanzani. Un’ampolla contenente brodo viene lasciata all’aria; dopo un certo periodo di tempo il brodo diventa torbido per la crescita di microrganismi; l’ampolla contenente brodo di carne fatta bollire per un certo periodo di tempo, se non sigillata permette nuovamente la crescita dei microrganismi, se viene sigillata ermeticamente rimane incontaminata.
• 1796 – Edward Jenner. Immunizzazione dell’uomo contro il vaiolo. Individui che vivevano in contatto con le mucche sviluppavano pustole simili a quelle del vaiolo (vaiolo vaccino, non fatale per l’uomo) e garantiva immunità anche per il vaiolo umano. Inoculò un bambino di 9 anni con materiale prelevato da pustole di una mucca ammalata di vaiolo vaccino: il bambino manifestò le pustole del vaiolo vaccino. Inoculando nuovamente il bambino con materiale prelevato da un malato di vaiolo umano il bambino non si ammalò: aveva acquisito immunità.
• 1854 – Il dibattito sulla generazione spontanea si chiuse con l’esperimento di Pasteur effettuato in matracci a collo di cigno che permettono il passaggio di aria ma non di microrganismi.
• 1870 – Ferdinand Cohn. Scoprì che alcuni batteri possono formare dei corpi resistenti al calore (endospore). Effettuò una prima classificazione dei batteri in base alla forma: fu il primo ad introdurre il nome Bacillus.
• 1872 / 1882 – Robert Koch. Fondò la moderna batteriologia clinica. Per la prima volta isolò un microrganismo agente eziologico di malattia (Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis). Nel 1882 isola il e enuncia i suoi postulati finalizzati a provare che un determinato microrganismo è responsabile di una determinata malattia.

I postulati di Koch

• Il microrganismo deve essere presente in tutti gli individui affetti da una malattia infettiva e deve essere assente negli individui sani.
• Il microrganismo deve essere isolato dall’individuo affetto e, posto in coltura, deve dare origine ad una popolazione cellulare omogenea.
• L’inoculo di una coltura pura del microrganismo in individui sani può causare la comparsa della malattia di cui è ritenuto responsabile.
• Il microrganismo deve essere reisolato dall’organismo infettato sperimentalmente in cui la malattia sia insorta per dimostrare che sia effettivamente l’agente causale.

I postulati di Koch molecolari

• Il gene implicato nella patogenicità o virulenza deve trovarsi in tutti i ceppi patogeni di una data specie ed essere assente nelle specie non patogene.
• L’inattivazione selettiva del gene deve portare ad una diminuzione misurabile della patogenicità o virulenza.
• La complementazione o reversione della mutazione deve ripristinare il livello originario di patogenicità o virulenza. Parimenti l’introduzione del gene in un ceppo non patogeno lo trasforma in patogeno.

1881 – Walter Hesse. Frequentò i laboratori di Koch come assistente. I batteri erano coltivati su terreni nutritizi solidificati con gelatina che, tuttavia, si scioglieva a causa del caldo estivo. Walther Hesse domandò alla moglie come mai le sue gelatine di frutta rimanessero intatte al calore. La moglie spiegò a Hesse l’utilizzo dell’agar-agar (polisaccaride complesso estratto da delle alghe) come agente solidificante: non è tossico, si scioglie a 100°C e solidifica a 45°C. Nello stesso laboratorio lavorava Julius Petri che introdusse l’uso delle piastre Petri.

1884 – Christian Gram. Sviluppa la colorazione differenziale di Gram e classifica i microrganismi in Gram positivi e Gram negativi a seconda della struttura di parete. Inizialmente venne utilizzata per distinguere due agenti eziologici di polmonite: gli pneumococchi (Gram+) e la Klebsiella (Gram-). Il primo passaggio è la fissazione: il vetrino viene esposto al calore, i batteri si disidratano e si fissano alla piastra. Poi i vetrini vengono cosparsi di cristal violetto, si lasciano riposare per un minuto poi si scolano e si sciacqua in acqua. Il vetrino viene posto in una soluzione iodurata (mordenzante cioè una sostanza che fissa ad una particolare struttura cellulare un colorante; iodoioduro di potassio che fissa il colorante ai peptidoglicani della parete del batterio). Si può osservare una decolorazione; dopodiché si lavorano i vetrini con safranina (una sostanza colorante artificiale). I Gram positivi rimangono viola mentre i Gram negativi si decolorano completamente perché hanno uno strato lipidico esterno.

1929 – Alexander Fleming. Scoperta della penicillina. Durante uno studio di ceppi diversi di stafilococchi fu osservato che, in piastre esposte all’aria contaminate, si era sviluppato un fungo del genere Penicillium. Quest’ultimo aveva inibito la crescita dei batteri. Dopo una serie di approfondimenti si è determinato che vi era una sostanza, la penicillina, in grado di uccidere i batteri e tra il 1940-1945 si comprese la sua utilità nell’utilizzo come antibiotico. Dagli anni ’50 c’è stato uno sviluppo costante nel campo della microbiologia. Viene coniato il termine di biologia molecolare. Nel 1941 Beadle e Tatum sviluppano l’ipotesi “un gene una proteina”. Nel 1944 Waksman scopre la streptomicina, efficace contro la TB. Nel 1953 Watson e Crick descrivono la struttura della doppia elica del DNA e nel 1962 ricevono il premio Nobel per la fisiologia e la medicina. Rosalind Franklin per prima aveva fotografato la doppia elica del DNA usando i raggi X. La fotografia 51 del DNA venne rubata dal laboratorio della Franklin dagli stessi Watson e Crick. Nel 1973 Bruce Ames mette a punto un test per identificare sostanze cancerogene o mutagene. Nel 1977 viene riportata la produzione della prima proteina umana in un batterio: la somatostatina.

Nel 1978 viene inserito il gene dell’insulina umana in E. Coli e nel 1980 viene brevettato un microrganismo in grado di degradare il petrolio. Infine, nel 1983 Kary Mullis inventa la PCR (reazione polimerasica a catena) per l’amplificazione di bersagli di DNA. 1987 – Carl Woese. Utilizzando un marcatore molecolare a livello ribosomale è riuscito a discriminare organismi molto simili tra loro e a costruire un albero filogenetico dei microrganismi.

Perché studiare i microrganismi?

• Sono stati la prima forma di vita sulla terra;
• Costituiscono più del 50% della biomassa terrestre e sostanzialmente l’attività dei microrganismi determina tutti i cicli e gli eventi che possiamo osservare in natura (cicli biogeochimici);
• Gli organismi pluricellulari si sono evoluti dai microrganismi;
• Vengono utilizzati in biotecnologie, nei processi di produzione e di biorisanamento. Vi sono delle applicazioni in agricoltura, applicazioni di tipo ambientale energetico ad esempio nella produzione di biofuels (carburanti di derivazione biologica), nell’industria alimentare per la produzione di additivi o per la conservazione;
• Sono agenti patogeni (studio delle malattie infettive);
• Hanno creato la biosfera che ha consentito l’evoluzione degli organismi pluricellulari.

Struttura e funzione della cellula procariote

I microrganismi possono avere cellule procariote (Bacteria, Archea) ed eucariote (lieviti, muffe, alghe).

Caratteristiche in comune:

• Tutte le cellule hanno una membrana plasmatica che separa il citoplasma dall’ambiente esterno e regola il trasporto di sostanze nutrienti e di rifiuto;
• La composizione del citoplasma è simile;
• Entrambe possiedono ribosomi (anche se di diversa composizione e dimensione).

Caratteri distintivi della cellula procariote:

• Maggior semplicità strutturale e minori dimensioni delle cellule procariote;
• Assenza di organelli cellulari (mitocondri, reticolo endoplasmatico, complesso del Golgi, lisosomi, cloroplasti);
• Divisione cellulare per scissione binaria.

I Procarioti si differenziano in Bacteria e Archaea, che hanno la medesima struttura di base ma sono differenti riguardo alla parete batterica e in base al tipo di ambiente in cui vivono.

La morfologia batterica – le dimensioni

Le dimensioni standard di una cellula batterica si aggirano tra 0,2 e 2 micrometri. Aumentando le dimensioni il rapporto tra superficie e volume decresce. Le dimensioni influenzano il tasso del trasporto di nutrienti e rifiuti attraverso la cellula; piccole dimensioni garantiscono scambi più efficienti. Sono organismi molto semplici dalla fitness elevata, molto adattativi ed in grado di passare da un tipo di metabolismo all’altro in base alle condizioni ambientali.

Esempi:

• Epulopiscium fishelsoni: batterio Gram positivo di dimensioni 600x80 micrometri, isolato dall’intestino di un pesce tropicale (Acanthurus nigrofuscus, pesce chirurgo). È simbionte obbligato; non può essere coltivato in laboratorio ed è correlato filogeneticamente al genere Clostridium.
• Thiomargarita namibiensis: batterio Gram negativo di diametro fino a 750 micrometri, isolato dai fondali oceanici della Namibia. Si nutre di acido solfidrico.

La morfologia batterica – forma della cellula e piani di divisione

• Cocchi: forma cellulare rotonda;
• Bacilli: forma allungata a bastoncino;
• Coccobacilli: forma intermedia tra i cocchi e i bacilli;
• Vibrione: bacillo ricurvo;
• Spirilli: forma a bastoncino spiralata;
• Spirochete: forma a bastoncino spiralata più sottile e flessibile rispetto a spirilli;
• Batteri prostecati: dotati di peduncolo di adesione al substrato;
• Batteri filamentosi: formati da ife e micelio;
• Sarcina: ammassi cubici di otto o più individui.

Morfogenesi cellulare

Proteine simili a quelle del citoscheletro delle cellule eucariote regolano forma e dimensione delle cellule batteriche durante l’accrescimento:

• FtsZ (filamentous temperature sensitive Z) è una proteina simile alla tubulina. Si localizza in posizione mediana e coordina la formazione della nuova parete cellulare che separerà le due cellule (sia nei cocchi sia nei bastoncelli);
• MreB è una proteina simile all’actina, forma strutture elicoidali a livello della membrana plasmatica. Se inattivata comporta un progressivo aumento del diametro cellulare;
• CreS (crescentina, presente in Caulobacter crescentus) è responsabile della curvatura della cellula.

Rivestimento della cellula batterica

La cellula batterica è a vita libera perciò tutti gli scambi tra interno ed esterno avvengono a livello del rivestimento cellulare. La cellula procariote presenta complesse strutture di rivestimento che consentono al batterio di adattarsi a condizioni anche estreme. Tutte le cellule procariotiche hanno una membrana plasmatica. In generale i batteri presentano anche una parete che ha composizione e posizione diversa a seconda del gruppo microbico. Possono essere presenti altre strutture di rivestimento (strato S, capsula, glicocalice) e appendici di superficie (pili e flagelli).

Le caratteristiche della parete permettono di distinguere i Bacteria Gram positivi e Gram negativi. Nei Gram negativi abbiamo un doppio strato asimmetrico di membrana esterna che delimita internamente uno spazio chiamato periplasma e costituito da un sottile strato di peptidoglicano chiamato mureina. Nei Gram positivi la struttura prevalente è il peptidoglicano che va a formare uno strato molto spesso; addossata a questo strato troviamo la membrana plasmatica.

La membrana plasmatica ha le stesse caratteristiche sia in Gram positivi che in Gram negativi: un doppio strato fosfolipidico analogo a quello delle cellule eucariotiche. I fosfolipidi sono costituiti da una testa polare (molecola di D – glicerolo- 3- fosfato; al fosfato esterificato in C3 possono essere legati gruppi funzionali come fosfatidil etanolamina e fosfatidilserina), ed una coda apolare formata da due molecole di acidi grassi lineari esterificati al C1 e al C2 (in maggioranza saturi, con aggiustamenti dettati da variazioni ambientali). Le teste polari (idrofile) si dispongono verso l’esterno/interno dove si trova un ambiente acquoso mentre le code apolari (idrofobe) incrociate formano un doppio strato interno che non viene a contatto con l’ambiente acquoso.

Tipicamente nella membrana dei Bacteria sono assenti gli steroli (con eccezione dei metilotrofi) ma sono presenti opanoidi che contribuiscono a stabilizzare la struttura e a renderla meno flessibile. Negli Archaea non sono presenti opanoidi. Ad esempio, nella membrana di E. Coli sono presenti oltre 200 tipi di proteine: proteine integrali di membrana (anfipatiche), proteine periferiche e lipoproteine (esposte verso l’esterno in Gram positivi e verso il periplasma in Gram negativi).

Differenze tra Archaea e Bacteria

• La chiralità del glicerolo: si tratta di un L – glicerolo generato per esterificazione del fosfato sul C1;
• Il tipo di legame tra glicerolo e catena alifatica: si tratta di un legame etere negli Archaea e di un legame estere nei Bacteria;
• Il tipo di catena alifatica: negli Archaea troviamo delle catene isopreniche in cui gli atomi di carbonio formano dei doppi legami. Le catene laterali sono costituite da isoprenoidi il cui gruppo alcolico terminale è condensato all’L- glicerolo con legame etere in C2 e C3.

I lipidi degli Archaea possono essere dieteri (due catene alifatiche a 20 atomi di carbonio legate covalentemente al glicerolo) o tetraeteri (due catene alifatiche a 40 atomi di carbonio legate a due molecole di glicerolo) del glicerolo. Il monostrato lipidico che si forma in quest’ultima situazione garantisce maggior stabilità delle membrane e si trova frequentemente negli Archaea ipertermofili.

Funzioni della membrana plasmatica

• Barriera che regola la permeabilità: piccole molecole non cariche e idrofobiche possono passare attraverso la membrana mediante diffusione;
• Sito in cui sono collocate le proteine: regolano il trasporto, la generazione di energia, la chemiotassi e la trasduzione del segnale. In particolare, la trasduzione del segnale è regolata da proteine transmembrana che hanno domini extracellulari e domini citoplasmatici. Questi sistemi permettono di percepire stimoli esterni e modificare l’espressione genica conseguentemente;
• Produzione di energia e biosintesi di componenti cellulari: respirazione e fotosintesi avvengono a livello della membrana. In entrambi i processi viene generato un gradiente ionico transmembrana (forza proton motrice) utilizzata dalla cellula per sintetizzare ATP e per fornire energia a processi che la richiedono. A livello di membrana plasmatica avvengono anche la sintesi di fosfolipidi, di parti del peptidoglicano e del lipopolisaccaride.

Esternamente alla membrana plasmatica si trova una molecola polimerica (mureina o peptidoglicano) che avvolge la cellula e conferisce rigidità e forma. Il peptidoglicano è formato da catene glicaniche costituite da due amminozuccheri alternati, il NAG (N – acetil glucosammina) ed il NAM (acido N – acetil muramico). Al NAM è legato un tetrapeptide tramite il quale le catene glicaniche si connettono. Il NAM presenta un residuo di acido lattico legato con il legame etere al C3 del glucosio da cui si diparte il tetrapeptide. La composizione del tetrapeptide più frequentemente riscontrata è data da L -alanina, acido D- glutammico, acido mesodiaminopimelico (DAP) e D – alanina. Nei batteri Gram positivi il DAP è sostituito con una L – lisina. Nei Gram negativi il legame fra un...